На правах рукописи Лукьянцев Михаил Александрович ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭНДОФИТНЫХ
реклама
На правах рукописи Лукьянцев Михаил Александрович ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭНДОФИТНЫХ ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS COHN C РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ АНТАГОНИЗМА К ФИТОПАТОГЕННЫМ ГРИБАМ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный аграрный университет» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Хайруллин Рамиль Магзинурович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович кандидат биологических наук Актуганов Глеб Эдуардович Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Защита диссертации состоится 25 ноября 2010 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова». Автореферат диссертации разослан ____ октября 2010 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одной из актуальных задач сельскохозяйственной биологии является разработка эффективных средств и способов снижения развития болезней растений. При этом требования к безопасности мероприятий по защите сельскохозяйственных культур от вредных организмов постоянно возрастают. В настоящее время можно выделить два основных подхода для экологически безопасного контроля фитопатогенов: создание устойчивых генетически модифицированных (ГМ) растений и разработка биологических препаратов как альтернативы химическим пестицидам. Поскольку устойчивость к вредным организмам у ГМ-растений контролируется только одним-двумя генами, эффективность их «действия» может со временем преодолеваться. Кроме того, безопасность таких культур до сих пор остается предметом дискуссий. Следовательно, второе направление представляется более перспективным. Идея использования микроорганизмов в качестве основы биопрепаратов для защиты растений не нова (Худяков 1935; Новогрудский, 1936; Красильников, 1952; Билай, 1961). В ряду первых агентов биоконтроля численности вредителей и фитопатогенов были представители рода Bacillus (Смирнов и др., 1982; Powell, Jutsum, 1993), продуцирующие, соответственно, токсины, убивающие насекомых или антибиотики, подавляющие развитие грибов (Bais et al., 2004; Shoda, 2000; Toure et al., 2004). Однако, несмотря на многочисленность исследований в этом направлении, количество коммерческих биопрепаратов, разрешенных в настоящее время к применению в качестве биофунгицидов, ограничено. На наш взгляд, одними из причин этого являются недостаточное изучение биологических особенностей бактерий – антагонистов фитопатогенов, а также понимание механизмов становления системы антагонистические бактерии – фитопатогены – растение. В связи с вышесказанным, целью данной работы явилось определение особенностей биологической активности эндофитных штаммов Bacillus subtilis с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи. 1. Провести сравнительную оценку антагонистической активности различных эндофитных штаммов B. subtilis к фитопатогенным грибам. 2. Выяснить возможные механизмы проявления антагонистической активности у изучаемых штаммов. 4 3. Определить особенности проявления биологической активности исследуемых штаммов по отношению к растениям. 4. Выявить характер взаимоотношений эндофитных штаммов B. subtilis с другими видами бактерий, обладающими хозяйственно-полезными признаками. 5. Изучить характер проявления антагонистической активности исследуемых бацилл к микромицетам почвы. 6. Оценить возможность создания нового биофунгицида на основе перспективных эндофитных штаммов. Научная новизна. Впервые изучен характер взаимоотношений эндофитных штаммов B. subtilis, в том числе штамма 26Д – основы биофунгицида фитоспорин-М, с отдельными представителями азотофиксирующих бактерий почвы. Рассмотрен спектр антибиотиков и предложен вероятный механизм проявления антагонистической активности у изучаемых штаммов B. subtilis. Показано, что при поиске эндофитных бактерий для создания биофунгицидов наряду с оценкой их антагонистической активности и способности стимулировать рост растений необходимо исследовать характер взаимодействия с «полезной» почвенной микрофлорой, выживаемость бактерий в почвах разных типов и способность подавлять в них рост фитопатогенных грибов. Обнаружена способность клеток и метаболитов штамма B. subtilis 11В повышать урожайность зеленой массы укропа. Впервые оптимизированы основные параметры