ВВЕДЕНИЕ - Институт цитологии и генетики СО РАН

На правах рукописи
КОНДАУРОВА
ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА
АССОЦИАЦИЯ МЕЖДУ НАСЛЕДСТВЕННОЙ
ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К КАТАЛЕПСИИ У МЫШЕЙ И ДРУГИМИ
ФОРМАМИ ЗАЩИТНОГО ПОВЕДЕНИЯ
03.00.15 ГЕНЕТИКА
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических
наук
Новосибирск
2007
1
Работа выполнена в лаборатории нейрогеномики поведения, Институт цитологии и
генетики СО РАН, г. Новосибирск
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
Попова Нина Константиновна,
Институт цитологии и генетики
СО РАН,
г. Новосибирск
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
Бородин Павел Михайлович,
Институт цитологии и генетики
СО РАН,
г. Новосибирск
доктор биологических наук,
Дубровина Нина Ивановна,
ГУ НИИ физиологии СО РАМН,
г. Новосибирск
Ведущее учреждение:
Московский Государственный Университет
им. М.В. Ломоносова, г. Москва
Защита диссертации состоится «__» ________ 2007г. на утреннем заседании
диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени
доктора наук (Д  003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в
конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева,
10, тел. (383)-333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и
генетики СО РАН.
Автореферат разослан «__» __________2007г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
А.Д. Груздев
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Выявление молекулярных и физиологических механизмов трансдукции,
закодированной в ДНК информации в сложный поведенческий признак, является
главной задачей нейрогеномики поведения, в которой соприкасаются важнейшие
проблемы других фундаментальных биологических наук - физиологии, этологии,
молекулярной биологии, генетики и эволюционного учения.
Одним из основных подходов к анализу наследования поведения является
селекция животных на определенный вид поведения из аутбредной популяции
(Трут, 1978; Корочкин, Михайлов, 2000). Этот метод широко используется для
изучения молекулярных и физиологических механизмов регуляции поведения.
Проблеме селекционной роли поведения посвящены исследования механизмов
эволюционно-генетических преобразований домашних животных (Беляев, 1972).
Дарвин, оказавший подлинно революционизирующее влияние на биологию, отметил
в «Происхождении видов» важное эволюционное значение соотносительной
(коррелятивной) изменчивости возникающей при селекции по поведению. В
последарвиновский период большим количеством экспериментально-генетических
исследований было показано, что отбор по какому-либо одному признаку приводит
к появлению других, порою совершенно неожиданных, коррелятивных признаков и
функций, причем особенно многочисленных и разнообразных при селекции по
поведению (Беляев, 1962).
Возникающие при селекции по поведению коррелятивные признаки в
дальнейшем нередко становятся основным объектом изучения и могут представлять
интерес в области моделирования различных психопатологий (Overstreet, 1993). В
тоже время механизмы возникновения коррелятивных признаков остаются до сих
пор не ясными и представляют большой интерес для нейрогенетических
исследований.
К настоящему моменту в рамках программ «геном человека», «геном мыши» и
«геном крысы» секвенировали и провели сравнительный анализ геномов мыши,
крысы и человека. Была показана высокая степень их гомологии между собой. Это
дает большую возможность использовать сравнительные молекулярно-генетические
подходы для изучения генетической структуры поведения животных и человека, а
также повышает ценность различных лабораторных линий грызунов в качестве
моделей человеческих заболеваний (Waterston et al., 2002; Gibbs et al., 2004), которые
становятся ключевым экспериментальным инструментом для биомедицинских
исследований (Paigen, 1995; Rossant, McKerlie, 2001; Waterston et al., 2002).
Поведение животного обусловлено определенной нейрохимической регуляцией,
и селекция животных по конкретному типу поведения по существу является отбором
на определенный тип нейрохимизма мозга, на определенную функциональную
активность систем мозга и метаболизм медиаторов, участвующих в регуляции
данного поведения (Попова и др., 1980).
