4. материалы и методы

Пятые областные юношеские Головкинские чтения
секция «биология»
Влияния ризоторфина на содержание
пигментов у гороха
Автор: Казанцев Иван
учащийся 8 «Б» класса
МОУ – средней общеобразовательной
Школы № 2 с углублением изучением
отдельных предметов г. Кинеля
Научный руководитель: Курьянович Анна Антоновна,
канд. биол. наук, доцент СГСХА
Самара, 2005 г.
1
СОДЕРЖАНИЕ
стр
2
Введение
2
1. Влияние ризоторфина на содержание фотосинтети-
3
ческих пигментов у гороха
1.1 Роль клубеньковых бактерий в азотном питании
3
растений
2 Пигменты фотосинтеза
4
2.1. Хлорофиллы
4
2.2. Химические свойства хлорофилла
5
2.3.Физические свойства хлорофилла
7
3Каратиноиды
7
3.1Физиологическая роль каротиноидов.
8
4. Материалы и методы
8
5. Результаты исследований
10
Выводы
13
Список использованной литературы:
3
14
ВВЕДЕНИЕ
Продуктивность растений это результат всех процессов жизнедеятельности. На протекание продукционного процесса оказывают влияние
различные факторы внутренней и внешней среды. Один из способов
оценки уровня воздействия этих факторов - это определение содержания
фотосинтетических пигментов.
Проблема азотного питания растений длительное время изучалась
биологическими науками, связанных с производством сельскохозяйственной продукции, но не теряет своей актуальности, несмотря на продвинутость в этом вопросе.
Клубеньковые бактерии бобовых культур могут внести значительный вклад в решение проблемы азотного питания культурных растений
и в сохранение плодородия почвы, при этом решаются вопросы связанные с охраной окружающей среды. Создание бактериальных удобрений,
разработка технологий культивирования сельскохозяйственных растений, с использованием таких удобрений - один из путей решения этой
проблемы.
ВЛИЯНИЕ РИЗОТОРФИНА НА СОДЕРЖАНИЕ
ПИГМЕНТОВ У ГОРОХА.
4
1. Роль клубеньковых бактерий в азотном питании растений
Растения для своего развития нуждаются в значительных количествах
азота. В окружающей растение среде много азота в разнообразной форме: в
атмосфере – молекулярный азот и пары аммиака, в почве – неорганические
(нитраты, нитриты, аммиак) и органические (аминокислоты, амиды, белки
и др.) соединения азота.
Установлено, что растения не способны усваивать молекулярный азот
атмосферы, это могут азотфиксирующие микроорганизмы. Особое значение имеют азотфиксирующие клубеньковые бактерии рода Rhizobium, поселяющиеся на корнях бобовых растений
Взаимоотношения между высшими растениями и клубеньковыми
бактериями характеризуют как симбиоз. Однако на первых этапах инфицирования бактерии питаются целиком за счет высшего растения, т. е.
практически паразитируют на нем, поэтому может наблюдаться торможение роста зараженных растений. Развитые клубеньки начинают снабжать азотистыми веществами растение-хозяин и получать от него фотоассимиляты. Согласно расчетам, сделанным на основании модельных
опытов, для восстановления 1 моль N2 необходимо не менее 12—15 моль
АТФ Реальные же затраты на процесс азотфиксации значительно
больше: на каждый грамм фиксированного азота окисляется 3— 6 г органического углерода.
В период вегетативного роста в клубеньки поступает 25—40 % продуктов фотосинтеза, при этом около половины возвращается в надземную часть растения в виде азотистых соединений. При переходе растений
к репродуктивной фазе развития поток фотоассимилятов в клубеньки постепенно снижается, что приводит к затуханию их азотфиксирующей деятельности.
Тесная связь восстановления молекулярного азота в клубеньках с
фотосинтезом и перераспределением ассимилятов обусловливает зависимость этого процесса от интенсивности и продолжительности освещения,
5
концентрации СО2 и водообеспеченности растений. Повышенные дозы
азотных удобрений подавляют процесс азотфиксации.