культивирования штаммов B. subtilis 26Д и 11В в газовихревом биореакторе нового типа «БИОК», показана возможность использования однотипной схемы производства биофунгицидов на основе эндофитных штаммов бацилл с хозяйственно-полезными свойствами. Практическая значимость работы. Выявление биологических особенностей эндофитных антагонистических штаммов B. subtilis позволяет повысить эффективность поиска и отбора бактерий, перспективных для разработки новых полифункциональных биофунгицидов для сельского хозяйства. Оптимизированные параметры культивирования штаммов в газовихревом биореакторе «БИОК» могут успешно использоваться для наработки биомассы клеток, спор а также метаболитов B. subtilis и производства экспериментальных образцов различных биопрепаратов на основе этих бактерий. 5 Предложен удобный и достаточно точный метод полуколичественного определения антагонистической активности метаболитов бактерий. Эндофитный антагонистичный штамм B. subtilis 11В предложен в качестве основы препарата для повышения устойчивости зеленных культур (укропа) к корневым гнилям, а также урожайности надземной массы растений. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам «Биотехнология в растениеводстве» в Башкирском государственном аграрном университете (г. Уфа) и «Биотехнология растений» в Стерлитамакской государственной педагогической академии им. З. Биишевой (г. Стерлитамак). Основные положения, выносимые на защиту: 1. Антагонистическая активность эндофитных штаммов B. subtilis 49РН, 26Д и 11В к фитопатогенным грибам обусловлена не продукцией ими высокоактивных внеклеточных хитиназ и глюканаз, а связана с синтезом антибиотиков. 2. Суммарная фракция антибиотиков каждого из эндофитных штаммов B. subtilis 49РН, 26Д и 11В в концентрации 0,01 мг/л является сильным ингибитором прорастания семян пшеницы. 3. Эндофитные штаммы B. subtilis, подавляющие рост грибных фитопатогенов отличаются по антагонистичности к некоторым почвенным азотофиксаторам: штаммы 26D и 11В не подавляют рост бактерий Azotobacter chroococcum B1616, A. vinelandii ИБ-1, Azospirillum irakense KBC1, A. lipoferum Sp59b in vitro, тогда как штамм 49РН антагонистичен по отношению к ним. 4. Одним из важных отличий штамма B. subtilis 49РН от менее антагонистичных штаммов 26Д и 11В является пониженная жизнеспособность его спор в выщелоченном черноземе. 5. Бактерии B. subtilis 11В стимулируют рост растений укропа и повышают их устойчивость к корневым гнилям, что вместе с безопасностью штамма для человека делает возможным его использование в качестве основы полифункционального биофунгицида для повышения урожайности этой культуры. Работа выполнена в Башкирском государственном аграрном университете в рамках заказа Минсельхоза России за счет средств Федерального бюджета по теме «Разработка полифункциональных (№ Госрегистрации 01200853490). биофунгицидов для растениеводства» 6 Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на: II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы» (Уфа, 2008); Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов с международным участием «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2009); 5-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегии взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010). Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение; а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 134 страницах, содержит 20 рисунков, 19 таблиц. Список использованных литературных источников включает 209 наименований, в том числе 188 зарубежных. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объект, материалы и методы исследования Объектом исследования служили эндофитные штаммы-антагонисты: B. subtilis 26Д (получен из коллекции ВНИИСХМ, №128) использовался в качестве «эталона»; B. subtilis 11В (получен из коллекции ИБФМ РАН, №ВКМ В-2218Д); B. subtilis 49РН, выделен из внутренних тканей растений пшеницы в лаборатории биотехнологии Башкирского государственного аграрного университета. В качестве фитопатогенных тест-культур при оценке антагонистической активности использовали микромицетов - представителей родов Fusarium, Bipolaris, Penicillum, Botrytis, Mucor и других, полученных из коллекции ДП «БИОФАГ» ГУП «Иммунопрепарат» (г. Уфа). Штаммы бактерий Azospirillum были получены из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН, г. Саратов; штаммы Azotobacter chroococcum, A. vinelandii, Pseudomonas putida и P. aureofaciens – любезно предоставлены д.