Фаворская Елена Геннадьевна - Московский государственный
реклама
На правах рукописи ФАВОРСКАЯ ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОТИПОВ ГАПТОГЛОБИНА В СЛЕДАХ КРОВИ НА РАЗЛИЧНЫХ НОСИТЕЛЯХ, ПОДВЕРГШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ НЕКОТОРЫХ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ. 14.03.05 – Судебная медицина АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава» Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Новоселов Владимир Павлович Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор Эделев Николай Серафимович Сундуков Дмитрий Вадимович Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава» Защита состоится __ ___________________ 2011 года в ____ часов на заседании диссертационного совета ДМ 208.041.04 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: г. Москва, ул. Долгоруковская, д.4, строение 7 (помещение кафедры истории медицины). Почтовый адрес: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д.20/1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а). Автореферат разослан «___» ________________201 года. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Т.Ю. Хохлова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Одной из основных задач судебной медицины на современном этапе является быстрейшее внедрение в практику научных достижений, оказание всемерной помощи правоохранительным органам в профилактике и борьбе с определенными категориями преступлений, совершенных против личности человека и его здоровья. Cудебно-медицинское исследование крови человека и ее следов на вещественных доказательствах нередко имеет решающее значение при расследовании преступлений, в том числе таких тяжких, как убийство. При производстве судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств первое место занимают экспертизы, связанные с исследованием крови (Информационное письмо «О работе судебно-биологических отделений бюро СМЭ РФ» за 2004-2008 год) - около 70 % экспертиз. Несомненный интерес для судебно-медицинских экспертов представляет возможность использования в своей практике иммунологических, серологических, цитологических, хроматографических и электрофоретических методов исследования при решении целого ряда вопросов, возникающих как у работников правоохранительных органов, так и у самих экспертов в процессе работы с исследуемых материалом. Для исследования объектов биологического происхождения используются достижения современной медицины, биологии, иммунологии, генетики, химии (Барсегянц Л.О., 2004). Основной системой, применяемой для определения групповой принадлежности крови является система АВ0, однако, в ряде случаев, только одной этой системы бывает недостаточно. В этих случаях эксперт прибегает к исследованию иных систем, среди которых важное место занимает система гаптоглобина (Туманов А.К., 1975; Томилин В.В., Барсегянц Л.О., Гладких А.С., 1989). Исследование следов крови по системе гаптоглобина в судебно- медицинских целях достаточно широко применяется в нашей стране с начала 80-х годов прошлого века, этой проблеме были посвящены работы ряда авторов 3 (Николенко О.В., 1971; Свирский М.С., 1981; Алешо Н.А., 1988; Бураго Ю.И., 1998; Барсегянц Л.О., 1999). Сывороточный белок гаптоглобин (Нр), относится к α2-глобулинам сыворотки крови, его средняя концентрация в сыворотке крови составляет около 1 г/л, она подвержена значительным колебаниям, что связано с его генетически детерминированным фенотипом. Исследование системы гаптоглобина при производстве судебно- биологических экспертиз существенно повышает информационную значимость экспертных выводов. Определение фенотипов гаптоглобина в пятнах крови широко применяется при производстве экспертиз спорного отцовства, материнства, замены детей, при одногруппности проходящих по делу лиц по системе АВ0, сомнительных (нечетких) результатах при определении групповой принадлежности крови по системе АВ0, для борьбы с влиянием предметаносителя, при отсутствии контроля предмета-носителя, при работе со смешанными пятнами человека и животных, со смешанными пятнами крови человека и каких-либо выделений и т.д. При производстве судебно-биологических экспертиз в ряде случаев возникает необходимость исследования фенотипов гаптоглобина в образцах крови проходящих по уголовным делам лиц и в пятнах крови на вещественных доказательствах. Иногда выявление фенотипов гаптоглобина не представляет никаких затруднений, в других же случаях в практической деятельности возникают определенные трудности, связанные с отсутствием разгонки фракций гаптоглобина на фореграммах, не только в пятнах крови на вещественных доказательствах, но и в образцах крови проходящих по делу лиц. Это может быть связано как с условиями забора и хранения образцов крови и вещественных доказательствах, так и с различными сроками поступления вещественных доказательств в судебно-биологическое отделение. В ходе практической деятельности, особенно при малом количестве материала для исследования, в первую очередь решается вопрос о предпочтительном выборе системы для дифференцирования, который зависит от 4 состояния пятен крови, в частности: размеры, насыщенность пятна и т.