Благодаря деятельности клубеньковых бактерий бобовые растения
не только обеспечиваются азотсодержащими соединениями, но и значительно обогащают почву.
Среди элементов питания азот занимает особое место. До 65% белка находится в хлоропластах. Азот влияет на размеры хлоропластов, на
активность синтетических процессов, протекающих в них.
2. ПИГМЕНТЫ ФОТОСИНТЕЗА
Для того чтобы свет мог оказывать влияние на растительный организм и, в частности, быть использованным в процессе фотосинтеза, необходимо его поглощение фоторецепторами-пигментами. Пигменты — это
окрашенные вещества. Пигменты поглощают свет определенной длины
волны. Непоглощенные участки солнечного спектра отражаются, что и
обусловливает окраску пигментов. Так, зеленый пигмент хлорофилл поглощает красные и синие лучи, тогда как зеленые лучи в основном отражаются. Видимая часть солнечного спектра включает длины волн от 400
до 700 нм. Вещества, поглощающие весь видимый участок спектра, кажутся черными. Пигменты, сконцентрированные в пластидах, можно разделить на три группы: хлорофиллы, каротиноиды.
2.1. Хлорофиллы
Важнейшую роль в процессе фотосинтеза играют зеленые пигменты— хлорофиллы. Французские ученые Пелетье и Кавенту (1818) выделили из листьев зеленое вещество и назвали его хлорофиллом (от греч.
«хлорос» -зеленый и «филлон» — лист). В настоящее время известно около десяти хлорофиллов. Они отличаются по химическому строению,
окраске, распространению среди живых организмов. У всех высших зеленых растений содержатся хлорофиллы А и Б. Хлорофилл С содержится в
диатомовых водорослях, хлорофилл Д — в красных водорослях. Кроме
того, известны четыре бактериохлорофилла (А, Б, С и Д), содержащиеся в
6
клетках фотосин-тезирующих бактерий. В клетках зеленых бактерий содержатся бактериохлорофиллы С и Б, в клетках пурпурных бактерий —
бактериохлорофиллы А и Б. Основными пигментами, без которых фотосинтез не идет, являются хлорофилл а для зеленых растений и бактериохлорофиллы для бактерий.
Впервые точное представление о пигментах зеленого листа высших
растений было получено благодаря работам крупнейшего русского ботаника М. С. Цвета (1872—1919). Он разработал новый хроматографический метод разделения веществ и выделил пигменты листа в чистом виде.
Хроматографический метод разделения веществ основан на их различной
способности к адсорбции. Метод этот получил широкое применение. М.
С. Цвет пропускал вытяжку из листа через стеклянную трубку, заполненную порошком — мелом или сахарозой (хроматографическую колонку). Отдельные компоненты смеси пигментов различались по степени адсорбируемости и передвигались с разной скоростью, в результате чего они
концентрировались в разных зонах колонки. Разделяя колонку на отдельные части (зоны) и используя соответствующую систему растворителей,
можно было выделить каждый пигмент. Оказалось, что листья высших
растений содержат четыре пигмента — два хлорофилла (А и Б) и два каротиноида (каротин и ксантофилл). Хлорофиллы, так же как и каротиноиды, нерастворимы в воде, но хорошо растворимы в органических растворителях. Хлорофиллы А и Б различаются по цвету: хлорофилл а имеет
сине-зеленый оттенок, А хлорофилл Б — желто-зеленый. Содержание
хлорофилла А в листе примерно в три раза больше по сравнению с хлорофиллом Б.