б.н., проф. О.Н. Логиновым из коллекции 7 микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН (г. Уфа), за что автор выражает ему глубокую благодарность. Антагонизм штаммов по отношению к грибам определяли методом агаровых блоков (Нетрусов, 2005). Антагонистическую активность бактериальных метаболитов оценивали предложенным нами методом двухслойной агаризованной среды. В чашки Петри последовательно вносили: нижний слой питательной среды, бумажный фильтр, равный внутреннему диаметру чашки, второй слой среды, куда по центру чашки помещали стеклянное кольцо, которое после застывания агара фиксировалось, частично выступая над средой. Культуру штаммов высевали внутрь кольца. После инкубирования верхний слой среды вместе с бумажным фильтром, снимали. На нижний слой, содержащий метаболиты, высевали тест-культуру фитопатогена, либо выкладывали агаровые блоки с мицелием гриба. Учитывали площадь зоны роста гриба вокруг блока либо зоны подавления прорастания конидий. Характер взаимоотношений исследуемых штаммов с другими видами бактерий определяли методом перпендикулярных штрихов (Machan et al., 1991) и агаровых блоков. Суммарную фракцию антибиотиков получали глубинным культивированием штаммов в жидких средах различного состава. Культуральную жидкость добавляли в агаризованную питательную среду, поверхность которой засевали конидиями грибов и затем учитывали их прорастание. Для получения порошка метаболитов, содержащих антибиотики, культуральную жидкость подкисляли 6N HCl до рН 2,0. Осадок отделяли центрифугированием, перерастворяли в 96%-ном этаноле, центрифугировали, надосадок упаривали. Экстракты из нейтрализованного после подкисления остатка культуральной жидкости и вегетативных клеток штаммов получали, используя в качестве экстрагентов хлороформ и метанол. Анализ антибиотиков проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Shimadzu LC-20 (Shimadzu, Япония) с диодноматричным детектором. Две колонки Luna Silica 250х4,6 мм, 5 мкм (Phenomenex, США) соединяли последовательно. В качестве подвижной фазы использовали элюент состава ацетонитрил:вода=85:15. Скорость потока составляла 1 мл/мин. В качестве стандартов использовали сурфактин и итурин (Sigma, США). Активность глюканазы, хитиназы, целлюлазы и пектиназы определяли реакцией с динитросалициловой кислотой (Хазиев, 2005). В качестве субстратов 8 использовали, соответственно, ламинарин, коллоидный хитин из панцирей крабов, карбоксиметилцеллюлозу, яблочный пектин (Sigma, США). Активность протеаз определяли с азоказеином (Sigma, США) (Griffen et al., 1997). Влияние B. subtilis на рост растений определяли, обрабатывая их семена суспензией спор или метаболитами штаммов и проращивая на влажной фильтровальной бумаге в темноте. У проростков измеряли длину корня и побега. Для изучения антагонизма эндофитных штаммов по отношению к микромицетам в почве навески чернозема (10 г) обрабатывали суспензией бактериальных спор. Через двое и трое суток методом предельных разведений производили подсчет количества грибных пропагул в почве. Для определения жизнеспособности эндофитов в почвах получали стрептомицин-устойчивые мутанты. Навески почв инокулировали спорами мутантов из расчета 106 КОЕ/г почвы. На 3, 6 и 9 сутки эксперимента производили посев почвенной суспензии на поверхность среды со стрептомицином и определяли показатель КОЕ. Для глубинного культивирования в газовихревом биореакторе «БИОК» (ЗАО «Саяны», г. Новосибирск) использовали полусинтетическую среду (Недорезков, 2003). Управление процессом культивирования осуществляли с помощью программы Quadrus Lonet. Среду аэрировали компрессором, снабженным регулятором скорости воздушного потока. В пробах определяли рН, концентрацию клеток, проводили микроскопирование культуры. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью стандартных программ пакета Microsoft Office, данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В 2005-2006 гг. с целью разработки новых эффективных биофунгицидов в лаборатории биотехнологии Башкирского ГАУ из внутренних тканей растений пшеницы было выделено около 50-ти штаммов B. subtilis с высокой антагонистической активностью по отношению к широкому спектру фитопатогенных грибов. Однако данные, полученные Т.С. Мининой с соавт. (2007), показали, что препараты на основе некоторых высокоантагонистичных эндофитных штаммов B. subtilis, в т.