Так, селекция крыс на предрасположенность к пассивно-оборонительному типу
реагирования (предрасположенная к каталепсии линия крыс ГК – Генетические
Каталептики) привела к появлению ряда черт поведения и физиологических
признаков, сходных с наблюдаемыми при депрессивных расстройствах (Барыкина и
др., 1983; Колпаков и др., 2004). У этих животных наблюдаются изменения в
серотониновой системе мозга (Popova, Kulikov, 1995; Kolpakov et al., 1996, 2001),
обнаружено уменьшение содержания нейромедиатора серотонина и его метаболита
3
5-гидроксииндоуксусной кислоты (5-ГИУК) во фронтальной коре, найдены
изменения и на уровне рецепторного аппарата. Так, показано, что у крыс ГК
снижена плотность 5-НТ1А серотониновых рецепторов в некоторых отделах мозга
(Попова и др., 1996). То, что серотониновые рецепторы вовлечены в механизмы
каталепсии, подтверждают также данные о способности агонистов 5-НТ1А
рецепторов 8-ОН-DPAT и флезиноксана предотвращать экспрессию реакции
замирания у крыс ГК (Kulikov et al., 1994).
Перспективной моделью нейрогенетических исследований регуляции каталепсии
и ее взаимосвязи с другими защитными формами поведения являются
селекционированные мыши на предрасположенность к каталепсии. Наличие
высокой гомологии геномов крысы и мыши позволяет предположить, что у
животных в регуляции реакции замирания и возникновении коррелятивных
признаков будут лежать схожие механизмы.
Целью данной работы было изучение генетической структуры каталепсии у
мышей, селекционированных на предрасположенность к реакции замирания,
влияния селекции на проявление коррелятивных признаков и исследование
возможных генетических и физиологических механизмов, лежащих в основе их
проявления. Для выполнения цели исследования были поставлены следующие
задачи:
1) Изучить влияние селекции мышей на высокую предрасположенность к
каталепсии на изменения параметров этого признака.
2) Исследовать особенности генотипов селекционированных животных, составить
карту распределения фрагментов хромосом родительских линий AKR и CBA на
19 аутосомах селекционированных мышей при помощи набора полиморфных
микросателлитных маркеров и выявить хромосомную локализацию минорных
генов, участвующих в регуляции предрасположенности к каталепсии.
3) Исследовать влияние селекции на другие защитные формы поведения: агрессию,
депрессивноподобное поведение, реакцию страха на внезапный акустический
сигнал и тревожность.
4) Сравнить функциональную активность 5-НТ1А рецептора нейромедиатора
серотонина у селекционируемых мышей и родительских линий.
Научная новизна.
 Впервые показано, что селекция мышей на каталепсию привела к проявлению
коррелятивных поведенческих признаков: депрессивноподобному поведению,
снижению агрессии и повышению рефлекторной реакции вздрагивания на
акустический сигнал.
 Селекция на каталепсию зафиксировала у селекционируемых мышей локус ДНК,
полученный от каталептической линии СВА и тесно связанного с геном 5-HT1A
рецептора. Впервые экспериментально показано вовлечение 5-НТ1А рецептора в
селекцию на поведение.
 Линия селекционируемых мышей была прокартирована с помощью 50
полиморфных микросателлитных маркеров, и составлена карта их наследования
от родительских линий СВА и AKR.
Научно-практическая ценность.