2.2. Химические свойства хлорофилла
По химическому строению хлорофиллы — сложные эфиры дикарбоновой органической кислоты — хлорофиллина и двух остатков спиртов
— фитола и метилового. Эмпирическая формула — C55H72 O5N4Mg. Хлорофиллин представляет собой азотсодержащее металлорганическое со7
единение, относящееся к магнийпорфиринам
COOH
Mg N4OH30C32
COOH
В хлорофилле водород карбоксильных групп замещен остатками
двух спиртов — метилового СН3ОН и фитола С20Н39ОН. На рисунке 38,
Л дана структурная формула хлорофилла А. Хлорофилл Б отличается тем,
что содержит на два атома водорода меньше и на один атом кислорода.
В центре молекулы хлорофилла расположен атом магния, который
соединен с четырьмя атомами азота пиррольных группировок. В пиррольных группировках хлорофилла имеется система чередующихся двойных и
простых связей. Это и есть хромофорная группа хлорофилла, обусловливающая поглощение определенных лучей солнечного спектра и его окраску. Диаметр порфиринового ядра составляет 10 нм, а длина фитольного
остатка — 2 нм.
Расстояние между атомами азота пиррольных группировок в ядре
хлорофилла составляет 0,25 нм. Интересно, что диаметр атома магния равен 0,24 нм. Таким образом, магний почти полностью заполняет пространство между атомами азота пиррольных группировок. Это придает
ядру молекулы хлорофилла дополнительную прочность. Еще К. А. Тимирязев обратил внимание на близость химического строения двух важнейших пигментов: зеленого — хлорофилла листьев и красного — гемина
крови. Действительно, если хлорофилл относится к магнийпорфиринам,
то гемин — к железопорфиринам. Сходство это не случайно и служит еще
одним доказательством единства всего органического мира.
Важным свойством молекул хлорофилла является их способрость к
взаимодействию друг с другом. .
2.3. Физические свойства хлорофилла
Как уже отмечалось, хлорофилл способен к избирательному поглощению света. Спектр поглощения данного соединения определяется его
8
способностью поглощать свет определенной длины волны (определенного
цвета). Для того чтобы получить спектр поглощения, К. А. Тимирязев
пропускал луч света через раствор хлорофилла. Часть лучей поглощалась
хлорофиллом, и при последующем пропускании через призму в спектре
обнаруживались черные полосы. Было показано, что хлорофилл в той же
концентрации, как в листе, имеет две основные линии поглощения в красных и сине-фиолетовых лучах. При этом хлорофилл а в растворе имеет
максимум поглощения 429 и 660 нм, тогда как хлорофилл Ь — 453 и 642
нм. Однако необходимо учитывать, что в листе спектры поглощения хлорофилла меняются в зависимости от его состояния, степени агрегации, адсорбции на определенных белках. В настоящее время показано, что есть
формы хлорофилла, поглощающие свет с длиной волны 700, 710 и даже
720 нм. Эти формы хлорофилла, поглощающие свет с большой длиной
волны, имеют особенно важное значение в процессе фотосинтеза.
Хлорофилл обладает способностью к флуоресценции. Флуоресценция представляет собой свечение тел, возбуждаемое освещением и
продолжающееся очень короткий промежуток времени (10~8— 10~9 с).
Свет, испускаемый при флюоресценции, имеет всегда большую длину
волны по сравнению с поглощенным. Это связано с тем, что часть поглощенной энергии выделяется в виде тепла. Хлорофилл обладает красной
флуоресценцией.
3. КАРОТИНОИДЫ
Наряду с зелеными пигментами в хлоропластах и хроматофорах содержатся пигменты, относящиеся к группе каротиноидов. Каро-тиноиды
— это желтые и оранжевые пигменты алифатического строения, производные изопрена. Каротиноиды содержатся во всех высших растениях и у
многих микроорганизмов. Это самые распространенные пигменты с разнообразными функциями. Каротиноиды, содержащие кислород, получили
название ксантофиллов. Основными представителями каротиноидов у
высших растений являются два пигмента — fi-каротин (оранжевый)
9
С40Н5В и ксантофилл (желтый) С4оН5б02. Каротин состоит из 8 изопреновых остатков (рис. 41). При разрыве углеродной цепочки пополам и образовании на конце спиртовой группы каротин превращается в 2 молекулы витамина А. Обращает на себя внимание сходство в структуре фитола
— спирта, входящего в состав хлорофилла, и углеродной цепочки, соединяющей циклогексениловые кольца каротина. Предполагается, что фитол возникает как продукт гидрирования этой части молекулы каротиноидов. Поглощение света каротиноидами, а следовательно, их окраска, а
также способность к окислительно-восстановительным реакциям обусловлены наличием конъюгированных двойных связей. Каротин имеет
два максимума поглощения, соответствующие длинам волн 482 и 452 нм.
