СЫСОЕВА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ С ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИМ

На правах рукописи
СЫСОЕВА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО
РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ С ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИМ
ДЕЙСТВИЕМ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Пермь – 2011
2
Работа
выполнена
в
Государственном
бюджетном
общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования
«Башкирский государственный медицинский университет Федерального
агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской
Федерации».
НАУЧНЫЙ
РУКОВОДИТЕЛЬ:
ОФИЦИАЛЬНЫЕ
ОППОНЕНТЫ:
кандидат фармацевтических наук,
доцент Афанасьева Юлия Геннадьевна
доктор фармацевтических наук,
профессор Белоногова Валентина Дмитриевна
ГБОУ ВПО «Пермская государственная
фармацевтическая академия»
Минздравсоцразвития Российской Федерации
доктор фармацевтических наук,
профессор Ханина Миниса Абдуллаевна
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный
медицинский университет»
Минздравсоцразвития Российской Федерации
ВЕДУЩАЯ
ОРГАНИЗАЦИЯ:
ГБОУ ВПО «Самарский государственный
медицинский университет»
Минздравсоцразвития Российской Федерации
Защита состоится «13» декабря в 13 часов на заседании диссертационного
совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная
фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу:
614990 г.Пермь, ул. Полевая, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Пермской
государственной фармацевтической академии по адресу: 614070 г. Пермь,
ул. Крупской, 46.
Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства
образования и науки Российской Федерации http: // www.mon.gov.ru «___»
ноября 2011 г. и на сайте ПГФА http: // www.pfa.ru «___» ноября 2011 г.
Автореферат разослан «____» ноября 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 208.068.01
кандидат фармацевтических наук, доцент
И.А. Липатникова
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Стремительное развитие цивилизации приводит к
ухудшению экологического состояния окружающей среды, что неизбежно ведет к
нарушению иммунного статуса организма. Аллергические болезни, связанные с
изменением иммунного ответа, охватывают около 10% населения и колеблются в
разных странах и регионах от 1% до 50%. Проведенные в ряде районов Российской
Федерации исследования показали, что в крупных промышленных центрах
аллергическими болезнями страдает от 10 до 20% населения, а в сельской
местности – всего 2-4%, особенно настораживает рост числа заболеваний среди
детей.
По данным Всемирной организации здравоохранения, частота выявления
аллергических заболеваний значительно выше, чем туберкулеза, опухолевых
заболеваний, ревматизма.
Широкая распространенность аллергических заболеваний объясняется
многими
причинами,
а
именно
обилием
лекарственных
средств,
профилактическими прививками, иммунными сыворотками и другими белковыми
препаратами, без которых невозможно эффективное лечение многих тяжелых
заболеваний.
Применение гормональных и химиотерапевтических лекарственных средств,
используемых в терапии аллергических заболеваний, часто сопровождается
побочным действием (нарушением водно-солевого и липидного обмена, атрофией
коры надпочечников в результате угнетения секреции АКТГ и др.), что
ограничивает
их
назначение.
Растительные
средства
такими
побочными
действиями практически не обладают и, тем не менее, из включенных в
"Государственный реестр лекарственных средств" более 200 видов лекарственного
растительного сырья, при аллергических заболеваниях рекомендуется только
череда трехраздельная.
Таким
образом,
разработка
лекарственных
препаратов
на
основе
лекарственного растительного сырья, обладающего иммуномодулирующим и
противоаллергическим действием, их стандартизация и создание нормативной
документации является актуальным.
Цель диссертационной работы. Целью исследования является выявление
среди
известных
лекарственных
растений
видов,
обладающих
противоаллергической активностью и иммуномодулирующим действием, создание
4
и стандартизация препаратов противоаллергического действия на их основе. Для
реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
–
провести комплексное фармакогностическое изучение некоторых видов
официнального
лекарственного
растительного
сырья
с
предполагаемой
противоаллергической активностью;
–
разработать и обосновать пропись чайного напитка и водорастворимо го
сухого экстракта на его основе для использования в профилактике заболеваний,
связанных с нарушениями функции иммунной системы, в том числе
аллергических;
–
провести фармакогностическое изучение листьев чая, как компонента
входящего в пропись чайного напитка и предложить проект фармакопейной
статьи: «Folia Theae»;
–
разработать технологическую схему получения сухого экстракта на основе
противоаллергического растительного сбора, разработанного на кафедре
фармакогнозии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский
университет
Минздравсоцразвития
Российской
Федерации»,
провести
фитохимическое изучение с целью его стандартизации;
–
разработать
рациональные
лекарственные
формы
для
наружного
использования на основе сухого экстракта из сбора противоаллергического и
провести их технологическое и биофармацевтическое исследования.
Научная новизна работы. Впервые проведен сравнительный анализ
противоаллергической активности 16 видов лекарственного растительного сырья.
Впервые получен сухой экстракт на основе сбора противоаллергического,
разработанного
на
кафедре
фармакогнозии
ГБОУ
ВПО
«Башкирский
государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской
Федерации»,
и
проведено
его
фитохимическое
и
фармакогностическое
исследование. Предложена ФС на сбор противоаллергический - “Species antiallergicae N3”.
Впервые разработаны и обоснованы рациональные лекарственные формы с
противоаллергическим действием на основе сухого экстракта из сбора.
Проведены
технологические
и
биофармацевтические
исследования
предлагаемых препаратов, определены их сроки годности.
Предложена биологически активная добавка и водорастворимый чайный
напиток на ее основе.
5
Проведено
фармакогностическое
изучение
листьев
чая.
Впервые
предложены методы стандартизации и разработан проект ФС “Folia Theae - листья
чая китайского”.
Приоритет
проведенных
исследований
защищен
патентом
РФ
на
изобретение "Мазь для лечения аллергических заболеваний кожи широкого
спектра действия".
Практическая значимость работы. Проведённые исследования показали
возможность использования некоторых официнальных видов лекарственного
растительного сырья для лечения и профилактики аллергических заболеваний.