д.. При этом выявление фенотипов гаптоглобина может зависеть не только от вида предмета-носителя, на котором находится пятно, но и от воздействия на него каких-либо физических или химических факторов. Однако, до настоящего времени, в доступной нам литературе мы не встретили работ о том, на каких предметах-носителях пятна крови следует исследовать по системе гаптоглобина в первую очередь, целесообразно ли брать для данного исследования вещественные доказательства, на которых имеются гнилостные изменения, или после длительного нахождения в различных условиях, например, при сокрытии следов преступления путем захоронения. Все это и послужило основанием для проведения исследования по установлению влияния на возможность определения фенотипов гаптоглобина в пятнах крови следующих факторов: вида предмета-носителя, сроков и условий хранения вещественных доказательств с пятнами крови, влияния некоторых конкретных факторов внешней среды, которым наиболее часто подвергаются вещественные доказательства до изъятия их следственными органами и поступления в судебно-биологическое отделение. Цель исследования: Оценить эффективность определения фенотипов гаптоглобина в следах крови человека на предметах-носителях в зависимости от характера условий окружающей среды и давности образования следов крови. Задачи исследования: 1. Оценить эффективность исследования системы гаптоглобина в пятнах крови, расположенных на бумаге, хлопчатобумажной, шерстяной и смесовой ткани, подвергшихся воздействию прямых солнечных лучей. 2. Оценить эффективность исследования системы гаптоглобина в пятнах крови, расположенных на бумаге, хлопчатобумажной, шерстяной и смесовой ткани, хранившихся во влажном состоянии и в почве в течение различных периодов времени. 5 3. Разработать рекомендации по применению результатов исследования для наиболее рационального использования системы гаптоглобина при проведении экспертизы вещественных доказательств и конкретизации вопроса о давности образования пятен крови. Научная новизна. Впервые установлена зависимость между возможностью определения фенотипов гаптоглобина, видом предмета-носителя, и сроком воздействия на вещественные доказательства факторов внешней среды и предложено использовать полученные результаты для установления давности образования пятен крови, что имеет существенное значение при производстве судебно-медицинских экспертиз. Практическая значимость. Результаты проведенной научно- исследовательской работы позволят наиболее рационально подходить к выбору системы гаптоглобина, как основной, так и дифференцирующей при производстве судебно-медицинских экспертиз следов крови на вещественных доказательствах. Наиболее рационально проводить отбор пятен крови на вещественных доказательствах для производства экспертиз, что позволит сократить время производства экспертиз и наиболее экономно подходить к расходованию исследуемого материала, необходимого для проведения исследований. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Вид предмета-носителя, на котором находится пятно крови, оказывает влияние на возможность определения фенотипов гаптоглобина при исследовании следов крови на вещественных доказательствах. 2. Факторы внешней среды, которым зачастую подвергаются вещественные доказательства, а также условия хранения вещественных доказательств оказывают существенное влияние на возможность определения фенотипов гаптоглобина при доказательствах, что исследовании следов крови на вещественных в ряде случаев может быть использовано для установления сроков образования кровяного пятна. 6 3. Установлены временные сроки определения фенотипов гаптоглобина в следах крови человека на предметах-носителях, позволяющие решать вопрос о давности образования следов крови. Апробация материалов диссертации проходила: на итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов Новосибирского государственного медицинского университета (2006, 2007, 2010 год); на Российском совещании судебно-медицинских экспертов судебно-биологических отделений (г. Новосибирск, 2006 год); на заседании совета межрегионального общественного объединения «Судебные медики Сибири» (г. Новосибирск, 2006 год; г. Томск, 2008 год). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 в ведущих рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований. Личный вклад автора заключается в самостоятельном заборе крови и нанесении ее на исследуемые виды предметов-носителей; подготовке и проведении электрофореза в вертикальных пластинах полиакриламидного геля; учете, фотографировании и анализе двухслойного результатов проведенных реакций. Внедрение результатов исследования в практику. Данные научного исследования используются в практической работе экспертами судебно- биологического отделения Новосибирского областного и Алтайского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы; внедрены в учебные процессы на кафедрах судебной медицины Новосибирского и Алтайского государственного медицинского университета. Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 124 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающей 168 источников, в том числе 72 зарубежных. Диссертация содержит 22 фотографии, 23 таблицы. 7 Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава» г. Новосибирск) по проблеме: «Изучение патофизиологических механизмов влияния света и других факторов экзогенной природы на организм» (№ государственной регистрации 01200959105). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. В первой главе представлен обзор литературы на тему: «Современное состояние вопроса по исследованию следов крови и сывороточной системы гаптоглобина, как объектов судебно-медицинской экспертизы». Эта глава состоит из трех частей, в первой из которых рассмотрена тема «Следы крови, как объект судебно-медицинского исследования, система гаптоглобина, как одно из перспективных направлений при исследовании следов крови»; во второй – «Действие различных физических и химических факторов на пятна крови»; в третьей – «Определение давности образования следов крови». Вторая глава «Материалы и методы исследования» также состоит из трех частей, в ней приводятся особенности и техника забора жидкой крови живых лиц для исследования по системе гаптоглобина, нанесение на изучаемые виды предметов-носителей; особенности и техника исследования образцов высушенной крови по системе гаптоглобина; особенности и техника исследования образцов жидкой крови по системе гаптоглобина. В первой части этой главы излагаются особенности и техника забора жидкой крови для исследования по системе гаптоглобина, нанесение на изучаемые виды предметов-носителей. Для проведения исследования у соматически здоровых добровольцев, лиц обоего пола, в возрасте от 18 до 55 лет, осуществляли забор крови из пальца и исследовали фенотипы гаптоглобина в жидком виде. В дальнейшем среди исследованных лиц отбирали группы с фенотипами гаптоглобина 2-1 и 2-2 (по двадцать человек) и десять человек с фенотипом 1-1, повторно производили забор крови из локтевой вены в количестве 10мл и 8 непосредственно после забора, до свертывания, без введения антикоагуляционных и консервирующих растворов, наносили на исследуемые виды носителей: фрагменты бумаги, хлопчатобумажной, шерстяной и смесовой ткани. Пятна высушивали на плоской горизонтальной не впитывающей поверхности в сухом, затемненном помещении при комнатной температуре в течение 4-6 часов. Из полученных фрагментов бумаги и тканей один фрагмент являлся опытным и подвергался воздействию изучаемых неблагоприятных факторов, а другой являлся контрольным и помещался для хранения в сухое помещение при комнатной температуре. Также в этой части представлены сводные таблицы количества образцов и пятен крови, проведенных исследований и общее количество исследованных пятен на каждый фактор внешней среды; количества исследованных образцов крови, проведенных исследований и пятен на каждом виде предмета-носителя. Таблица № 1. Сводная таблица количества образцов и пятен крови, проведенных исследований и общее количество исследованных пятен на каждый фактор внешней среды. № п/ п Наименование фактора внешней среды 1 2 1. Воздействие прямых солнечных лучей 2. Хранение во влажном состоянии 3. Хранение в земле 4. всего Количество исследованных образцов крови 3 50 Количество исследованных пятен крови 50 200 7 1400 50 200 9 1800 150 600 22 4400 4 200 9 Количество Общее проведен- количество ных исследоисследоваванных ний пятен 5 6 6 1200 Таблица № 2. Сводная таблица количества исследованных образцов крови, проведенных исследований и пятен на каждом виде предмета-носителя. № п/п Вид предметаносителя Количество исследованных образцов крови Количество проведенных исследований 1 1. 2 Хлопчатобумажна я ткань Смесовая ткань Шерстяная ткань Бумага Всего 4 50 5 22 Общее количество исследованных пятен 6 1100 50 50 50 200 22 22 22 22 1100 1100 1100 4400 2. 3. 4. 5. Во второй части второй главы описывается методика диагностики фенотипов гаптоглобина в пятнах крови методом электрофореза в вертикальных пластинах двухслойного полиакриламидного геля; приводится перечень необходимого оборудования. Диагностику фенотипов гаптоглобина осуществляли в камере для вертикального гель-электрофореза Е-90690 с применением источника питания, стабилизирующего постоянный ток по напряжению Е-835 производства фирмы «Consort», рассчитанной на 48 объектов исследования. Фотографирование фореграмм проводили при помощи прибора для бестеневой съемки «МФН – 2» цифровой фотокамерой «OLIMPUS CAMEDIA C770 ultra zoom». Для определения фенотипов гаптоглобина из исследуемых пятен цельной крови вырезали кусочки материала размером не более 1х1,5см. Пятна экстрагировали в течение 18-20 часов при комнатной температуре, в 10%-ный раствор сахарозы на электродном буфере, с добавлением 3-5 капель 1%-ного раствора трипсина. После экстрагирования исследуемые вытяжки подвергали очистке с использованием хлороформа и центрифугирования в течение 8 минут при скорости 8 000 об/мин. 10 Для электрофореза использовали двухслойный гель с рН 9,2, в котором нижний слой геля (8% концентрации), готовится по следующей прописи: 100 мг персульфата аммония (аммоний надсернокислый); 13,6 мл растрова «акрис», приготовленного из акриламида, бисакриламида и дистиллированной воды; 9,45 мл гелевого буфера с рН 9,15-9,25, приготовленного из триса, тэмеда, дистиллированной воды и концентрированной соляной кислоты; 20 мл дистиллированной воды. Все ингредиенты перемешивались и заливались между стеклянных пластин. Время полимеризации нижнего слоя геля 1-1,5часа. После этого приступали к приготовлению верхнего (4,5%) слоя геля, состоящего из 50 мг персульфата аммония, 1,5 мл раствора «акрис», 1,2 мл гелевого буфера и 6,0 мл дистиллированной воды. После этого верхний слой геля заливали между стеклянных пластин с нижним гелем, и при помощи гребенок формировали карманы. Время полимеризации 1час. После этого стеклянные пластины помещали в камеру для элекрофореза, камеру заполняли трис-глициновым электродным буфером с рН 8,3 (трис основной – 2,5 грамма, глицин – 14,1 граммов, дистиллированная вода - до пяти литров). После этого гребенки извлекали. Затем в сформированные карманы при помощи дозатора вводили подготовленные вышеописанным способом исследуемые вытяжки, прибор