ч. самого сильного антагониста 49РН, не обеспечивали существенного снижения поражения растений корневыми гнилями и прибавки урожайности зерна по сравнению со 9 слабым антагонистом – «эталонным» коммерческим штаммом B. subtilis 26Д. Таким образом, было выявлено, что наличие у штаммов B. subtilis высокой антагонистической активности к фитопатогенам и способность стимулировать рост растений в лабораторных условиях не является достаточным критерием отбора бактерий для создания биофунгицидов. Это побудило нас к детальному сравнительному изучению биологической активности «эталонных» слабоантагонистичных и одного из новых высокоантагонистичных штаммов бацилл. Сравнительная антагонистическая активность эндофитных штаммов B. subtilis. Исследуемые штаммы проявляли различную степень антагонистической активности к фитопатогенным грибам. При использовании метода агаровых блоков самым сильным антагонистом против большинства грибов был штамм 49РН, наиболее слабым – штамм 11В (табл. 1). Таблица 1 – Антагонистическая активность исследуемых штаммов Тест-организм Alternaria alternata Bipolaris sorokiniana Botrytis aclada B. byssoidea B. cinerea Cladosporium sp. Fusarium avenaceum F. sporotrichiella F. moniliforme F. culmorum F. oxysporum Penicillum lividium Размеры зоны угнетения роста грибов исследуемым штаммом, мм×мм B. subtilis 26Д B. subtilis 49РН B. subtilis 11В 25×27 32×34 20×22 ПП ПП ПП 10×11 15×16 СА 21×23 25×27 18×20 17×18 12×15 14×12 12×13 16×20 9×10 11×11 14×15 11×10 13×14 20×20 9×9 10×10 15×20 10×12 12×18 24×26 14×15 11×11 20×22 10×10 20×20 8×8 СА Примечание: СА - слабо выраженный антагонизм; ПП - полное подавление роста тест-организма. Синтез и выделение штаммами в среду антагонистичных метаболитов происходит и в отсутствии фитопатогенов (табл. 2). Однако при росте на плотной среде в отсутствии грибов различия в фунгистатической активности у бактериальных метаболитов оказались менее выраженными, что, вероятно, указывает на различия в спектре синтеза или активности бактериальных фунгистатиков в присутствии и отсутствии гриба. Мы также выяснили, что самая высокая антагонистическая активность 10 метаболитов штаммов проявляется при их выращивании в картофельно-глюкозном бульоне. Анализ фракций метаболитов выявил, что антибиотической активностью обладал только экстракт, осажденный из культуральной жидкости соляной кислотой. Его мы использовали в дальнейших экспериментах. Таблица 2 – Антагонистическая активность метаболитов исследуемых штаммов при росте на плотной питательной среде Вариант Площадь зоны роста, мм2* % от контроля F. avenaceum контроль F. avenaceum + 26D F. avenaceum + 49РН F. avenaceum + 11В F. culmorum контроль F. culmorum + 26D F. culmorum + 49РН F. culmorum + 11В F. sporotrichioides контроль F. sporotrichioides + 26D F. sporotrichioides + 49РН F. sporotrichioides + 11В 202±12,1 5±0,4 5±0,6 7±0,8 527±26,4 30±1,2 28±1,3 37±2,2 410±18,5 27±1,8 16±1,5 28±1,9 100 2 2 3 100 6 5 7 100 7 4 7 Примечание: * - учитывалась площадь зоны роста тест-организма вокруг блока на среде с метаболитами без площади агарового блока. Возможные механизмы проявления антагонистической активности эндофитными штаммами B. subtilis. Существует два основных механизма подавления роста микроорганизмов антагонистичными бактериями (Stein, 2005) – за счет выделения антибиотиков с бактерицидным или фунгицидным эффектом и за счет действия внеклеточных гидролаз, например хитиназ, хитозаназ и глюканаз (Логинов, 2001; Актуганов, 2003; Мелентьев, 2008). Для оценки наличия у штаммов первого механизма мы провели анализ фракции антибиотиков. По данным ВЭЖХ у штаммов 26Д и 11В один из преобладающих антибиотиков был из группы сурфактина (рис. 1 а, б), тогда как штамм 49РН преимущественно синтезировал вещество, близкое к сурфактину по времени удержания на колонке, однако обладающее совершенно другим спектром поглощения (рис. 1 в). Вероятно, именно оно и обуславливает высокую антагонистическую активность штамма 49РН. В среде культивирования штаммов отсутствовала четко регистрируемая активность хитиназ, глюканаз, целлюлаз и пектиназ. 