Разработанные лекарственные формы и профилактические препараты позволят
проводить эффективное комплексное и безопасное лечение и профилактику
аллергических
разработанных
заболеваний.
Эффективность
лекарственных
форм
проведённых
подтверждена
в
исследований
работе
и
кафедры
дерматовенерологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский
университет
Минздравсоцразвития
Российской
Федерации»,
на
базе
Республиканского кожно-венерологического диспансера (г. Уфа).
Предлагаемое
лекарственное
растительное
сырье
для
изготовления
растительных композиций и препаратов на их основе в заводских и аптечных
условиях позволяет максимально использовать возможности флоры Республики
Башкортостан.
Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на
кафедрах ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет
Минздравсоцразвития Российской Федерации»: фармакогнозии с курсом ботаники
и основ фитотерапии, фармацевтической технологии с курсом биотехнологии,
фармацевтической химии с курсом аналитической и токсикологической химии,
дерматовенерологии, Регионального центра контроля качества лекарственных
средств ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет
Минздравсоцразвития Российской Федерации».
Осуществлён выпуск опытной партии водорастворимого профилактического
чайного напитка на ЗАО “ФК Бионорм”.
Разработаны:
проекты
ФС
“Species
antiallergicae
N
3”
–
сбор
противоаллергический N 3”, “Folia Theae” - листья чая китайского”, “Extractum
species antiallergicae N 3 siccum” - экстракт сбора противоаллергического N 3
сухой”. Проект ФС “Species antiallergicae N 3” – сбор противоаллергический N 3”
6
принят к рассмотрению в ФГБУ «Научный Центр Экспертизы
медицинского применения» Министерства здравоохранения
и
средств
социального
развития.
Связь задач исследований с проблемным планом. Работа выполнена в
соответствии с планом научных исследований ГБОУ ВПО «Башкирский
государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской
Федерации» по проблеме фармакология и фармация”. Номер госрегистрации
01200507996. Тема утверждена на заседании Ученого совета фармацевтического
факультета ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет
Минздравсоцразвития Российской Федерации» (протокол № 21 от 26.03.2002 г.).
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на
Всероссийских (Томск, 2006 г.), Республиканских (Уфа, 2000 г., Уфа, 2003 г.)
научных и научно-практических конференциях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ,
из них 1 в издании, рекомендованном ВАК, 1 патент.
Личный вклад автора. Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах
работы и включал планирование и проведение исследований по всем разделам
диссертации. Автором лично проводился набор и систематизация материала
исследования, обработка полученных данных с использованием современных
статистических методов, осуществлен анализ и оценка научной информации, а
также проведено оформление научных публикаций и написание всех глав
диссертации.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
результаты
теоретических
и
экспериментальных
фитохимических,
технологических, химико-биологических и фармакологических исследований
официнальных
видов
лекарственного
растительного
сырья
с
целью
их
использования для лечения и профилактики аллергических заболеваний различной
этиологии и коррекции иммунного статуса организма;
- результаты сравнительного исследования химического состава изучаемых
растительных
объектов,
их
композиций
на
содержание
основных
групп
биологически активных соединений методами хроматографического (БХ, ТСХ),
спектрофотометрического, титриметрического анализов и др.;
7
-
результаты
лекарственных
разработки
форм
на
и
комплексного
основе
фитохимического
исследованных
видов
изучения
лекарственного
растительного сырья.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 161
странице машинописного текста. Содержит 42 таблицы, 21 рисунок. Диссертация
состоит из введения, обзора литературы (гл. 1), экспериментальной части (4 главы),
общих выводов, приложений и списка литературы, который включает 158
источников, из которых 22 – на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи
исследования,
отмечена
новизна
и
практическая
значимость
полученных
результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.
В обзоре литературы (глава 1) обобщены данные о современном состоянии
исследований противоаллергической активности некоторых видов растительного
сырья и природных биологически активных соединений, проведен анализ
заболеваемости аллергическими болезнями в Республике Башкортостан.
Глава 2 посвящена описанию объектов и методов исследования.
В главе 3 приведены данные по сравнительному исследованию флавоноидов,
дубильных веществ, кислоты аскорбиновой, органических кислот в лекарственном
растительном
сырье
противоаллергической
с
предполагаемой
активностью,
а
также
иммуномодулирующей
определена
и
антиоксидантная
активность исследуемого лекарственного растительного сырья.
В главе 4 изложены материалы по разработке и стандартизации сухого
экстракта из сбора противоаллергического и получению лекарственных форм на
его основе – мазей глазной и для наружного применения, а также приведены
материалы исследования биологически активной добавки, водорастворимого
профилактического чайного напитка на основе биологически активной добавки.
В главе 5 приведены результаты исследования иммуномодулирующей
активности
и
механизма
противоаллергического
действия
лекарственного
растительного сырья.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объектами
комплексного
фармакогностического
и
фармакологического
исследования являлось официнальное лекарственное растительное сырье: корневище с
корнями валерианы, листья березы, листья брусники, трава череды, трава хвоща полевого,
почки березовые, трава фиалки, столбики с рыльцами кукурузы, соплодия хмеля, листья
8
крапивы, трава зверобоя, листья ореха грецкого, корень солодки, цветки ромашки, а
также листья чая черного и листья чая зеленого.
Объектом технологических и фитохимических исследований служил сбор
противоаллергический отдельно и в смеси с листом чая (чайный напиток), сухой
экстракт из сбора противоаллергического, мазь глазная и для наружного
применения с сухим экстрактом сбора противоаллергического.
Количественное
определение
суммы
флавоноидов
в
исследуемых
растительных объектах, проводили спектрофотометрическим методом на приборе
СФ-46 (с использованием комплексообразующей добавки или без неё) и
титриметрическим методом. Сумму катехинов определяли гравиметрическим
методом.