Красные лучи, поглощаемые хлорофиллами, каротиноиды не поглощают.
Каротиноиды, в отличие от хлорофилла, не обладают способностью к
флуоресценции. Подобно хлорофиллу каротиноиды в хлоропластах и
хроматофорах находятся в виде нерастворимых в воде комплексов с белками.
3.1. Физиологическая роль каротиноидов.
Уже тот факт, что каротиноиды всегда присутствуют в хлоропластах, позволяет считать, что они принимают участие в процессе фотосинтеза. Однако не отмечено ни одного случая, когда в отсутствие хлорофилла этот процесс осуществляется. В настоящее время установлено, что каротиноиды, поглощая определенные участки солнечного спектра, передают энергию этих лучей на молекулы хлорофилла. Тем самым они способствуют использованию лучей, которые хлорофиллом не поглощаются.
Физиологическая роль каротиноидов не ограничивается их участием
в передаче энергии на молекулы хлорофилла. По данным русского исследователя Д. И. Сапожникова, на свету происходит взаимопревращение
ксантофиллов (виолаксантин превращается и зеаксантин), что сопровождается выделением кислорода. Спектр действия этой реакции совпадает со
спектром поглощения хлорофилла, что позволило высказать предположе10
ние об ее участии в процессе разложения воды и выделения кислорода при
фотосинтезе.
Имеются данные, что каротиноиды выполняют защитную функцию,
предохраняя различные органические вещества, в первую середь
молекулы хлорофилла, от разрушения на свету в процесе фотоокисления.
Образование каротиноидов зависит от источника азотного питания.
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучали содержание фотосинтезирующих пигментов в вегетативных
органах двух различных по морфотипу сортах гороха: усатого Флагман 7и
листочкового Новокуйбышевский. С целью выявить преимущества
изученных сортов в смешанных посевах проводили в фазы начала бутонизации, бутонизация, начало цветения, цветение, формирование лопаточек. Опыт закладывали на питомнике СГСХА. Опытные делянки 3 м2,
повторность трехкратная. Растения выращивали без инокуляции семян ризоторфином и с инокуляцией ризоторфином для гороха. Контроль вариант без инокуляции. Определение пигментов проводили в ацетоновой
выдержке по методу Шматько И.Г. Пигменты вычисляли у растений с ризоторфином в процентах к контролю
Ход работы
Навеску растительного материала (100-300 мг свежей массы)" размельчить ножницами, поместить в маленькую ступку, добавить на кончике
скальпеля карбонат кальция (порошок мела) для нейтрализации кислот.
Прилить 4-5 мл растворителя (этанола 96%, ацетона 100%, ацетона 80%) и
тщательно растереть, при необходимости добавив кварцевый песок либо
порошок стекла в качестве абразивного материала. Для получения экстракта провести фильтрование с помощью стеклянного фильтра и колбы Бунзена (используется насос Камовского или водоструйный) либо воспользоваться центрифугированием. Экстракты пигментов использовать для измерения оптической плотности при следующих длинах волн: для ацетона
100%: 440.5, 644 и 662 нм; для этанола 96%: 649 и 665 нм.