закрывали крышкой и подключали к источнику питания. Входной электрофорез проводили вначале при напряжении 100V в течение часа, затем при напряжении 250V еще 1 час. Дальнейший форез осуществляли при напряжении 300V в течение 2-2,5 часов. Электрофорез завершали после перемещения фронта гемоглобина на расстояние 5,0-5,5см от линии старта, и положение визуально различимой зоны альбумина в виде фракции коричневато-желтого цвета у нижнего края гелевой пластины. После этого буферный раствор сливали, прибор разбирали и гелевые пластины для окрашивания помещали в лоток, содержащий 200 мл раствора 10% уксусной кислоты с добавлением 70-80 мг бензидина, через 40 минут добавляли 11 20-25 капель пергидроля. Непосредственно после внесения пергидроля и перемешивания начинали учет результатов, который продолжали в течение часа. Фотографирование фореграмм проводили при помощи прибора для бестеневой съемки «МФН – 2» цифровой фотокамерой «OLIMPUS CAMEDIA C770 ultra zoom». В третьей части второй главы описана техника исследования образцов жидкой крови по системе гаптоглобинов. Исследование проводили методом электрофореза в вертикальных пластинах полиакриламидного геля (ПААГ), с использованием того же оборудования, что и для исследования образцов высушенной крови. Для определения фенотипов гаптоглобина в жидкой сыворотке крови живых лиц применяли однослойный 7% гель с рН 8,9, в состав которого входят: 100 мг персульфата аммония (аммоний надсернокислый), 23 мл раствора «акрис», трисHCl и 65мл дистиллированной воды. Длительность полимеризации – 1час. Сыворотку крови в объеме 80 мкл помещали в пробирки, добавляли к ней 20 мкл 60% раствора сахарозы и 10 мкл гемоглобина. Смесь тщательно перемешивали и вносили в «карманы» геля. «Входной» электрофорез проводили при силе тока 120 мА, напряжении 140 V. Дальнейший электрофорез осуществляли в течение 2,53часов при силе тока 300 мА и напряжении 350 V. Окраску гелевых пластин проводили раствором бензидина в 250 мл 10% раствора уксусной кислоты, с добавлением 20 капель пергидроля в течение 40-45 минут. В третьей главе представлены собственные исследования по определению фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на предметах- носителях, подвергшихся воздействию прямых солнечных лучей. Для этого изымали образцы крови от 50 живых лиц, с заведомо известными фенотипами гаптоглобина, которые наносили на следующие предметы-носители: бумага, хлопчатобумажная, шерстяная, смесовая ткань. Образцы высушивали при комнатной температуре, и исследовали с целью определения фенотипов гаптоглобина в неизмененном виде. При этом во всех образцах фенотип гаптоглобина определялся беспрепятственно. 12 Затем носители с пятнами крови помещали на открытую солнечную площадку в жаркий летний период на весь световой день (температура от +25 до +30 градусов). Вечером каждого дня из каждого из пятен крови вырезали фрагмент ткани (сектор от центра пятна к периферии) размером 1х1,5см, который измельчали ножницами, заливали 15% раствором сахарозы на электродном буфере с добавлением 5 капель 1% раствора трипсина. На следующий день во всех образцах определяли фенотип гаптоглобина. После одного дня нахождения следов крови на открытой солнечной площадке в летний период во всех исследованных пятнах лишь незначительно снизилась интенсивность фракций гаптоглобина. Диагностика фенотипов гаптоглобина не вызвала каких-либо затруднений. После двух дней исследования во всех пятнах снизилась интенсивность фракций гаптоглобина. Однако, во всех пятнах, расположенных на бумаге и шерстяной ткани, и почти во всех пятнах на хлопчатобумажной ткани фенотип был установлен. Наибольшие затруднения в диагностике фенотипов Нр вызвали пятна, расположенные на смесовой ткани - в 30% случаев на этом носителе не наблюдали разгонки фракций гаптоглобина, следовательно, не удалось определить его фенотип. Кроме того, не удалось определить фенотип гаптоглобина в 10% на хлопчатобумажной ткани. После трех дней нахождения пятен крови под воздействием прямых солнечных лучей, картина фореграмм значительно изменилась: удалось определить фенотип гаптоглобина лишь в единичных пятнах: 28% на бумаге, и 10% расположенных на хлопчатобумажной ткани. В остальных исследованных пятнах разгонки фракций гаптоглобина на фореграммах получено не было. После четырех дней нахождения на открытой солнечной площадке в летний период ни в одном из исследованных пятен разгонки фракций гаптоглобина получено не было. При определении фенотипов гаптоглобина в контрольной группе образцов во всех пятнах исследование фенотипов гаптоглобина затруднений не вызвало. 13 В четвертой главе представлены результаты собственных исследований автора о воздействии, которое оказывает хранение предметов-носителей с пятнами крови во влажном состоянии на возможность определения фенотипов гаптоглобина в следах крови. Для этого изымали образцы крови от 50 живых лиц, с заведомо известными фенотипами гаптоглобина, которые наносили на следующие предметы-носители: бумага, хлопчатобумажная, шерстяная, смесовая ткань. Образцы высушивали при комнатной температуре, и исследовали с целью определения фенотипов гаптоглобина в неизмененном виде. При этом во всех образцах фенотип гаптоглобина определялся беспрепятственно. Затем образцы помещали в чашки Петри, слегка смачивали проточной водой, и оставляли для хранения в прохладном помещении (температура от +15 до +20 градусов). Через определенные промежутки времени образцы извлекали, от каждого пятна крови