Количественное
перманганатометрическим
свободных
определение
методом;
органических
дубильных
содержание
кислот
проводили
веществ
аскорбиновой
проводили
кислоты
титриметрическим
и
и
спектрофотометрическим методами.
Технологическое изучение сухого экстракта, мази глазной и для наружного
применения проводилось в соответствии с требованиями ГФ-XI (статьи - “Мази”,
“Экстракты”). Относительную биодоступность мазей определяли методом диализа
в воду очищенную. Для определения высвобождения сухого экстракта из мазевых
основ использовали метод диффузии в гель.
Изучение товароведческих показателей проводили в соответствии с
требованиями ГФ XI и ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных
средств».
Фармакологические исследования проводились в лаборатории “Новые
лекарственные средства” Института органической химии Уфимского научного
центра РАН. Влияние водных извлечений сырья на первичный и вторичный
иммунный ответ оценивали с использованием модели индукции синтеза
гемолизинов и агглютининов к эритроцитам овец. Сравнительное изучение
противоаллергической
активности
исследуемых
растительных
объектов
проводилось с использованием модели системного анафилактического шока и
модели пассивной кожной анафилаксии.
Статистическую
обработку
экспериментальных
данных
(Р=95%)
фитохимических, фармакологических, технологических и биофармацевтических
исследований проводили определением средней арифметической ошибки при
различных значениях “n” по известным методикам.
9
Сравнительное фитохимическое изучение лекарственных растений
с противоаллергической направленностью действия
После проведения литературного скрининга нами были выбраны 16 видов
официнального
обладающих
лекарственного
растительного
противоаллергической
сырья,
активностью,
предположительно
которая
обеспечивается
комплексом биологически активных веществ, содержащихся в сырье.
В
растительных
флавоноидов
различных
объектах
групп:
исследования
флавонола,
определено
катехинов,
присутствие
флавона,
флавана,
флаванонола и халконов - в форме агликонов и гликозидов.
Присутствие
аскорбиновой
кислоты
было
обнаружено
во
всех
исследованных растительных объектах.
Качественный анализ дубильных веществ показал присутствие их во всех
видах анализируемого сырья: в листья чая (зелёного и чёрного), ореха грецкого,
берёзы, крапивы, цветках ромашки, корневищах с корнями валерианы преимущественно пирогалловой группы; в листьях брусники, траве череды,
зверобоя, фиалки, хвоща, корнях солодки, столбиках с рыльцами кукурузы,
соплодиях хмеля и почках берёзы - преимущественно пирокатехиновой.
Хроматографическое исследование суммарных спиртовых вытяжек из
лекарственного растительного сырья и препаративное выделение индивидуальных
соединений, сравнение их с достоверными образцами позволило определить
присутствие в исследуемых растительных объектах индивидуальных соединений
флавоноидов (табл. 1).
Таблица 1
Результаты хроматографического анализа исследуемых образцов сырья
Флавоноид,
Rf (н-бутанол –
уксусная кислота –
вода 4:1:5)
Рутин,
0,68
Мирицетин, 0,42
Кверцетин, 0,78
Объект исследования
Листья берёзы, брусники, чая чёрного и зелёного, крапивы,
ореха грецкого; цветки ромашки; почки берёзовые; трава
зверобоя, фиалки, хвоща полевого, череды; корень солодки;
столбики с рыльцами кукурузы; соплодия хмеля.
Листья ореха грецкого, берёзы.
Листья крапивы, берёзы, брусники, ореха грецкого; трава
фиалки, зверобоя, хвоща полевого; почки берёзовые;
соплодия хмеля; корневище с корнями валерианы; корень
солодки; цветки ромашки.
10
Лютеолин,
Листья брусники; трава череды, хвоща полевого; цветки
ромашки; корневище с корнями валерианы.
0,81
Кемпферол, 0,83
Листья крапивы, берёзы, брусники, ореха грецкого; трава
хвоща полевого; почки берёзовые; соплодия хмеля;
корневище с корнями валерианы; корень солодки; цветки
ромашки.
Трава фиалки, хвоща полевого; цветки ромашки; почки
берёзовые; корень солодки; корневище с корнями
валерианы.
Апигенин,
0,92
Проведённый сравнительный анализ количественного содержания основных
групп
биологически
активных
соединений
позволил
выделить
виды
лекарственного растительного сырья, содержащие наибольшее их количество
(табл.2).
Таким образом, исследованные нами растения являются перспективными
для дальнейшего изучения на противоаллергическую активность в связи с высоким
содержанием основных групп биологически активных веществ.
Таблица 2
Содержание биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье
Содержание
Наименование
сырья
Флавоноидов в
пересчете на:
Аскорбиновой
кислоты,
Суммы
Катехинов, окисляемых
г
веществ,
рутин,
кверцетин,
%
%
2
3
4
5
6
Трава зверобоя 3,68±0,09
1,68±0,06
0,43±0,012
1,21±0,04
15,72±0,45
Листья крапивы 3,32±0,06
1,52±0,06
1,03±0,05
0,99±0,03
3,02±0,11
Трава череды
2,99±0,08
1,37±0,05
0,51±0,013
1,83±0,07
10,07±0,31
1,55±0,06
0,71±0,02
2,46±0,07
1,14±0,04
14,44±0,36
1,54±0,06
0,70±0,02
0,26±0,01
1,85±0,07
5,21±0,11
1,29±0,04
0,59±0,02
1,85±0,06
1,24±0,04
16,45±0,51
1,08±0,02
0,49±0,02
0,19±0,01
1,33±0,02
17,89±0,22
1
Листья чая
зеленого
Трава фиалки
Листья чая
черного
Листья березы
мг %
%
11
Столбики с
рыльцами
1,04±0,04
0,47±0,02
1,14±0,05
1,15±0,04
4,97±0,09
Корень солодки 0,63±0,02
0,29±0,01
0,94±0,02
1,73±0,07
6,96±0,16
0,58±0,01
0,26±0,01
1,22±0,15
0,71±0,02
2,49±0,12
0,55±0,02
0,61±0,01
1,63±0,05
1,75±0,07
4,80±0,12
кукурузы
Соплодия
хмеля
Трава хвоща
полевого
Изучение антиоксидантной активности исследуемых растительных
объектов
Определение антиоксидантной активности водных извлечений исследуемых
растительных
объектов
проводили
с
использованием
модифицированной
методики, основанной на реакции аутоокисления адреналина. Антиоксидантная
активность водных извлечений из исследованного лекарственного растительного
сырья оказалась достаточно высокой (> 10%), и колебалась в пределах от
3,26±0,13% (для столбиков с рыльцами кукурузы) до 38,05±1,66% (для листьев
крапивы). Наиболее активные природные антиоксиданты: листья крапивы
(38,05±1,66)%, брусники (32,28±1,39)%, зелёного чая (21,59±1,02)%; почки
берёзовые (20,23±1,01)%; трава череды (19,08±0,92)%, хвоща (27,57±1,26)%;
цветки ромашки (17,61±0,85)%; корень солодки (19,29±0,91)%.