11 Активность протеаз штаммов отражена на рисунке 2. Штамм 49РН проявил высокую протеолитическую активность, штамм 11В - наиболее низкую. Максимум активности протеаз у штамма 49РН отмечен в 12-часовой пробе, тогда как у штаммов 26Д и 11В – на более поздних стадиях культивирования. Не исключено, что высокая активность протеаз у штамма 49РН с одной стороны может быть одним из факторов, подавляющих рост фитопатогенных грибов, а с другой – негативно действующих и на клетки самих растений. mAU 2 500 250 5 12 10 14 17 16 19 4 6 9811 1315 18 20 7 3 0 а) 1 0.0 5.0 mAU 300 10.0 15.0 мин 15.0 мин 15.0 мин 2 200 11 100 14 12 6 10 4 3 5 8 13 79 1 151618 17 19 5.0 10.0 0 б) 0.0 mAU 2 400 300 200 100 0 в) 0.0 1 3 46 10 8 12 14 15 5 9 1113 16 7 5.0 10.0 17 Рис. 1. Хроматограммы суммарной фракции антибиотиков штаммов: а) B. subtilis 11В (2 - сурфактин); б) B. subtilis 26Д (2 - сурфактин); в) B. subtilis 49РН Биологическая активность метаболитов B. subtilis по отношению к растениям. В лабораторных экспериментах нами установлено, что метаболиты всех трех штаммов в очень низкой концентрации – 0,01 мг/л многократно в сравнении с контролем подавляют рост проростков пшеницы (рис. 3 а, б). 12 Рис. 2. Активность протеаз штаммов B. subtilis. - B. subtilis 26Д, - B. subtilis 11В - B. subtilis 49РН, а) б) Рис. 3. Влияние различных концентраций суммарной фракции антибиотиков штаммов на рост корней (а) и побегов (б) проростков пшеницы. - B. subtilis 49РН, - B. subtilis 26D, - B. subtilis 11В - контроль, 13 Наибольшая ингибирующая активность проявилась у метаболитов штамма 49РН. При снижении концентрации метаболитов наблюдался обратный эффект – стимуляция роста проростков, причем штамм 49РН превосходил по этой способности штамм 11В. Таким образом, для проявления высокой антагонистической активности штаммами необходима высокая плотность их клеток на поверхности семян растений, в то же время повышение концентрации бактериальных клеток приводит к ингибированию роста растений. Для штамма 49РН, как одновременно сильного антагониста фитопатогенов и ингибитора роста растений такое противоречие свойств, вероятно, отражается в снижении эффективности его применения в полевых условиях. В этих экспериментах у штамма B. subtilis 11В неожиданно проявилась способность стимулировать рост корней укропа даже при высокой концентрации клеток (10 9 кл/мл). Таким образом, стимуляция роста растений эндофитными штаммами зависит не только от концентрации клеток, но и штамма бактерий. Взаимоотношения эндофитных штаммов B. subtilis с другими видами бактерий с хозяйственно-полезными признаками. На данном этапе исследования нами методом штрихов было выявлено, что штаммы 26Д и 11В имеют нейтральные отношения с большей частью протестированных микроорганизмов. Штамм 49РН, напротив, проявлял антагонистическую активность ко всем тест-микроорганизмам, кроме бактерий рода Pseudomonas. Бактерия P. aureafaciens (основа биофунгицида «Елена») оказалась способна в значительной степени подавлять жизнедеятельность всех трех эндофитных бацилл. С целью полуколичественного определения антагонистической активности штамма 49РН и подтверждения отсутствия таковой у штаммов 26Д и 11В мы повторили эксперимент, используя метод агаровых блоков (табл. 3). Штамм 49РН проявляет наиболее выраженный антагонистический эффект по отношению к бактериям рода Azospirillum, в меньшей степени – к бактериям рода Rhizobium и Azotobacter. Таким образом, вполне вероятно, что подобное действие штамма 49РН на полезную микрофлору может воспроизводиться в почве, обуславливая негативное влияние на взаимоотношения растений с азотфиксаторами и снижая тем самым продуктивность сельскохозяйственных культур. 14 Изучение проявления антагонизма штаммов к микромицетам в почве. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что стремление повысить эффективность биофунгицида путем увеличения в нем концентрации клеток может отрицательно сказаться на продуктивности растений из-за ингибирования их роста метаболитами бацилл. Однако эти выводы не дают объяснения того, что высокоантагонистичный штамм 49РН не обеспечивает высокую степень защиты растений от корневых гнилей при высоком титре клеток в препарате (Минина и др., 2007). Таблица 3 – Антагонистическая активность эндофитных штаммов B. subtilis по отношению к хозяйственно-полезным видам бактерий Вариант A. chroococcum B1616 + B.s. 49РН A. chroococcum B1616 + B.s. 26Д A. chroococcum B1616 + B.s. 11В A. vinelandii ИБ-1 + B.s. 49РН A. vinelandii ИБ-1 + B.s. 26Д A. vinelandii ИБ-1 + B.s. 11В A. irakense KBC1 + B.s. 49РН A. irakense KBC1 + B.s. 26Д A. irakense KBC1 + B.s. 11В A. lipoferum Sp59b + B.s. 49РН