отрезали кусочек ткани, расположенный сектором от центра к периферии размером 1х1,5см, и исследовали с целью определения фенотипа гаптоглобина. После одной недели хранения пятен во влажном состоянии во всех исследованных пятнах был диагностирован фенотип гаптоглобина. Однако, в отдельных пятнах интенсивность фракций была значительно снижена. Через две недели исследования на фореграммах не получено разгонки фракций в 10% наблюдений на смесовой и в 14% случаев на шерстяной ткани. Также отмечается значительное снижение интенсивности фракций гаптоглобина в следах на смесовой ткани. Во всех остальных пятнах особых затруднений определение фенотипа гаптоглобина не вызвало. Результаты исследования, полученные на 19-ый день: в 54% пятен расположенных на шерстяной ткани и в 42% на смесовой ткани разгонки фракций гаптоглобина не получено, в остальных пятнах на данных носителях интенсивность фракций значительно снижена, фракции слегка «размыты». В пятнах, расположенных на бумаге и хлопчатобумажной ткани определение фенотипа гаптоглобина особых затруднений не вызвало. 14 В начале четвертой недели исследования на фореграммах наблюдали следующее: фракции гаптоглобина определяются практически во всех пятнах, расположенных на бумаге, не удалось выявить фракции гаптоглобина лишь в 8% случаев на данном виде носителя. Ни в одном из пятен, расположенных на хлопчатобумажной, шерстяной и смесовой ткани разгонки фракций гаптоглобина не получено. В конце четвертой недели исследования (26-ый день) ни в одном из исследованных пятен разгонки фракций гаптоглобина на фореграммах получено не было. На следующий день было проведено исследование контрольной группы образцов. При этом во всех пятнах фракции гаптоглобина определись беспрепятственно. В пятой главе представлены результаты собственных исследований автора о воздействии, которое оказывает хранение предметов-носителей с пятнами крови в земле на возможность определения фенотипов гаптоглобина в следах крови. Для этого образцы помещали в почву (чернозем, так как именно этот вид почвы наиболее распространен на территории Новосибирской области), на глубину около 20см, и оставляли в темном прохладном помещении (температура от +10 до +15 градусов). На фореграммах, полученных в течение первых восьми недель от начала исследования определение фенотипов гаптоглобина затруднений не вызвало. Через девять недель на фореграммах наблюдали следующее: интенсивность фракций гаптоглобина снижена, но в большинстве пятен диагностика фенотипов не представила затруднений. Не удалось определить фенотип гаптоглобина в 10% наблюдений на хлопчатобумажной ткани, и в 20% наблюдений на смесовой ткани. В дальнейшем исследование проводили через три месяца от начала исследования. При этом фореграммы незначительно отличаются от предыдущих: менее интенсивно окрашены фракции гаптоглобина, кроме того, еще в 14% наблюдений на смесовой ткани не удалось получить разгонки фракций. 15 В середине четвертого месяца исследования на фореграммах наблюдали следующее: интенсивность фракций была значительно снижена, в большей части исследуемых пятен разгонки фракций не было получено. Не удалось диагностировать фенотип гаптоглобина в 34% наблюдений на бумаге, в 38% наблюдений на хлопчатобумажной ткани, в 54% и 56% наблюдений на смесовой и шерстяной ткани. В конце 4-ого месяца количество пятен с положительным результатом значительно снизилось: удалось определить фенотип Нр лишь в 28% наблюдений на бумаге, в 14% случаев на хлопчатобумажной ткани, а также в 10% пятен крови на смесовой ткани и в 8% случаев на шерстяной ткани. На 20-ой неделе исследования ни в одном из исследованных пятен разгонки фракций гаптоглобина на фореграммах не удалось получить. При исследовании контрольной группы образцов наблюдали следующее: фракции гаптоглобина на фореграммах в большинстве пятен значительно снижены, но все же определяются. В большей части исследованных пятен крови на смесовой ткани, и в отдельных пятнах на бумаге, хлопчатобумажной и шерстяной ткани разгонки фракций гаптоглобина на фореграммах не получено. В шестой главе представлены данные по обсуждению полученных результатов, из которых следует, что условия хранения вещественных доказательств оказывают существенное влияние на возможность определения фенотипов гаптоглобина в высушенных пятнах крови. Также имеет значение и вид предмета-носителя, на котором расположено пятно. Значительное неблагоприятное воздействие оказывает попадание на пятна крови прямых солнечных лучей. После одного дня нахождения на открытой солнечной площадке в летний период во всех исследованных пятнах снизилась интенсивность фракций гаптоглобина. Однако, диагностика фенотипов гаптоглобина не вызвала каких-либо затруднений. После двух дней исследования во всех пятнах снизилась интенсивность фракций гаптоглобина. Но во всех пятнах, расположенных на бумаге и шерстяной ткани, и почти во всех пятнах на хлопчатобумажной ткани (за исключением 5 16 исследованных пятен - 10% исследований) фенотип был установлен. Наибольшие затруднения в диагностике фенотипов Нр вызвали пятна, расположенные на смесовой ткани - в 30% случаев на этом носителе не наблюдали разгонки фракций гаптоглобина, следовательно, не удалось определить его фенотип, причем большинство этих пятен принадлежат фенотипу 2-2. В пятнах фенотипа 2-1, расположенных на бумаге, хлопчатобумажной и шерстяной ткани разгонка фракций была получена (кроме одного пятна на хлопчатобумажной ткани); однако, в 