На основании проведенных фитохимических и фармакогностических
исследований были выбраны как перспективные для дальнейшего использования в
составе комплексных препаратов следующие виды лекарственного растительного
сырья: листья крапивы – folia Urticae, березы – folia Betulae, трава череды – herba
Bidentis, хвоща – herba Equiseti arvensis, фиалки – herba Violae, корень солодки –
radix Glycyrrhizae, соплодия хмеля – strobili Lupuli, столбики с рыльцами кукурузы
– styli cum stigmatis Zeae maydis. На основании данных видов сырья был составлен
сбор противоаллергический № 3 - “Species antiallergicae N 3”.
Разработка и стандартизация сухого экстракта из сбора
противоаллергического
12
В целях выявления возможности создания на основе противоаллергического
сбора
рациональной
лекарственной
формы
в
лабораторных
условиях
разрабатывалась технология получения сухого экстракта. Сбор для получения
сухого экстракта готовили в соответствии со статьей ГФ XI “Сборы”. Для
приготовления сбора использовалось сырье, соответствующее требованиям
нормативной документации. Все растения брались в равных количествах.
Сухой водорастворимый экстракт получали из сбора противоаллергического
указанного ранее состава. Для увеличения выхода сухого экстракта применили
метод ремацерации с оптимизацией условий экстрагирования. Переменными
факторами явились: измельченность сырья (Х1 от 0,5 до 4), соотношение сырья и
экстрагента (Х2 от 1:5 до 1:15), время одной мацерации (Х3 от 15 до 45 мин), число
настаиваний (Х4 от 2 до 4), температура (Х5 от 20 до 100ºС). Экспериментально
установлено:Х1 - 3 мм; Х2 – 1:10; Х3 – 30 мин; Х4 – 3; Х5 - 100 ºС; коэффициент
водопоглощения – 1,32. Выход сухого экстракта в среднем составил 30,29%.
Максимальное
количественное
содержание
основных
групп
биологически
активных веществ в сухом экстракте составило: флавоноидов, в пересчёте на рутин
2,52±0,12; дубильных веществ 6,14±0,25. В экстракте определялись также:
влажность и рН водного извлечения.
Качественные реакции показали наличие в экстракте дубильных веществ
преимущественно конденсированной группы, флавоноидов различных групп.
Конечный продукт – сухой водорастворимый экстракт – блестящий
мелкокристаллический порошок бурого цвета с ароматным запахом и сладковатогорьким вкусом, в дальнейшем может быть использован для создания на его основе
различных лекарственных форм.
На основании полученных данных составили проект ФС «Extractum Species
antiallergicae N 3 siccum – Экстракт из сбора противоаллергического № 3 сухой».
Предлагаем внести следующие показатели, представленные в таблице 3.
Таблица 3
Товароведческие показатели сухого экстракта
Наименование
Внешние признаки
Числовые показатели
Блестящий
мелкокристаллический
порошок бурого цвета с
ароматным запахом и
сладковато-горьким
13
вкусом
Флавоноиды в пересчете на рутин, не менее %
Окисляемые вещества, не менее %
2
4,5
Потери в массе при высушивании, не более %
pH водного извлечения
5
5,0-5,5
Разработка и исследование профилактического чайного напитка
На основе сбора противоаллергического и листьев чая (субстанция или
основа) нами был разработан и исследован чайный напиток для профилактики
аллергических заболеваний.
Согласно требованиям, предъявляемым к биологически активным добавкам,
в одной столовой ложке должно содержаться не менее 1/5 лечебной дозы. Этому
соответствует смесь с соотношением 1:9 (1 часть сбора и 9 частей листьев чая). Для
сравнения эффективности биологически активной добавки была также исследована
смесь 1:6 (1 часть сбора и 6 частей листьев чая). В столовой ложке такой смеси
содержится 1/3 лечебной дозы.
Качественный анализ исследуемых смесей показал наличие в них основных
групп биологически активных веществ: флавоноидов, дубильных веществ,
преимущественно конденсированной группы, органических кислот (в том числе
аскорбиновой), тритерпеновых сапонинов и др. Хроматографический анализ
спиртовых растворов суммы веществ, выделенной из смесей фракций, позволил
установить наличие в смесях флавоноидов: мирицетин, кверцетин, лютеолин,
кемпферол, апигенин.
В предлагаемых смесях определяли количественное содержание основных
групп биологически активных веществ (табл. 4).
Результаты фитохимического анализа смесей 1:9 и 1:6 (табл. 4) показали, что
содержание основных групп биологически активных веществ в смеси 1:9
значительно выше, чем в смеси 1:6, что позволяет использовать ее в наших
дальнейших исследованиях.