11
Слишком интенсивно окрашенные экстракты перед измерением разбавить чистым растворителем, при этом кратность разбавления будет учтена в последующих расчетах. По показателям оптической плотности рассчитать концентрацию пигментов С, мг/л, в пробах по формулам:
а)для 100% ацетона
С(хл.А) = 9.784 ▪ Е(662) - 0.990 ▪ Е(644)
С(хл.В) = 21.426 ▪ Е(644) - 4.650 ▪ Е(662)
С(кар.) = 4.695*▪ Е(440.5) -0.268 ▪ (С(хл.А) +
С(хл.В))
Конечные результаты выразить в содержании пигментов в мг/г
навески следующим образом: С, мг/л, или С/1000, мг/мл, содержится в
1мл данного экстракта, а содержание пигментов в общем объеме экстракта
М= K▪ V ▪ C/1000, где V - объем экстракта, мл, К - кратность разбавления
или М= V ▪ C/1000 при отсутствии разбавления12. Однако М мг пигментов
содержалось в А г навески, а искомая величина X мг - содержание в 1г
навески. Итоговая формула:
X = (K▪ V ▪ C)/1000▪ A.
5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
За период наблюдения установлено содержание пигментов в вегетативных частях гороха увеличивалось от начала бутонизации к цветению и снижалось к началу образования плодов Подобная закономерность характерна для обоих сортов (Табл. 1).
У сорта Новокуйбышевский на обоих фонах наблюдалось снижение
пигментов в вегетативных частях в начале цветения (17 июля). Это можно
объяснить нарастающей почвенной засухой (количество осадков в июле
2,6 мм), которая сочеталась с высокой температурой воздуха. Листочковый
сорт Новокуйбышевский формирует большую вегетативную массу, чем
усатый сорт Флагман 7 и, вероятно, поэтому, оказывается, более подвергнут влиянию засухи.
У сорта Новокуйбышевский, инокулированного ризоторфином, в фа12
зы начала бутонизации и начала цветения растений, выявлено повышенное содержание хлорофиллов «а» и «в» и каротиноидов, по
сравнению с растениями без инокуляции ризоторфином, которое снижалось в фазу цветения и во время формирования плодов. Содержание
пигментов в вегетативных частях растений с опытного варианта значительно снижалось по сравнению с контролем.
У сорта Флагман 7 наблюдалось аналогичное повышение содержания пигментов. Однако, в отличие от сорта Новокуйбышевский высокое содержание пигментов прослеживалось во все фазы развития в
опытном варианте. Хотя некоторое снижение хлорофиллов отмечается в
усах и стеблях при формировании плодов.
При сравнении одинаковых вегетативных органов у исследуемых
сортов выявлено стабильное превышение содержания хлорофиллов и каротиноидов над контролем в прилистниках сорта Флагман 7 за весь период наблюдения, а у сорта Новокуйбышевский снижение в период образования плодов на 43 и 40 процентов соответственно. В усах у сорта Новокуйбышевский наблюдалось превышение над контролем в начале бутонизации растений и снижение в фазу цветения на 15 и 20 процентов, 54 и
33 процента соответственно.
У сорта Флагман 7 в фазу формирования плодов имело место
снижение содержания хлорофиллов на 25 процентов, содержание каротиноидов на уровне контроля. В стеблях у исследуемых сортов содержание пигментов превышало контроль только в фазу бутонизации, в
остальные фазы было на уровне контроля.
Ризоторфин способствует повышению содержания фотосинтезирющих пигментов гороха сортов Новокуйбышевский и Флагман 7. Но
усатый сорт Флагман 7 более отзывчив на применение ризоторфина.
Таблица 1.
Содержание фотосинтезирующих пигментов в вегетативных
частях гороха, в % к контролю
13
Новокуйбышевский
Пигменты
Листья
Прилистники
хл. а + в
153
81
Каротиноиды
50
143
хл. а + в
28
184
Каротиноиды
187
67
Начало цве- хл. а + в
187
187
тения
Каротиноиды
214
138
Цветение
хл. а + в
89
135
Каротиноиды
82
167
Формир.