Обнаружено, что селекция мышей на предрасположенность к каталепсии
приводит к проявлению ряда коррелятивных признаков, таких как снижение
агрессивного поведения, повышение акустической реакции вздрагивания и
депрессивноподобное поведение. Изучение коррелятивных признаков способствует
4
более глубокому пониманию генетических и физиологических механизмов,
лежащих в основе регуляции каталепсии, и связи между ней, агрессией, реакцией
страха и депрессивноподобным поведением. Результаты, полученные при
исследовании поведения селекционируемых мышей, свидетельствуют о
соответствии животных одному из основных критериев, предъявляемых к моделям
депрессии – сходство проявлений (face validity). Показано, что селекция мышей на
предрасположенность к каталепсии приводит к закреплению микросателлитного
маркера D13Mit76, полученного от каталептической родительской линии СВА и
сцепленного с геном 5-НТ1А рецептора нейромедиатора серотонина. В то же время
селекционируемые мыши наследуют повышенную функциональную активность
этого рецептора, что привлекает внимание к более детальному изучению функции 5НТ1А рецепторов и их роли в регуляции каталепсии и проявлении коррелятивных
признаков. Полученные мыши со стабильно высокой долей каталептиков были
прокартированы с помощью 50 полиморфных микросателлитных маркеров и
составлена карта генома мышей, что может быть использовано для выявления
локусов, контролирующих «депрессивные» черты, реакцию страха и агрессивность у
мышей.
Положения, выносимые на защиту.
1. Селекция на высокую предрасположенность к каталепсии привела появлению
депрессивноподобного поведения, снижения агрессивного поведения, повышению
амплитуды акустического рефлекса вздрагивания. Повышенную амплитуду
рефлекса вздрагивания и депрессивноподобное поведение можно рассматривать как
закономерный коррелятивный ответ при селекции на каталепсию у грызунов,
поскольку у крыс ГК, селекционированных на этот же признак, также наблюдается
повышенная амплитуда рефлекса вздрагивания и депрессивноподобное поведение
(Popova et al., 2000; Колпаков и др., 2004). Возможно, что в основе регуляции
каталепсии, депрессивноподобного поведения и амплитуды рефлекса вздрагивания
лежат сходные механизмы.
2. Селекция на каталепсию закрепила у селекционируемых мышей аллель
микросателлитного маркера D13Mit76, полученного от родительской линии СВА и
тесно сцепленного с геном 5-HT1A рецепторов, и высокую функциональную
активность этого рецептора, что хорошо согласуется с проявлением коррелятивных
признаков, так как известно, что 5-НТ1А рецептор вовлечен в регуляцию
агрессивного
поведения,
акустического
рефлекса
вздрагивания
и
депрессивноподобного поведения у грызунов (Nanry, Tilson, 1989; Overstreet, 1993;
Olivier et al., 1995). Это дает основание считать ген, кодирующий 5-HT1A рецептор,
наиболее вероятным молекулярным звеном между каталепсией, агрессией,
депрессивноподобным поведением и рефлексом вздрагивания.
3. Составлена карта распределения фрагментов хромосом родительских линий
СВА и AKR в геноме селекционируемых мышей. Карта генома мышей может
явиться основой для выявления локусов, контролирующих депрессивноподобные
черты, реакцию страха и агрессивность у мышей.
Апробация работы.
Результаты данной работы были представлены и обсуждены на Отчетных
Сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в 2006, 2007 годах, ХLII
международной научной студенческой конференции “Студент и научнотехнический прогресс” (Новосибирск, 2004), съезде “Генетика в XXI веке:
современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004), VII Всероссийской
5
медико-биологической конференции молодых исследователей “Человек и его
здоровье” (Санкт-Петербург, 2004), V Сибирском физиологическом съезде (Томск,
2005), Международной летней школе по нейрогенетике поведения (Москва, 2005),
Международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006),
Международной конференции по биологической психиатрии «Стресс и Поведение»
(Санкт-Петербург, 2007).
Публикации.
Материал диссертации представлен в 11 публикациях, в том числе в 4 статьях в
реферируемых журналах.
Структура и объем работы.