Таблица 4
Содержание основных групп биологически активных веществ
в профилактическом чайном напитке
Группа БАВ
Смесь 1:9
Смесь 1:6
14
Содержание флавоноидов в
2,62±0,06
2,58±0,07
2,19±0,08
2,04±0,07
Аскорбиновая кислота, мг%
2,24±0,25
1,31±0,21
Свободные органические
2,87±0,02
2,77±0,03
Катехины, %
2,08±0,45
1,78±0,19
Сумма окисляемых
10,70±0,20
8,60±0,17
пересчете на апигенин, %
Содержание флавоноидов в
пересчете на рутин, %
кислоты, %
соединений, %
Результаты фармакологического исследования полученных смесей показали,
что первичный иммунный ответ, связанный с синтезом гемолизинов, ингибируется
прописями обеих смесей, но несколько сильнее у смеси в соотношении 1:9, чем 1:6
(4,300,07 и 4,220,05 соответственно). Вторичный иммунный ответ, связанный с
синтезом гемолизинов, стимулировался обеими прописями (5,790,12 и 5,800,22).
По агглютининам также обе прописи активировали синтез этого типа антител
(4,400,08 и 4,100,07 – первичный иммунный ответ,
5,660,10 и 5,660,09 –
вторичный иммунный ответ, соответственно). Таким образом, по содержанию
основных групп биологически активных веществ и фармакологической активности
смесь 1:9 является более перспективной для дальнейших исследований.
Изучение водорастворимого профилактического чайного напитка
В целях выявления возможности создания на основе биологически активной
добавки более удобной для использования, транспортировки и хранения формы
нами был разработан и исследован водорастворимый чайный напиток для
профилактики аллергических заболеваний на основе смеси чайного листа с
противоаллергическим сбором в соотношении 1:9. Водорастворимый чайный
напиток готовился аналогично сухому экстракту из сбора. При получении сухого
водорастворимого чайного напитка, может произойти потеря части биологически
активных веществ, содержащихся в исходном сырье, что может привести к
снижению его профилактического действия. Поэтому мы провели качественное и
15
количественное химическое изучение полученного водорастворимого чайного
напитка.
Качественные реакции показали присутствие в водорастворимом чайном
напитке тех же групп биологически активных веществ, что и в профилактическом
чайном напитке. Хроматографический анализ позволил предположить присутствие
в препарате гликозидов флавоноидов: рутина и гиперозида, а также агликонов –
апигенина и кверцетина.
Результаты
количественного
анализа
основных
групп
биологически
активных веществ в водорастворимом профилактическом чайном напитке
представлены в таблице 5.
Из данных таблицы 5 видно, что содержание биологически активных
веществ в водорастворимом чайном напитке несколько ниже, чем в исходной
смеси. Меньшее количество флавоноидов в чайном напитке объясняется, очевидно
тем, что в него перешли лишь водорастворимые фракции флавоноидов, в основном
гликозиды,
а
сниженное
содержание
аскорбиновой
кислоты
объясняется
технологическими процессами приготовления водорастворимого чайного напитка.
Таблица 5
Содержание биологически активных веществ в водорастворимом чайном напитке
и смеси 1:9
Водорастворимый
Группа БАВ
Смесь 1:9
Флавоноиды в пересчете на
2,62±0,06
1,12±0,02
Дубильные вещества, %
10,70±0,20
9,75±0,19
Аскорбиновая кислота, мг%
2,24±0,25
1,51±0,15
2,87±0,02
2,45±0,10
чайный напиток
апигенин, %
Свободные органические
кислоты, %
Проведенные
исследования
позволяют
предложить
полученный
водорастворимый чайный напиток для профилактики аллергических заболеваний и
коррекции иммунного статуса.
Фармакогностические исследования по стандартизации
листьев чая китайского
16
Объектом исследования служил чайный лист, сортов чёрного и зелёного,
предлагаемый нами как субстанция для приготовления растительных препаратов
для профилактики аллергических заболеваний.
В имеющейся нормативной документации на исследуемое сырье отсутствует
описание микродиагностических признаков, поэтому нами были проведены
фармакогностические
исследования.
В
результате
были
определены
микродиагностические признаки листьев чая, которые представлены на рисунках 1
- 4.
Качественный анализ листьев чая показал наличие в них основных групп
биологически активных соединений: флавоноидов (групп: флавонола, флавона,
флаванонола, катехинов и халконов – в форме агликонов и гликозидов); дубильных
веществ, преимущественно конденсированной природы; органических кислот (в
том числе аскорбиновой) и тритерпеновых сапонинов.
17
Рис. 1.
Анатомо–диагностические Рис. 2.
Анатомо–диагностические
признаки листьев чая: идиобласты в признаки
листьев
чая:
виде склереид различной формы
извилистостенный эпидермис, устьица
аномоцитного типа, превышающие по
размерам клетки эпидермиса
Рис. 3. Анатомо – диагностические
признаки листьев чая: волоски простые
с характерным, загнутым в виде
хоккейной клюшки основанием (1)
Рис. 4. Анатомо – диагностические
признаки
листьев
чая:
редкие,
крупные, одинаковые по размерам
друзы
Хроматографический анализ, препаративное выделение индивидуальных
соединений, сравнение с достоверными образцами и литературными данными
позволило предположить наличие в листьях чая флавоноидов: мирицетина,
кверцетина, лютеолина, кемпферола, апигенина.
Определение количественного содержания флавоноидов в листьях чая
черного
и
зеленого
противоаллергического
проводилось
методике.
по
разработанной
Предварительные
ранее
для
сбора
УФ-спектроскопические
исследования спиртовых извлечений листьев чая, при различном соотношении
сырья и экстрагента (1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50) показали, что максимумы
поглощения спиртовых извлечений листьев чая совпадают с максимумами
поглощения РСО апигенина, а наиболее выраженный и стабильный результат даёт
соотношение 1:10 (рис. 5).