A. lipoferum Sp59b + B.s. 26Д Зона подавления роста, мм2 255±11,5 0 0 177±13,3 0 0 незначительно 0 0 111±10,9 Вариант A. lipoferum Sp59b + B.s. 11В P. aureofaciens ИБ-6 + B.s. 49РН* P. aureofaciens ИБ-6 + B.s. 26Д* P. aureofaciens ИБ-6 + B.s. 11В* P. putida ИБ-56 + B.s. 49РН P. putida ИБ-56 + B.s. 26Д P. putida ИБ-56 + B.s. 11В R. leguminosarum 1078 + B.s. 49РН R. leguminosarum 1078 + B.s. 26Д R. leguminosarum 1078 + B.s. 11В Зона подавления роста, мм2 0 0 0 0 154±9,7 0 0 123±6,2 0 0 0 Примечание: * - антагонистичным является сам тест-объект. Для поиска ответа на этот вопрос мы изучили особенности проявления антагонистической активности бацилл по отношению к микромицетам в почве, значительная часть которых может быть представлена фитопатогенными видами. Обработка почвы спорами штамма 49РН независимо от их концентрации приводила к росту в 1,5-4 раза числа грибных пропагул в почве по сравнению с остальными вариантами 15 опыта и контролем (табл. 4). В то же время штаммы 26Д и 11В эффективно снижали число жизнеспособных микромицетов в почве, особенно на вторые сутки опыта. С целью уточнения полученных данных мы изучили динамику сохранения жизнеспособности у стрептомицин-устойчивых мутантов исследуемых штаммов в почвах разных типов (табл. 5). Таблица 4 – Влияние обработки почвы спорами различных штаммов B. subtilis на численность микромицетов Вариант Контроль 49РН, 104 кл* 49РН, 106 кл 26Д, 104 кл 26Д, 106 кл 11В, 104 кл 11В, 106 кл Количество пропагул грибов, 104 КОЕ в 1 г почвы Вторые сутки Третьи сутки 1,4 ± 0,13 1,5 ± 0,20 2,1 ± 0,23 2,5 ± 0,35 2,3 ± 0,18 2,6 ± 0,33 0,9 ± 0,09 1,3 ± 0,14 0,5 ± 0,06 1,1 ± 0,17 1,0 ± 0,11 1,1 ± 0,15 0,7 ± 0,06 1,0 ± 0,18 Примечание: * - указана конечная концентрация клеток на 1 грамм почвы. В результате было выявлено, что клетки B. subtilis 49РН плохо выживают в черноземах; численность жизнеспособных клеток штамма снизилась за 6 суток с 1 млн. до 4. тыс. КОЕ/г почвы. В серой лесной почве количество жизнеспособных клеток штамма с 3 по 6 сутки выросло на 26 тыс. Численность клеток штаммов 26Д и 11В, напротив, увеличивалась в черноземе, а в серой лесной почве снижалась. Таким образом, второй причиной низкой эффективности штамма B. subtilis 49РН в подавлении развития корневых гнилей пшеницы в полевых опытах, проведенных на черноземах (Минина и др., 2007), является снижение выживаемости клеток этого штамма в данном типе почв. Таблица 5 – Динамика численности стрептомицин-устойчивых мутантов исследуемых штаммов в почвах разных типов Вариант 49РН чернозем 49РН серая лесная 26Д чернозем 26Д серая лесная 11В чернозем 11В серая лесная Концентрация КОЕ/г почвы, × 105 3 сутки 6 сутки 0,15 ± 0,03 0,04 ± 0,01 0,78 ± 0,13 1,04 ± 0,20 2,05 ± 0,31 4,37 ± 0,61 1,39 ± 0,26 0,80 ± 0,18 1,15 ± 0,25 2,04 ± 0,31 0,93 ± 0,15 0,78 ± 0,14 16 Разработка биофунгицида на основе штамма B. subtilis 11В для повышения устойчивости и продуктивности зеленных культур. Согласно полученным результатам штамм B. subtilis 11В, проявивший слабый антагонизм по отношению к фитопатогенным грибам, в значительной степени стимулировал рост растений укропа при обработке семян, при этом не угнетал развитие представителей полезной микрофлоры, и, кроме того, стрептомицин-устойчивый мутант проявлял высокую жизнеспособность в почве, что может свидетельствовать о его конкурентоспособности в естественных условиях. В связи с этим нами были проведены дополнительные эксперименты по изучению влияния штамма 11В и его метаболитов на рост растений укропа в условиях закрытого грунта. В качестве эталонного препарата использовали фитоспорин-М, действующим агентом которого является штамм B. subtilis 26Д. В ходе эксперимента было выявлено, что опрыскивание молодых растений препаратом на основе клеток штамма 11В приводит к двукратному увеличению зеленой массы по сравнению с контролем (табл. 6). Таблица 6 – Влияние обработки укропа препаратами на основе спор и метаболитов штамма B. subtilis 11В на биомассу растений Вариант Контроль Фитоспорин-М В. subtilis 11В Метаболиты неразведенные. Метаболиты разведенные в 10 раз Масса 10 растений (г): корня побега 0,31 ± 0,07 4,46 ± 0,12 0,22 ± 0,08 5,46 ± 0,14 0,38 ± 0,11 8,95 ± 0,05 0,36 ± 0,04 6,27 ± 0,09 0,32 ± 0,05 6,61 ± 0,07 При этом действие штамма 11В на корни укропа оказалось гораздо менее выраженным, хотя при обработке семян наблюдалось обратное. Вероятно, это связано с изменением