хл. а + в
50
57
Лопаточек
Каротиноиды
133
60
Флагман 7
Начало бухл. а + в
120
тонизации
Каротиноиды
100
Бутонизация хл. а + в
104
Каротиноиды
125
Начало цве- хл. а + в
156
тения
Каротиноиды
186
Цветение
хл. а + в
118
Каротиноиды
130
Формир.
хл. а + в
150
Лопаточек
Каротиноиды
225
Фаза развит.
Начало бутонизации
Бутонизация
Усы
93
220
100
89
87
114
85
80
46
67
300
151
68
525
244
240
314
250
75
100
Стебель
88
100
217
50
160
200
100
100
100
100
100
100
186
216
100
100
113
100
50
100
Анализ продуктивности показал, что при обработке гороха
ризоторфином его урожайность превышает контроль на 24,9 процента.
ВЫВОДЫ
1. Ризоторфин способствует повышению содержания
фотосинтезирющих пигментов гороха сортов Новокуйбы-
14
шевский и Флагман 7.
2. Усатый сорт Флагман 7 более отзывчив на применение ризоторфина.
3. При обработке семян гороха ризоторфином повышается его урожайность
Список использованной литературы:
15
1. Кожушко Н.Н. Оценка засухоустойчивости полевых
культур. В кн.: Диагностика растений к стрессовым воздействиям. Л. 1988, -с. 10-25
2. Курьянович
А.А.,
Иванайская
Н.С.
Со-
держание фотосинтетических пигментов в вегетативных
органах у контрастных по морфотипу листьев гороха
3. Лебедев С.И. Физиология растений. М., Агропромиздат,
1988. 544 с.
4. Методы биохимического исследования растений / Под
ред. А.И.Ермакова. М., Агропромиздат, 1987. 480 с.
5. Новикова
ления
Н.Е.
и распределения
растений
Сравнительное
биомассы
изучение
между
накоп-
органами
в продукционном процессе у сортов гороха ли-
сточкового и усатого типа. Доклады РАСХН, 1997, с.56-61
6. Практикум по физиологии растений / Под ред. Проф.
Н.Н.Третьякова. М., Агропромиздат, 2002. 184 с.
7. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений /
Под ред. Проф. Н.Н.Третьякова. М., Колос, 1998. 640 с.
8. Физиология растений. Учебно – практическое пособие / Под
ред.Е.И.Кошкина.М., Колос, 2001. 154 с.
Проблема азотного питания растений длительное время изучалась
биологическими науками, связанных с производством сельскохозяй16
ственной продукции, но не теряет своей актуальности, несмотря на продвинутость в этом вопросе.
Клубеньковые бактерии бобовых культур могут внести значительный вклад в решение проблемы азотного питания культурных растений и
в сохранение плодородия почвы, при этом решаются вопросы связанные
с охраной окружающей среды. Создание бактериальных удобрений, разработка технологий культивирования сельскохозяйственных растений, с
использованием таких удобрений - один из путей решения этой проблемы.
Изучали содержание фотосинтезирующих пигментов в вегетативных
органах двух различных по морфотипу сортах гороха: усатого Флагман 7и
листочкового Новокуйбышевский. С целью выявить преимущества изученных сортов в смешанных посевах проводили в фазы начала бутонизации, бутонизация, начало цветения, цветение, формирование лопаточек.
Опыт закладывали на питомнике СГСХА. Опытные делянки 3 м2, повторность трехкратная. Растения выращивали без инокуляции семян ризоторфином и с инокуляцией ризоторфином для гороха. Контроль -вариант без
инокуляции. Определение пигментов проводили в ацетоновой выдержке по
методу Шматько И.Г. Пигменты вычисляли у растений с ризоторфином в
процентах к контролю.
Ризоторфин способствует повышению содержания фотосинтезирющих пигментов гороха сортов Новокуйбышевский и Флагман 7. Но усатый сорт Флагман 7 более отзывчив на применение ризоторфина. Анализ
продуктивности
показал,
что
при
обработке
гороха
ризоторфином его урожайность превышает контроль на 24,9 процента.
17
18