18
Извлече
ние из
листьев
чая в
соотнош
ении
1:10
Извлече
Оптическая плотность D
0,6
0,55
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
ние из
листьев
чая в
соотнош
ении
1:50
Апиген
ин в
этаноле
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
Длина волны λ, нм
Рис. 5. УФ-спектры РСО апигенина и спиртовых извлечений листьев чая
Это позволило проводить количественное определение флавоноидов в
пересчёте
на
апигенин,
по
методике,
предложенной
для
сбора
противоаллергического (табл. 6).
Таблица 6
Количественное содержание флавоноидов в листьях чая
Содержание флавоноидов в листьях чая, в пересчёте на
N серии
апигенин, %
рутин,%
чёрного
зелёного
чёрного
зелёного
1
3,19±0,07
1,53±0,02
1,30±0,04
1,55±0,06
2
3,21±0,08
1,52±0,02
1,29±0,03
1,56±0,06
3
3,22±0,09
1,55±0,03
1,28±0,03
1,55±0,05
Проведённые исследования показывают, что предлагаемая методика даёт
более высокие значения содержания флавоноидов, что говорит о целесообразности
её использования в анализе листьев чая.
Количественное
содержание
других
групп
биологически
активных
соединений в листьях чая представлено в таблице 7.
Количественное содержание свободных органических кислот и кислоты
аскорбиновой представлено в таблице 8.
19
Таблица 7
Количественное содержание основных групп биологически активных соединений
в листьях чая
Листья чая
Показатель
Содержание катехинов, г
Содержание суммы
окисляемых соединений, %
чёрного
зелёного
1,24±0,04
1,14±0,03
16,46±0,25
14,75±0,21
Таблица 8
Содержание аскорбиновой кислоты и свободных органических кислот
в листьях чая
Листья чая
Аскорбиновая кислота, %
Свободные органические кислоты,
мг%
черного
зеленого
1,81 ± 0,03
2,51 ± 0,08
1,69 ± 0,05
2,49 ± 0,09
1,91 ± 0,08
2,52 ± 0,07
1,77 ± 0,09
2,55 ± 0,04
1,90 ± 0,05
2,57 ± 0,06
1,86 ± 0,04
2,48 ± 0,09
2,71±0,03
3,62±0,07
2,73±0,05
3,66±0,07
2,75±0,05
3,67±0,06
Из данных таблицы видно, что в листьях чая черного и зеленого содержание
аскорбиновой кислоты отличается незначительно. А содержание свободных
органических кислот наиболее высокое в листьях чая зеленого.
Проведённый анализ позволил предложить показатели качества листьев чая,
для использования этого сырья в качестве субстанции при приготовления чайных
напитков для профилактики и комплексной терапии аллергических заболеваний:
внешние признаки: кусочки листьев, различного размера (от 0,5 до 10 мм),
20
свернутые в трубочки, цвет от тёмно-коричневого до почти чёрного, запах
ароматный, терпкий, специфический, вкус вяжущий (сорт чёрный) или цвет
зелёный, запах ароматный, специфический, вкус слегка горьковатый (сорт
зелёный). Микроскопия: клетки эпидермиса толстостенные, слабоизвилистые.
Нижний эпидермис богат устьицами, аномоцитного типа. Волоски одноклеточные
толстостенные, с характерным основанием, загнутым в виде хоккейной клюшки,
причем загиб погружен в эпидермис. Верхний эпидермис подстилается обычно
двухрядной палисадной паренхимой. В мезофилле имеются характерные крупные
идиобласты в виде ветвящихся или рогатых склереид. В паренхиме жилки обильно
представлены друзы оксалата кальция. Числовые показатели: влажность не более
3%; зола общая не более 8% (сорт чёрный), не более 7% (сорт зелёный); зола, не
растворимая в хлористоводородной кислоте не более 7% (сорт чёрный), не более
6% (сорт зелёный); содержание флавоноидов в пересчете на апигенин, не менее 3%
(сорт чёрный), не менее 6% (сорт зелёный); содержание дубильных веществ не
менее 15 % (сорт чёрный), не менее 13,5% (сорт зелёный).
Разработка состава и стандартизация мази для наружного применения
на основе сухого экстракта из сбора противоаллергического
Наиболее часто употребляемая в дерматологии лекарственная форма – мазь.
В связи с эти нами были проведены исследования по разработке состава мазевой
лекарственной формы для наружного применения, которая содержит сухой
водорастворимый экстракт из сбора противоаллергического.
При
разработке
водорастворимого
технологии
экстракта
были
получения
проведены
мазевых
форм
исследования
по
сухого
выбору
вспомогательных веществ, технологии получения и проверке стабильности мазей в
процессе хранения.
В качестве носителей нами были выбраны традиционные и современные
основы,
вспомогательные
вещества,
наиболее
часто
используемые
в
фармацевтической практике. Сухой экстракт во все основы вводили в количестве
5%.
С целью выбора оптимального состава мазевой основы были проведены
биофармацевтические исследования in vitro: оценка динамики высвобождения
действующих веществ – флавоноидов, в пересчёте на рутин, из исследуемых
мазевых основ методом диализа в воду очищенную и диффузии в гель.
Результаты
определения
биодоступности
методом
диализа
через
21
полупроницаемую мембрану и в 6% желатиновый гель показывают, что, по
высвобождающей активности мазевые основы можно расположить в следующей
последовательности: метилцеллюлоза>натрийкарбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ)
> основа Грецкого > основа Кутумовой > ланолин-вазелин > вазелин.
Проведенные исследования позволили выделить оптимальные составы
прописи мази противоаллергического действия
для наружного применения,
содержащей сухой водорастворимый экстракт: на основе Na-КМЦ и основе
Грецкого (патент «Мазь для лечения аллергических заболеваний кожи широкого
спектра действия» № 2353348): сухого экстракта – 5,0; вазелин – 38,0; пентол – 3,8;
пчелиный воск – 1,9; нипагин-нипазол (7,5:2,5) – 0,05; вода очищенная – 79,8.