реакции растений на способ обработки и, следовательно, места первичного нахождения микроорганизма. При обработке семян бактерии могут преимущественно колонизировать корни проростков и, соответственно, в большей степени воздействовать на рост именно подземных органов растения. При опрыскивании растений по вегетации бактерии попадают непосредственно на листья и стебли растений, и именно эти органы проявляют большую отзывчивость на воздействие препаратов. Интересными также оказались данные, полученные при оценке распространенности корневых гнилей укропа (рис. 4). Штамм 11В проявил хорошие защитные свойства, несмотря на невысокую антагонистическую активность in vitro. Эти данные 17 свидетельствуют, что способность микроорганизмов эффективно осуществлять биоконтроль фитопатогенов не всегда может быть обнаружена в классических тестах in vitro, поскольку такие опыты не позволяют выявить все возможные способы взаимодействия между микроорганизмами, в частности, конкуренцию за экологическую нишу или источники питания. При этом в почве указанные выше механизмы биоконтроля, вероятно, могут играть не менее важную роль, чем продукция гидролитических ферментов и/или антибиотиков. На основании полученных данных штамм B. subtilis 11В рекомендован в качестве основы биологического препарата комплексного действия для обработки растений укропа в условиях закрытого грунта. Рис. 4. Распространенность корневых гнилей укропа Разработка схем культивирования штамма B. subtilis 11В и производства биофунгицида на его основе. В связи с возможностью применения штамма 11В в качестве основы биопрепарата нами была отработана схема культивирования данного эндофита в газовихревом биореакторе нового поколения «БИОК» (ЗАО «Саяны», г. Новосибирск). Основные преимущества биореактора газовихревого типа над классическими моделями – максимально сниженное механическое воздействие на клетки, отсутствие «застойных зон» с замедленным массообменном и пониженное энергопотребление обусловили выбор биореактора «БИОК» для культивирования эндофитных штаммов B. subtilis. Предварительно параметры процесса были апробированы для штамма B. subtilis 26Д, сведения об условиях культивирования которого при производстве препарата фитоспорин-М нам были уже известны. Наиболее подходящей питательной средой по различным критериям оказалась полусинтетическая среда (ПСС) постоянного состава. Было исследовано влияние скорости вращения активатора от 18 1800 об/мин до 2350 об/мин (предельное по характеристике реактора значение – 2400) на динамику роста и спорообразование бактерий при культивировании в 4 л среды (80% от максимальной загрузки) и расходе воздуха 1л воздуха/л среды в минуту. Установлено, что скорость роста культуры и объем биомассы клеток B. subtilis 26Д прямо пропорциональны скорости перемешивания культуральной среды (рис. 5). Далее было изучено влияние различной интенсивности аэрации среды на скорость роста, спорообразование и концентрацию клеток при одинаковой скорости вращения перемешивающего устройства (2350 об/мин). Выявлено, что наибольше число спор (близкое к 100%) и наивысший их титр наблюдается при интенсивности подачи воздуха 0,9-1,0 л/л в минуту (рис. 6). Таким образом, нами были определены значения отдельных параметров культивирования эндофитного штамма B. subtilis 26Д в газовихревом биореакторе «БИОК». Рис. 5. Зависимость роста концентрации клеток штамма B. subtilis 26Д от скорости перемешивания среды (об/мин). - 1800, - 2000, - 2150, - 2350 Оптимизированная схема культивирования была использована при культивировании штамма B. subtilis 11В (рис. 7). Выяснено, что, несмотря на незначительные различия в способности микроорганизмов расти и образовывать споры в описанных условиях, предложенная B. subtilis 11В. схема применима для культивирования штамма 19 Рис. 6. Зависимость роста концентрации клеток штамма B. subtilis 26Д от интенсивности аэрации среды (л воздуха/л ПС в минуту). - 0,5, - 0,9, - 1, - 1,3 л, - 1,4 Рис. 7. Динамика роста концентрации клеток штаммов B. subtilis 26Д ( ) и B. subtilis 11В ( ) при культивировании в биореакторе «БИОК» Таким образом, на основе штамма B. subtilis 11В и его метаболитов нами предлагается биопрепарат для использования в качестве стимулятора роста растений и биофунгицида, способный при обработке семян и вегетирующих растений укропа существенно повышать зеленую массу культуры в условиях закрытого грунта. В лабораторных условиях разработана технология производства биопрепарата в газовихревом биореакторе «БИОК». 