Работа изложена на 105 страницах, содержит 11 рисунков, 7 таблиц и включает
все необходимые разделы: введение, обзор литературных данных, материалы и
методы, результаты и их обсуждение, выводы и список использованной литературы
(235 ссылок).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Животные. В работе использовались высоко инбредные и контрастные по
предрасположенности к каталепсии линии мышей СВА/Lac (каталептическая линия)
и AKR/J (некаталептическая линия), поддерживающиеся более 50 поколений в
виварии ИЦиГ СО РАН, а также их гибриды.
Селекционный эксперимент включал отбор и скрещивание бэккроссовкаталептиков из разных семей для предотвращения инбридинга, отбор и
скрещивание каталептических мышей первого поколения селекции S1 из разных
семей. Аналогично получали мышей S3 и S4. При получении последующих
поколений селекции был введен братско-сестринский инбридинг: производился
отбор и скрещивание мышей-каталептиков из одной семьи. Начиная с S9, селекция
была прекращена, а инбридинг продолжался. В настоящее время получено
поколение S19.
Каталепсия вызывалась зажимом в течение 5 сек кожи шеи, затем животное
помещали на две параллельные, разновысокие перекладинки, расположенные под
углом 450. Тест считался положительным, если период, в течение которого мышь
сохраняла приданное ей неестественное положение, был не менее 20 сек. Время
теста ограничивали 120 сек. Каждый из последовательных 10 тестов проводился с
интервалом в 1-2 минуты. Животное, дающее 3 положительных теста из 10,
рассматривалось как каталептик (Куликов и др., 1989).
Тест открытого поля проводили при помощи открытой камеры (80х80х25см),
сделанной из прозрачного пластика. Каждое животное помещалось около стенки
открытого поля на одинаковом расстоянии между углами и тестировалось в течение
5 мин.
Тест приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) проводили в аппарате,
состоящем из двух открытых и двух закрытых рукавов по 35х7см каждый,
расположенных крестообразно. Мышь помещали в центр лабиринта головой в
сторону закрытого рукава. Регистрировали поведение в течение 5 мин.
Тест свет/темнота проводили в металлическом, окрашенном в белый цвет
аппарате (45х27х27cм), разделенном на два отсека - светлый и темный. Отсеки были
разделены непрозрачной перегородкой с отверстием 7х7см. Мышь помещалась в
светлый отсек ящика головой к отверстию. В течение 5 мин измеряли время,
проведенное в светлом отсеке и число переходов между отсеками.
6
Рефлекторную реакцию вздрагивания исследовали в приборе SR-Pilot (SanDiego Instruments Inc.), состоящем из пластиковой камеры (15x19x25см), пол
которой располагался на пьезодатчиках, включавшихся в момент подачи
стандартного звукового сигнала. После 3 мин адаптации мыши в камере каждые
15 сек подавали звуковой сигнал, чередуя одиночные стандартные сигналы с парой
«предупреждающий сигнал + стандартный сигнал».
В тесте принудительного плавания животное опускали в прозрачную
пластиковую коробку (30х30х30см), на на ¾ заполненную водой с температурой
250C. После 40 сек адаптации мыши в течение 3 мин регистрировали суммарное
время иммобильности (сек) и двигательную активность животного.
В тесте «tail suspension» мышь подвешивали за кончик хвоста (1.5см) при
помощи полоски липкой ленты на перекладину на высоте 30 см (Borsini, Meli, 1988).
Затем в течение 5 мин регистрировали общее время неподвижности (сек).
Тестирование межсамцовой агрессии (intermale aggression) проводили при
помощи модели спонтанной агрессии (Куликов и др., 1980). Половозрелый
беспородный самец белой окраски (интрудер) одного возраста и веса с тестируемым
самцом помещался в домашнюю клетку последнего. Тест был ограничен 10
минутами. Тестируемый самец, который не атаковал интрудера в течение указанного
времени, квалифицировался как неагрессивный. Самец, начавший атаковать
интрудера в течение 10 минут тестирования, считался агрессивным. Пенетрантность
признака в каждой линии оценивали по проценту мышей в линии, проявляющих
агрессию (Popova, Kulikov, 1986; Kulikov, Popova, 1996).