Дальнейшими исследованиями определены сроки годности исследуемых
мазей на основе Nа-КМЦ и основе Грецкого методом “ускоренного старения”. О
стабильности мазей в процессе хранения судили по количественному содержанию
действующих веществ в мази. В данном случае определяли содержание
флавоноидов в пересчёте на рутин, рН водного извлечения и органолептические
свойства. Установлено, что исследуемые мази сохраняют свои свойства в течение 1
года хранения.
Разработка состава и стандартизации глазной мази на основе сухого экстракта
из сбора противоаллергического
В последнее время наблюдается рост глазной аллергической патологии.
Наиболее часто встречаются сезонные поллинозные конъюнктивиты, хронические
аллергические конъюнктивиты, аллергия при синдроме "сухого глаза" и многие
другие. Наиболее оптимальной лекарственной формой для лечения глазных
аллергических заболеваний является мазь, так как действие глазных капель и
растворов кратковременно, а мазь образует на слизистой глаза пленку и дает
продолжительный терапевтический эффект.
Для разработки состава и исследования нами были взяты водорастворимые
гидрофильные основы (табл. 9). Сухой экстракт во все основы вводили в
количестве 5%.
Глазные мази с сухим экстрактом готовили в асептических условиях по
стандартным
технологическим
схемам,
в
соответствии
с
требованиями
Государственной фармакопеи.
В
полученных
образцах
мазей
изучали
динамику
высвобождения
лекарственных веществ с использованием метода диффузии через мембрану. В
22
качестве среды, в которую диффундируют компоненты лекарственного вещества,
была выбрана искусственная слезная жидкость следующего состава:
натрия
хлорида 0,25; натрия гидрокарбоната 1,00; вода очищенная 100,00.
Таблица 9
3
Нипазол
5
Нипагин
2
Твин-80
5
Глицерин
1
Вода
основы
МЦ
№
Nа КМЦ
Состав мазевых основ
100
1,5
2,5
0,075
0,025
100
1,5
2,5
0,075
0,025
2,5
0,075
0,025
100
Количественное
определение
продиффундировавшего
лекарственного
вещества, в данном случае флавоноидов, в пересчете на апигенин, проводилось
спектрофотометрически через 15, 30, 60, 90 и 120 минут (табл. 10).
Таблица 10
Высвобождение флавоноидов из мазевых основ, в пересчете на апигенин, %
№
п\п
Состав
Время забора проб
15 мин.
30 мин.
60 мин.
90 мин.
120 мин.
1
МЦ
0,19±0,01
0,27±0,02
0,33±0,02
0,42±0,03
0,56±0,02
2
NаКМЦ
0,26±0,02
0,44±0,01
0,54±0,02
0,62±0,02
0,72±0,01
Как видно из данных таблицы 10 наиболее полное и стабильное
высвобождение флавоноидов происходит из основы, в состав которой входит
натрий-карбоксиметилцеллюлоза (№ 2).
Определение стабильности в процессе хранения проводили для мази на
основе № 2, как наиболее оптимальной: приготовленную мазь расфасовывали в
алюминиевые тубы с внутренним лаковым покрытием. О стабильности мази в
процессе хранения судили по количественному содержанию флавоноидов в
навеске мази, по изменению рН и органолептическим свойствам. Количественное
содержание флавоноидов на протяжении 1 года изменяется незначительно.
23
На основании проведенных исследований разработан и предлагается состав
прописи глазной мази с противоаллергическим действием:
Мазь на Nа-КМЦ: сухого экстракта – 5,0; Nа-КМЦ – 4,75; глицерина – 1,425;
Твин-80 – 2,375; воды очищенной – до 100,0; нипагин-нипазол – 0,075-0,025.
Фармакологические исследования
Влияние водных извлечений сырья на первичный и вторичный иммунный
ответ оценивали с использованием модели индукции синтеза гемолизинов и
агглютининов к эритроцитам овец. Водные извлечения – настои и отвары, готовили
согласно методике, описанной в ГФ-XI изд. (ст. “Настои и отвары”).
Поскольку
изученный
спектр
антител
включал
два
их
типа
–
гемагглютинины и гемолизины, то к реальным стимуляторам иммуногенеза можно
отнести: корень солодки, траву фиалки, листья ореха грецкого, траву зверобоя,
листья чая зеленого, так как вытяжки из этого растительного сырья оказались
способными активизировать одновременно синтез обоих типов антител, что важно
для коррекции иммунного статуса организма и разработки эффективных и
безопасных иммуномодулирующих препаратов.
Виды сырья, подавлявшие во вторичном иммунном ответе, синтез
изученных
антител
характеризуются
на
фоне
стимуляции
иммуномодулирующим
первичного
действием
со
иммунного
ответа,
склонностью
к
иммуносупрессии, что более важно при лечении аллергических заболеваний. К
таким видам лекарственного растительного сырья по результатам наших
исследований относятся: листья берёзы, брусники, крапивы, соплодия хмеля.
Сравнительное изучение антианафилактической и противоаллергической
активности изучаемых растительных объектов проводилось с использованием
модели системного анафилактического шока (САШ) и модели пассивной кожной
анафилаксии (ПКА).
В результате исследований было установлено, что применение в течение 21
дня водных извлечений исследуемых растительных объектов не равнозначно
влияет на развитие системного анафилактического шока. Растения, обладающие
выраженным иммуностимулирующим действием, значительно уменьшали время
наступления
анафилаксии
и
увеличивали
выраженность
анафилактических
проявлений. В некоторых случаях наблюдалась гибель части животных от
анафилактического шока. К такому лекарственному растительному сырью
24
относятся: трава череды, зверобоя, полыни горькой; листья чая зелёного,
толокнянки.
Напротив, растительные объекты исследования, показавшие способность к
иммуносупрессии в несколько раз удлиняли время наступления анафилактических
проявлений и уменьшали степень их выраженности. Наиболее активными в данном
случае оказались корни солодки, листья берёзы, брусники, крапивы, грецкого
ореха, трава фиалки, хвоща, соплодия хмеля.