20 Выводы 1. Сравнительная оценка антагонистической активности эндофитных штаммов B. subtilis 11В, B. subtilis 26Д, B. subtilis 49РН к фитопатогенным грибам показала, что проявление антагонизма бактериями связано не с продукцией ими гидролитических ферментов – хитиназ и глюканаз, а с синтезом антибиотиков, в том числе группы сурфактина. 2. Выявлено, что фракция метаболитов изученных штаммов бактерий, содержащая антибиотики в концентрации 0,01 мг/л проявляет высокую ингибирующую рост растений активность. Повышение концентрации клеток эндофитов в биопрепаратах для обработки семян с одной стороны усиливает их фунгицидную активность, а с другой – подавляет рост растений. 3. Установлено, что штаммы B. subtilis 26Д и B. subtilis 11В не проявляют антагонизма к изученным штаммам хозяйственно-полезных бактерий A. chroococcum, A. vinelandii, A. irakense, A. lipoferum, P. aureofaciens, P. putida, R. leguminosarum, тогда как штамм B. subtilis 49РН подавляет их рост. 4. Показано, что эндофитные штаммы B. subtilis могут различаться по жизнеспособности в почвах различных типов и, как следствие, по способности подавлять развитие почвенных микромицетов в естественных условиях. 5. Установлено, что штамм B. subtilis 11В в определенных концентрациях способен стимулировать рост растений укропа и повышать их устойчивость к корневым гнилям. Данный штамм предлагается в качестве основы биопрепарата для повышения продуктивности культуры и защиты ее от фитопатогенных грибов в условиях закрытого грунта. 6. Впервые оптимизированы основные параметры культивирования эндофитных штаммов B. subtilis в биореакторе газовихревого типа и предложена технология производства биофунгицидов на их основе в лабораторных условиях. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Лукьянцев, М.А. Изучение способов культивирования штамма бактерии Bacillus subtilis 26Д в газо-вихревом биореакторе / М.А. Лукьянцев, Р.М. Хайруллин // Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы: Материалы II Всероссийской научнопрактической конференции молодых ученых и аспирантов, 14-16 апреля, 2008. – Уфа, 2008. – С. 49. 21 2. Лукьянцев, М.А. Разработка полифункционального биофунгицида «СТАРТ» на основе эндофитного штамма Bacillus subtilis 11ВМ / М.А. Лукьянцев, А.А. Егоршина, Н.А. Уразбахтина, Р.М. Хайруллин // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы пятого московского международного конгресса, 16-20 марта, 2009. – Москва, 2009. – С. 239-240. 3. Лукьянцев, М.А. Оптимизация состава питательной среды для продукции фунгицидных и фунгистатических веществ эндофитным антагонистом Bacillus subtilis 49РН / М.А. Лукьянцев, А.А. Егоршина, Д.Р. Кутлубердина, Р.М. Хайруллин // Симбиоз Россия 2009: Материалы II Всероссийского конгресса студентов и аспирантовбиологов с международным участием, 25-29 мая, 2009. – Пермь, 2009. – С. 47. 4. Лукьянцев, М.А. Эндофитный штамм Bacillus subtilis 49РН как перспективная основа нового биофунгицида / М.А. Лукьянцев, А.А. Егоршина, Р.М. Хайруллин // Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 1-2 декабря, 2009. – Киров, 2009. – С. 42. 5. Лукьянцев, М.А. Оптимизация параметров культивирования штамма Bacillus subtilis 26Д в газо-вихревом биореакторе «БИОК» / М.А. Лукьянцев, Р.М. Хайруллин, Р.Ш. Захарова, Н.А. Уразбахтина // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2009. – Спецвыпуск. – С. 466-468. 6. Лукьянцев, М.А. Мобилизация нерастворимых неорганических фосфатов эндофитными штаммами Bacillus subtilis / А.А. Егоршина, М.А. Лукьянцев, Р.М. Хайруллин // Материалы XII съезда Общества микробиологов Украины им. С.М. Виноградского, 25-30 мая, 2009. – Ужгород, 2009. – С. 302. 7. Лукьянцев, М.А. Влияние эндофитных антагонистических штаммов Bacillus subtilis на некоторые виды бактерий / М.А. Лукьянцев, Р.М. Хайруллин // Стратегии взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы V Всероссийской конференции молодых ученых 28 сентября – 1 октября, 2010. – Саратов, 2010. – С. 99. 8. Хайруллин, Р.М. Некоторые причины низкой эффективности использования высокоантагонистичных эндофитных штаммов Bacillus subtilis в качестве основы биофунгицидов / Р.М. Хайруллин, М.А. Лукьянцев, Н.А. Уразбахтина // Вестник Казанского государственного аграрного университета. – 2010. – № 3 (17). – С. 146–149.