Поведение в тестах открытого поля, ПКЛ, «tail suspension», свет/темнота,
принудительного плавания и межсамцовую агрессию регистрировали видеокамерой
и сохраняли в виде видеофайлов на компакт дисках. Видеозаписи поведения
анализировали с помощью разработанной в лаборатории нейрогеномики поведения
(ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск) программы «Ethostudio» (Куликов и др., 2005).
Тестирование функциональной активности 5-НТ1А рецепторов серотонина у
мышей проводили, определяя с помощью электронного термометра КУТ Couple
Thermometer выраженность гипотермии, вызванной введением 8-ОН-DPAT,
агониста 5-НТ1А рецепторов. У мышей измеряли ректальную температуру тела,
затем внутрибрюшинно вводили 8-ОН-DPAT (в дозах 0.5 и 1мг/кг) и через 30 мин
снова измеряли температуру тела. Функциональную активность рецепторов
оценивали по изменению температуры тела до и после введения препарата.
Выделение ДНК проводили по Маниатис с соавт. (1984) в модификации,
разработанной в лаборатории, очистку ДНК проводили фенольно-хлороформным
методом (Куликов и др., 2003).
ДНК-типирование
проводилось
методом
ПЦР
с
последующим
электрофоретическим разделением продуктов реакции в агарозном и
полиакриламидном гелях.
Генотипирование мышей. Было исследовано распределение аллелей СВА (с) и
AKR (а) полиморфных микросателлитных маркеров D13Mit76 у ВС, S1, S2, S8 и S12 и
D13Mit202 у животных ВС и S1.
Изучили распределение фрагментов геномов родительских линий AKR и СВА в
геноме мышей S18, с помощью 50 полиморфных микросателлитных маркеров,
равномерно покрывающих 19 аутосом. При выборе микросателлитных маркеров для
настоящего исследования руководствовались тем, чтобы аллели избираемого
7
маркера
максимально
четко
дифференцировались
в
агарозном
или
полиакриламидном гелях (Куликов и др., 2003).
Статистическая обработка результатов. Частоты распределения каталептиков
у всех поколений селекции и у родительских линий, а также процент агрессивных
животных в S14-S15 и у родительских линий сравнивали с помощью нормального
распределения после преобразования долей в арксинусы по Фишеру.
Поведенческие параметры в тестах открытого поля, ПКЛ, реакции вздрагивания,
«tail suspension», свет/темнота, принудительного плавания и параметры теста на
функциональную активность 5-НТ1А рецепторов в мозге у мышей выражали как
среднее с ошибкой M  m и сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного
анализа ANOVA с последующим множественным сравнением по Дункану, в
качестве независимых факторов были взяты различные поведенческие параметры.
Проверка гипотез по распределению генотипов в селекционном
эксперименте. Сравнение концентраций с/с, с/а и а/а генотипов по маркеру
D13Mit76 у S1 и S2 с концентрациями генотипов с/с, с/а у ВС, и сравнение
концентраций генотипов между S1 и S2, а также сравнение концентраций генотипов
с/с, с/а и а/а для маркера D13Mit202 у S1 с концентрациями генотипов с/с, с/а у ВС
проводили по Fisher exact test.
Проверка гипотезы о распределении AKR (а) и СВА (с) аллелей у мышей S18.