Ингибирующим действием на развитие и степень проявления пассивной
кожной анафилаксии обладали не все виды исследованного растительного сырья.
Наиболее активными оказались: корни солодки, листья берёзы, брусники, крапивы,
грецкого ореха, чая зелёного, трава зверобоя, хвоща, соплодия хмеля, цветки
ромашки и столбики с рыльцами кукурузы.
ВЫВОДЫ
1. Проведено комплексное фармакогностическое изучение некоторых видов
лекарственного растительного сырья с предполагаемым иммуномодулирующим и
противоаллергическим действием. На основании проведенных исследований
выделены виды лекарственного растительного сырья, содержащие наибольшее
количество биологически активных веществ: корневище с корнями валерианы,
корень солодки, листья и почки березы, листья брусники, крапивы, трава фиалки и
цветки ромашки, соплодия хмеля, трава хвоща полевого, трава зверобоя, листья
ореха грецкого, трава череды, столбики с рыльцами кукурузы, листья чая черного,
листья чая зеленого.
2. Проведены фармакологические исследования изучаемых видов растений.
Наибольшую
фармакологическую активность проявили: трава фиалки, листья
крапивы, листья ореха грецкого, корень солодки, листья чая зеленого.
3. Разработан способ получения экстракта сухого на основе сбора
противоаллергического. Предложены показатели качества сухого экстракта,
методики их определения для внесения в проект ФС.
4. Разработан проект ФС «Extractum species antiallergicae siccum – Экстракт
сбора противоаллергического сухой».
5. Разработана и обоснована пропись биологически активной добавки для
профилактики
аллергических
химический
состав
заболеваний
биологически
различной
активных
этиологии.
веществ,
Изучен
проведены
25
фармакологические исследования предлагаемой биологически активной добавки и
механизм противоаллергического действия. На основании прописи биологически
активной добавки предложена
водорастворимый
рациональная
лекарственная
форма
–
чайный напиток. Определены показатели его качества.
6. Проведен сравнительный фармакогностический анализ листьев чая
черного и зеленого, как субстанции. Изучен химический состав биологически
активных веществ листьев чая, определено их количественное содержание.
Результаты исследований позволили предложить проект ФС «Folia Theae - Листья
чая» (субстанция для производства биологически активной добавки).
7. Разработаны состав и технология получения мази для наружного
использования и глазной мази на основе сухого экстракта из сбора с
противоаллергическим
действием.
Проведено
технологическое
и
биофармацевтическое исследование мазевых композиций на основе сухого
экстракта. Определены сроки годности и условия хранения полученных мазей.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Пахомова, Т.В. Разработка и исследование противоаллергической добавки на
основе противоаллергического сбора / Ю.Г. Афанасьева, Т.В. Пахомова //
Вопросы теоретической и практической медицины: тез. докл. Респ. молод.
науч. конф. – Уфа, 2000. – 88 с.
2. Пахомова, Т.В. Сравнительное фармакологическое исследование листьев чая
китайского / Т.И. Плеханова, Ю.Г. Афанасьева, Т.В. Пахомова // Мат. Респ.
конф. молод. ученых. – Уфа, 2003. – С. 72.
3. Пахомова,
Т.В.
Получение
и
фитохимическое
исследование
водорастворимого профилактического чайного напитка / Ю.Г. Афанасьева,
Т.В. Пахомова // Современные проблемы фармакологии и фармации: Мат.
Всеросс. науч.-практ. конф. – Новосибирск, 2005. – С. 37-39.
4. Пахомова, Т.В. Глазная мазь противоаллергического действия на основе
растительного экстракта / Ю.Г. Афанасьева, Т.В. Пахомова, А.В. Браженко //
Новые достижения в создании лекарственных средств растительного
происхождения: Мат. Всеросс. науч.-практ. конф. – Томск, 2006. – С. 41.
5. Пахомова Т.В. Влияние извлечений из ряда лекарственных растений на
иммунный
ответ
в
эксперименте / Н.Ж.Басченко,
Т.В.Пахомова,
В.В.Сперанский // Растительные ресурсы. - 2008. - Вып. 3, - С. 118-122.
26
6. Патент на изобретение № 2353348 «Мазь для лечения аллергических
заболеваний кожи широкого спектра действия». Бюл. № 12 от 27.04.2009.
Сысоева Татьяна Викторовна (Россия)
Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья с
противоаллергическим
действием
с
целью
создания
на
его
основе
лекарственных препаратов
Проведен сравнительный анализ противоаллергической активности 16 видов
лекарственного растительного сырья. Получен сухой экстракт на основе сбора
противоаллергического, разработанного на кафедре фармакогнозии Башкирского
государственного медицинского университета, и проведено его фитохимическое и
фармакогностическое исследование. Разработаны и обоснованы рациональные
лекарственные формы: сухой экстракт из сбора противоаллергического, мазь для
наружного применения на основе сухого экстракта, мазь глазная на основе сухого
экстракта, водорастворимый профилактический чайный напиток. Проведены
технологические и биофармацевтические исследования предлагаемых препаратов,
определены
их
сроки
годности.
Исследования
показали
возможность
использования некоторых официнальных видов лекарственного растительного
сырья для лечения и профилактики аллергических заболеваний.
Sysoeva Tatyana (Russia)
Pharmacognostic study of medicinal plants with anti-allergic action to build
on the basis of medicines
A comparative analysis of antiallergic activity of 16 species of medicinal plants.
Dry extract was obtained by collecting antiallergic, developed at the Department of
Pharmacognosy, Bashkortostan State Medical University, and held its phytochemical and
Pharmacognostic study. Developed and validated rational dosage forms: dry extract of
the collection antiallergic, an ointment for external use on the basis of dry extract
ointment eye on the basis of dry extract, water-soluble prophylactic tea drink. Held
technology and biopharmaceutical study of proposed products, are defined by their
27
expiration dates. Studies have shown the possibility of using certain types of officinal
medicinal plants for treatment and prevention of allergic diseases.