25% пятен, расположенных на смесовой ткани, фенотип гаптоглобина определить не удалось. Практически во всех исследованных образцах фенотипа 11 на всех видах носителей (за исключением одного пятна на смесовой ткани) фракции гаптоглобина просматривались достаточно четко, диагностика затруднений не вызвала. После трех дней нахождения пятен крови под воздействием прямых солнечных лучей, картина фореграмм значительно изменилась - удалось определить фенотип гаптоглобина лишь в единичных пятнах: 28% на бумаге, и 10% расположенных на хлопчатобумажной ткани. Причем, среди пятен фенотипа 2-1 на бумаге с положительным результатом исследования 25% пятен; фенотипа 22 – 15%; фенотипа 1-1 – 60%. Среди пятен среди пятен фенотипа 2-1 на хлопчатобумажной ткани с положительным результатом исследования 15% пятен; фенотипа 1-1 – 20%; в пятнах фенотипа 2-2 на хлопчатобумажной ткани положительного результата не наблюдали. Ни в одном из пятен на смесовой и шерстяной ткани разгонки фракций гаптоглобина на фореграммах получено не было. После четырех дней нахождения на открытой солнечной площадке в летний период ни в одном из исследованных пятен разгонки фракций гаптоглобина получено не было. Также следует отметить, что за четыре дня исследования цвета пятен крови на данных носителях изменился с яркого краснобурого до коричневато-сероватого. Во всех образцах контрольной группы фенотип гаптоглобина определялся беспрепятственно. 17 Таким образом, воздействие прямых солнечных лучей (при температуре от +25 до +30 градусов) более двух дней оказало значительное влияние на возможность определения фенотипа гаптоглобина в пятнах крови, особенно на таком носителе, как смесовая ткань. Уже через два дня от начала исследования, возникли трудности по диагностике, интенсивность фракций значительно снизилась во всех исследованных пятнах, а в 30% пятен крови на смесовой ткани и в 10% пятен на хлопчатобумажной ткани фракции гаптоглобина вообще не определялись. На остальных носителях фракции определялись несколько лучше. После третьего дня от начала исследования, удалось диагностировать фенотип гаптоглобина лишь в 28% пятен на бумаге и 10% пятен на хлопчатобумажной ткани. Через четыре дня от начала исследования, ни в одном из исследованных пятен диагностировать фенотип гаптоглобина не удалось. Во всех контрольных образцах по истечении указанного срока определение фенотипа гаптоглобина каких-либо затруднений не вызвало. Хранение носителей с пятнами крови во влажном состоянии также оказало неблагоприятное воздействие на возможность определения фенотипов гаптоглобина в пятнах крови. В ходе проведения исследования было выявлено, что в течение первых двух недель во всех исследуемых образцах фракции гаптоглобина на фореграммах определялись без особых затруднений, несмотря на то, что появились признаки загнивания: резкий неприятный запах, участки плесени, изменение цвета пятен крови. Следует обратить внимание на то, что для исследования брались участи, наименее подверженные гнилостным изменениям. Через две недели исследования на фореграммах не получено разгонки фракций в 10% наблюдений на смесовой и в 14% случаев на шерстяной ткани, большая часть этих пятен принадлежат фенотипу 2-2, остальные пятна – фенотипу 2-1. Кроме того, была значительно снижена интенсивность фракций в части наблюдений на шерстяной ткани. Во всех остальных пятнах особых затруднений определение фенотипа гаптоглобина не вызвало. 18 При оценке результатов на 19-ый день: в 54% пятен на шерстяной ткани и в 42% пятен на смесовой ткани разгонки фракций гаптоглобина не было получено, в остальных пятнах на данных носителях интенсивность фракций снижена, фракции слегка «размыты», но все же определись. Из пятен на шерстяной и смесовой ткани наибольшее количество пятен с отрицательным результатом принадлежит фенотипу 2-2, а наименьшее – фенотипу 1-1. Фенотипу 2-1 из объектов, в которых не удалось диагностировать фенотип гаптоглобина, принадлежит 20% пятен, расположенных на шерстяной ткани и 16% пятен на смесовой ткани. В пятнах, расположенных на бумаге и хлопчатобумажной ткани, при диагностике фенотипов гаптоглобина возникли некоторые трудности, но в основном фракции определялись достаточно четко. В начале четвертой недели исследования на фореграммах наблюдали фракции гаптоглобина практически во всех пятнах, расположенных на бумаге, не удалось выявить фракции гаптоглобина в 8% случаев на данном виде носителя (одно пятно принадлежит фенотипу 2-1 и три пятна фенотипу 2-2). Ни в одном из пятен, расположенных на хлопчатобумажной, шерстяной и смесовой ткани разгонки фракций гаптоглобина не получено. В конце четвертой недели исследования ни в одном из исследуемых пятен разгонки фракций гаптоглобина получено не было. При исследовании образцов контрольной группы в конце четвертой недели исследования фенотип гаптоглобина на фореграммах определялся беспрепятственно. Таким образом, как следует из представленных данных, хранение вещественных доказательств во влажном состоянии более двух недель оказывает существенное влияние на возможность определения фенотипа гаптоглобина в пятнах крови, особенно на таких носителях, как смесовая и шерстяная ткань. Хранение вещественных доказательств во влажном состоянии более трех недель существенно снижает значимость исследования системы гаптоглобина в пятнах крови – удалось определить фракции гаптоглобина лишь на бумаге. После четырех недель хранения вещественных доказательств во влажном состоянии 19 исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови расположенных на бумаге, хлопчатобумажной, шерстяной и смесовой ткани нецелесообразно (в температурных условиях от +15 до +20 градусов). Хранение носителей с пятнами крови в земле оказало менее выраженное неблагоприятное воздействие на возможность определения фенотипов гаптоглобина в пятнах крови. На фореграммах, полученных в течение первых восьми недель от начала исследования, определение фенотипов гаптоглобина затруднений не вызвало. Через девять недель на фореграммах наблюдали снижение интенсивности фракций гаптоглобина, но в большинстве пятен диагностика фенотипов не представила затруднений. Не удалось определить фенотип гаптоглобина в 10% наблюдений на хлопчатобумажной ткани (5 пятен, из которых одно пятно фенотипа 2-1 и четыре пятна фенотипа 2-2) и в 20% наблюдений на смесовой ткани (10 пятен, из которых два пятна фенотипа 2-1, семь пятен фенотипа 2-2 и одно пятно фенотипа 1-1). В дальнейшем исследование проводили через три месяца от начала исследования. При этом фореграммы незначительно отличаются от предыдущих за счет менее интенсивно окрашенных фракций гаптоглобина. Кроме того, еще в 14% наблюдений на смесовой ткани не удалось получить разгонки фракций (еще по одному пятну фенотипов 2-1 и 1-1 и 5 пятен фенотипа 2-2). В середине четвертого месяца исследования, на фореграммах интенсивность фракций была значительно снижена, примерно в половине исследуемых пятен разгонки фракций не было получено. Не удалось диагностировать фенотип гаптоглобина в 34% наблюдений на бумаге, в 38% наблюдений на хлопчатобумажной ткани, в 54% и 56% наблюдений на каждом из остальных видах предметов-носителей, причем, как и во всех предыдущих случаях, наибольшее количество наблюдений с отрицательным результатом наблюдали в пятнах фенотипа 2-2, а наименьшее – в пятнах фенотипа 1-1. В конце 4-ого месяца количество пятен с положительным результатом значительно снизилось. Самое большое количество положительных результатов 20 наблюдали в пятнах крови на бумаге – 28%, среди пятен с фенотипом 2-1 с положительным результатом 30%, с фенотипом 2-2 – 20%, с фенотипом 1-1 – 40%. В пятнах на хлопчатобумажной ткани удалось определить фенотип гаптоглобина в 14% наблюдений, наибольшее количество пятен с положительным результатом пришлось на пятна с фенотипами 2-1 и 1-1 – по 20%, а наименьшее на пятна с фенотипом 2-2 – лишь 5% случаев. В пятнах на смесовой и шерстяной ткани фракции гаптоглобина выявлены лишь в 10% и 8% наблюдений, причем среди них не было ни одного пятна, принадлежащего фенотипу 2-2, а среди пятен с фенотипом 2-1 и 1-1 количество положительных наблюдений составило от 10% до 20%. На 20-ой неделе исследования ни в одном из исследованных пятен фенотип гаптоглобина определить не удалось. При исследовании образцов контрольной группы образцов на 20-ой неделе выявлено следующее: фракции гаптоглобина на фореграммах в большинстве пятен значительно снижены, но все же определяются. На бумаге фенотип гаптоглобина не удалось получить лишь в двух исследованных пятнах (4% исследований), оба эти пятна принадлежат фенотипу 2-2, на хлопчатобумажной ткани количество пятен с отрицательным результатом составило 3 (6% исследований), два из них принадлежат фенотипу 2-2 и одно – фенотипу 1-1. В пятнах на смесовой ткани положительный результат наблюдали в 28% случаев; причем, ни в одном из исследованных пятен крови фенотипа 2-2, расположенных на этом виде предмета-носителя не получили разгонки фракций гаптоглобина, среди пятен фенотипов 2-1 и 1-1 положительный результат наблюдали в 35% и 70% случаев. На шерстяной ткани положительный результат наблюдали в 88% случаев; в пятнах фенотипа 2-1 в части пятен интенсивность фракций была значительно снижена, но в проходящем свете фракции все же удалось выявить во всех исследованиях, в пятнах принадлежащих фенотипам 2-2 и 1-1 в 25% и 10% наблюдений результат был отрицательным. Таким образом, хранение вещественных доказательств в земле более трех с половиной месяцев оказывает существенное влияние на возможность определения 21 фенотипа гаптоглобина в пятнах крови, особенно в пятнах крови на смесовой и шерстяной ткани. Хранение же вещественных доказательств в подобных условиях более четырех месяцев оказывает очень большое влияние на возможность диагностики фенотипов гаптоглобина на фореграммах, положительный результат наблюдали лишь в 28% случаев на бумаге, 14% наблюдений на хлопчатобумажной ткани, в 10% и 8% случаев на смесовой и шерстяной ткани. Через пять месяцев хранения вещественных доказательств в земле исследование фенотипов гаптоглобина в пятнах крови, расположенных на бумаге, хлопчатобумажной, смесовой и шерстяной ткани нецелесообразно (в температурных условиях от +10 до +15 градусов). ВЫВОДЫ 1. Установлена зависимость между возможностью определения фенотипов гаптоглобина, видом предмета-носителя, и сроком воздействия на вещественные доказательства факторов внешней среды. 2. Определение фенотипов гаптоглобина при воздействии прямых солнечных лучей при температуре от +25 до +30 градусов на пятна крови, находящиеся на бумаге, хлопчатобумажных, шерстяных и смесовых тканях, возможно в срок не более 3-4 дней, по истечении которого фракции гаптоглобина определить невозможно. 3. Определение фенотипов гаптоглобина при воздействии влажной среды при температуре от +15 до +20 градусов на пятна крови, находящиеся на бумаге, хлопчатобумажных, шерстяных и смесовых тканях, возможно в сроки до одного месяца, по истечении которого фракции гаптоглобина определить не представляется возможным. 