Влияние селекции на распределение аллелей с (СВА) и a (AKR) для каждого
маркера оценивали с помощью критерия 2 с одной степенью свободы. Формула для
вычисления 2 выглядит как 2 = (Nc S18 – Nc ожид)2/Nc ожид + (Nа S18 – Nа
ожид)2/Nа ожид. Критическое значение 2 при уровне значимости, равном 0.05, для
проверки гипотезы о влиянии селекции, скорректированное на число маркеров,
равное 50 (Р = Р0/50), было 10,8.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Изменение пенетрантности каталепсии в ходе селекции
В процессе селекции на высокую предрасположенность к каталепсии выявлено
быстрое увеличение доли мышей, проявляющих данный признак, что подтверждает
представление о моно - или олигогенном наследовании признака, сделанное ранее на
основании данных гибридологического анализа и результатов картирования
признака с помощью полиморфных микросателлитных маркеров (Куликов и др.,
2003; Куликов, Базовкина 2003) (рис.1).
Рис.1. Влияние селекции по
предрасположенности
к
каталепсии на пенетрантность
признака - процент животных,
проявляющих реакцию замирания.
Каталепсию определяли минимум
у 100 животных в каждой
генерации.***p<0.001
по
сравнению с CBA
8
Существенно, что доля мышей, проявляющих каталепсию, среди животных S 3 и
S7-S10 была достоверно выше, чем у мышей линии CBA. Возможно, у мышей в
процессе селекции произошло накопление генов-модификаторов, усиливающих
действие основного гена каталепсии, расположенного в дистальном фрагменте
хромосомы 13 (Куликов, Базовкина, 2003). В то же время селекция на каталепсию не
привела к увеличению среднего времени замирания. Действительно, показатели по
этому параметру достоверно не отличаются у мышей S8-S9 (44.8  4.5 сек) и у
мышей родительской линии СВА (43.7  9.9 сек). Это служит доказательством, что
пенетрантность
(процент
животных,
демонстрирующих
каталепсию)
и
экспрессивность (время замирания), этого признака у мышей контролируются
различными генетическими механизмами.
2. Уровень агрессивности мышей S14-15 и родительских линий
Показано, что высокая предрасположенность к каталепсии сопровождается
понижением агрессивности мышей. Процент агрессивных животных у S14-15 (4.1%)
был значительно ниже по сравнению с обеими родительскими линиями AKR и CBA
(51% и 45%) (рис.2).
Таким образом, селекция на каталепсию, видимо, закрепила такое состояние
нейрофизиологических систем, при котором мыши не проявляют агрессии.
Полученные данные подтверждают предположение о том, что агрессия и замирание
представляют собой две альтернативные формы поведения в межсамцовых
конфликтах (Blanchard, Blanchard, 1986). Следовательно, существенное снижение
агрессии у мышей - каталептиков можно считать закономерным коррелятивным
ответом на селекцию.
%
60
50
40
30
20
***
###
10
0
AKR
CBA
Рис.2. Процент агрессивных самцов в
линиях AKR (n=37), CBA (n=40) и S14 –S15
(n=74).***p<0.001 по сравнению с CBA,
### p<0.001 по сравнению с AKR.
S14-15
3. Исследование тревожности
родительских линий
селекционируемых
мышей
и
мышей
В тесте открытого поля число заходов в центр открытого поля, как и время
пребывания там, считают показателями, свидетельствующими о степени
выраженности тревожности животного.
Показаны существенные межлинейные различия по латентному времени
(F2,54=7.84, p<0.01), числу пересеченных квадратов (F2,54=3.77, p<0.05) и количеству
вертикальных стоек (F2,54=6.69, p<0.01) в тесте открытого поля. Не обнаружено
межлинейных различий по числу заходов в центр и времени пребывания там
(табл.1).