4. Определение фенотипов гаптоглобина в пятнах крови, находящихся на бумаге, хлопчатобумажных, шерстяных и смесовых тканях, хранившихся в почве (чернозем) при температуре от +10 до +15 градусов возможно в срок до пяти месяцев, по истечении которого определить фракции гаптоглобина не представляется возможным. 22 5. Выявление фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на вещественных доказательствах в ряде случаев позволяет устанавливать давность их образования, что имеет существенное значение при производстве судебномедицинских экспертиз. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для получения информативных результатов при определении фенотипов гаптоглобина в следах крови на различных предметах следует соблюдать определенные требования: При поступлении вещественных доказательств в судебно-биологическое отделение необходимо на этапе приема вскрывать пакеты, осматривать вещественные доказательства, при необходимости высушивать их. При заборе образов крови проходящих по делу лиц рекомендуется помимо марлевой салфетки наносить образец и на лист бумаги. В случаях, когда в ходе производства судебно-биологических экспертиз, возникает необходимость исследования фенотипов гаптоглобина в образцах крови проходящих по делу лиц и в пятнах крови на вещественных доказательствах, нужно обращать внимание на вид вещественного доказательства, его состояние (цвет пятен крови, наличие гнилостного запаха, участков заплесневелости, загрязненность частицами грунта), сроки, прошедшие с момента совершения преступления или изъятия вещей. По возможности, сокращать сроки между поступлением вещественных доказательств в отделение и проведением исследования фенотипов гаптоглобина. На этапе нарезки пятен крови для проведения исследования фенотипов гаптоглобина, целесообразно изымать участки яркого красно-бурого цвета, без каких-либо наложений. Рекомендуется в первую очередь для исследования использовать пятна, расположенные на хлопчатобумажных тканях или на бумаге. Следует информировать работников следственных органов об особенностях хранения вещественных доказательств: при изъятых вещественных доказательствах во влажном виде, а также при заборе образцов крови проходящих 23 по уголовным делам лиц высушивать их при комнатной температуре, вдали от отопительных приборов и исключая попадание солнечных лучей. При изъятии вещественных доказательств после криминальных захоронений тщательно стряхивать частицы грунта с вещей, вещи просушивать надлежащим образом. Максимально сокращать сроки между изъятием вещественных доказательств с места происшествия и поступлением их в судебно-биологическое отделение. При поступлении в судебно-биологическое отделение вещественных доказательств во влажном виде, с признаками гнилостных изменений, при выявлении в пятнах крови фракций гаптоглобина можно делать вывод о давности образования пятен крови не более, чем один месяц, в температурных условиях от +15 до +20 градусов. При поступлении в судебно-биологическое отделение вещественных доказательств после криминальных захоронений в черноземе, при выявлении в пятнах крови фракций гаптоглобина можно делать вывод о давности образования пятен крови не более, чем пять месяцев в температурных условиях от +10 до +15 градусов. При поступлении в судебно-биологическое отделение вещественных доказательств, изъятых с открытых участков местности в летний период, при выявлении в пятнах крови фракций гаптоглобина можно делать вывод о давности образования пятен крови не более четырех дней. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Л.Н. Нестерова, Е.Г. Фаворская. / О некоторых особенностях определения фенотипов гаптоглобина электрофоретическим методом. // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. Новосибирск, 2004. – Вып. 9. – С. 252-254. 2. Е.Г.Фаворская, В.П. Новоселов. / О некоторых особенностях практической деятельности при электрофоретическим определении методом в фенотипов гаптоглобина судебно-биологическом отделении НОБСМЭ. // Материалы 2-го съезда ГСМСЭ. Минск, 2005. – с. 154-156. 24 3. Фаворская Е.Г., Новоселов В.П. / О возможности определения фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на вещественных доказательствах, подвергшихся воздействия неблагоприятных факторов внешней среды // Вестник Томского Государственного университета. – 2006. – октябрь. – С. 101-105. 4. Е.Г.Фаворская, В.П. Новоселов. / О сроках определения фенотипов гаптоглобина в следах крови, хранившихся во влажном состоянии или подвергшихся воздействию прямых солнечных лучей. // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. Новосибирск-Томск, 2008. – Вып. 13. – С. 129-133. 5. В.П. Новоселов, Е.Г.Фаворская. / О возможности определения фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на вещественных доказательствах, подвергшихся гнилостным изменения или хранившимся в земле // Альманах судебной медицины. Санкт-Петербург, 2008. – с. 41-42. 6. Е.Г.Фаворская, В.П. Новоселов. / О возможности определения фенотипов гаптоглобина в пятнах крови на наиболее часто встречающихся видах предметов-носителей, подвергшихся воздействию неблагоприятных факторов внешней среды // Сибирский медицинский журнал. Томск, 2008. - № 1. – С.22-25. 7. В.П. Новоселов, Е.Г.Фаворская / К вопросу об определении давности образования пятен крови. // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. Новосибирск, 2009. – Вып. 15. – С. 274-276. 25