9
Таблица 1. Характеристика поведение мышей
тесте открытого поля
Характеристика
AKR (n=21)
Латентное время, сек
2,4 ± 0,4
Латентное время захода в
90,51± 26,2
центр, сек
Время в центре (%)
4,6 ± 1,1
Число заходов в центр
7,9 ± 2,1
Число пересеченных
176,5 ± 18,9
квадратов
Число вертикальных стоек
6,3 ± 1,8*
линий AKR, CBA и мышей S8 в
CBA (n=21)
10,1 ± 1,7###
S8 (n=21)
9,2 ± 1,7##
78,5 ± 19,7
91,3 ± 22,1
7,1 ± 1,6
7,2 ± 1,2
5,7 ± 1,1
7,9 ± 1,5
126,4 ± 12,9#
131,0 ± 10,0#
12,0 ± 1,8##
4,4± 1,0**###
*p<0.05, **p<0.01, по сравнению с CBA. #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 по сравнению с
AKR
Не было найдено различий в числе заходов в центр открытого поля и времени,
проведенном в нем, между мышами S14 и родительскими линиями СВА и AKR (F2,58
= 1.2, p>0.05, рис.3а, F2,58 < 1.0, p>0.05, рис.3б).
а
количество заходов в центр
6
5
4
3
2
1
0
AKR
CBA
S14
б
время в центре, cек
16
14
12
10
8
6
4
2
0
AKR
CBA
S14
Рис.3. Число заходов в центр (а) и время, проведенное в центре (б) в тесте
открытого поля у AKR (n=19), СВА (n=22) и S14 (n=20)
Считается, что животное редко посещает открытые рукава приподнятого
крестообразного лабиринта (ПКЛ) вследствие страха перед открытым и освещенным
пространством. Число заходов в открытые рукава ПКЛ, как и время пребывания там,
считаются показателями, свидетельствующими о тревожности животного.
Установлены существенные межлинейные различия по времени пребывания в
центре (F2,54= 19.21, p<0.001) и числу пересеченных квадратов в открытых рукавах
(F2,54=10.78, p<0.001). Мыши S8 и СВА достоверно больше времени проводили в
центре (p<0.001) и меньше двигались в открытых рукавах (p<0.001) по сравнению с
животными AKR. Не обнаружено межлинейных различий по числу заходов в
открытые рукава и времени пребывания там, а также по числу заглядываний вниз
(табл.2).
10
Таблица 2. Характеристика поведения мышей линий AKR, CBA и мышей S8 в тесте
приподнятого крестообразного лабиринта
Характеристика
AKR (n=21)
Время в центре (%)
18.4 ± 1.7
Число квадратов, пересеченных в
26.9 ± 3.7
центре
Время в открытых рукавах (%)
15.8 ± 1.7
Число квадратов, пересеченных в
13.5 ± 2.2
открытых рукавах
Число заглядываний вниз
13.6 ± 1.5
CBA (n=21) S8 (n=21)
54.0 ± 5.3 ### 52.1 ± 4.8 ###
25.2 ± 4.8
17.0 ± 1.8
16.0 ± 3.3
10.8 ± 2.6
4.2 ± 1.4 ###
4.7 ± 1.2 ###
12.2 ± 1.8
9.1 ± 0.9
Время в центре и в открытых рукавах выражали процентом от общего времени
наблюдения (5 мин), ###p<0.001 по сравнению с AKR
Следовательно, в тесте ПКЛ по тревожности мыши СВА, AKR и S 8 не
отличались.
Традиционными показателями тревожности животного в тесте свет/темнота
считается количество выходов в освещенный отсек (либо число переходов между
отсеками) и общее время, проведенное животным в светлом отсеке (Crawely, 1985).
Различия были выявлены между мышами линии AKR и СВА по числу переходов в
тесте свет/темнота (F2,27=5.25, p<0.01, рис.4а) и по времени, проведенном в светлом
отсеке (F2,27=3.38, p<0.05, рис.4б). Значения этих показателей у S13 мышей носили
промежуточный характер.
а
б время в светлом отсеке, %
70
число заходов в светлый отсек
25
60
20
50
**
15
40
10
30
*
20
5
0
10
AKR
CBA
0
S13
AKR
CBA
S13
Рис.4. Число заходов в светлый отсек (а), и время, проведенное в светлом отсеке (б)
в тесте свет/темнота у AKR (n=10), CBA (n=11) и S13 (n=9). Время, проведенное в
светлом отсеке, выражали процентом от общего времени наблюдения (5 мин).
*p<0.05, **p<0.01 по сравнению с CBA
Полученные данные в тесте свет/темнота хорошо согласуются с отсутствием
взаимосвязи между каталепсией и тревожностью в тестах открытого поля и ПКЛ у
селекционируемых мышей. Нужно отметить, что крысы линии ГК также не
отличаются от животных линии Вистар по индексам тревожности в тесте
приподнятого крестообразного лабиринта (Петрова, 1990).
Таким образом, селекция на предрасположенность к каталепсии не приводит к
усилению тревожности у мышей, как она не привела и у крыс. Это служит
доказательством того, что отсутствие изменений в этой форме поведения у данных
грызунов закономерно при селекции на каталепсию.
11
4. Исследование депрессивноподобного поведения у селекционируемых мышей
и родительских линий
Увеличение неподвижности в тестах принудительного плавания и «tail
suspension» является общепризнанным индексом усиления депрессивноподобных
характеристик поведения (Steru et al., 1985; Borsini, Meli, 1988).
В тесте принудительного плавания по времени неподвижности различались
достоверно только мыши СВА и S8 (F2,60=3.30, p<0.05, рис.5).
время неподвижности, сек
*
120
100
Рис.5. Время неподвижности (сек) в
тесте принудительного плавания у
мышей AKR, CBA и S8, n=21 животных
в каждой группе. *p<0.05 по сравнению
с CBA
80
60
40
20
0
AKR
CBA
S8
Эти данные хорошо согласуются с тем, что у крыс линии ГК также наблюдается
повышенная неподвижность в тесте принудительного плавания (Nikulina et al.,1987).
В тесте «tail suspension» время неподвижности у мышей AKR и S9 было
существенно выше по сравнению с CBA (F2,30=7.87, p<0.001) (рис.6).
время неподвижности, сек
160
***
140
120
100
80
60
40
20
0
AKR
CBA
**
Рис.6. Время неподвижности (сек) в
тесте «tail suspension» у мышей AKR,
CBA и S9, n=11 животных в каждой
группе.**p<0.01,
***p<0.001
по
сравнению с CBA.
S9
Можно предположить, что различные депрессивноподобные характеристики
случайным образом распределены у мышей родительских линий и непосредственно
не ассоциируются с предрасположенностью к каталепсии. Мыши линии AKR
характеризуются повышенной неподвижностью в тесте «tail suspension» и
сниженной исследовательской активностью в тесте открытого поля (табл.1). В то
время как животные CBA – низкой двигательной активностью в тесте открытого
поля (табл.1). Но в целом поведение мышей обеих этих линии не рассматривается
как депрессивноподобное. В ходе селекции на предрасположенность к каталепсии
12
все эти «депрессивные»
селекционируемой линии.
черты
родительских
линий
концентрируются
в
5. Реакция рефлекторного вздрагивания у мышей родительских линий, S8 и S13
Результаты тестирования реакции вздрагивания показали, что животные CBA,
AKR и S8 существенно различались по величине амплитуды рефлекса вздрагивания
(F2,52=13.02, p<0.001, рис.7). При тестировании реакции вздрагивания у мышей S13
также были найдены значительные межлинейные различия в амплитуде рефлекса
вздрагивания (F2,26 = 11.28, p<0.001). Величина амплитуды была выше у мышей СВА
(p<0.001) и S13 (p<0.001) по сравнению с мышами линии AKR. Эти результаты
хорошо согласуются с данными об увеличении амплитуды рефлекса вздрагивания у
крыс линии ГК по сравнению с амплитудой у крыс линии Вистар (Попова,
Мальцева, 1998; Popova et al., 2000).
амплитуда
1600
1400
1200
**
1000
800
600
400
200
0
AKR
*
###
CBA
Рис.7. Амплитуда рефлекса вздрагивания
у мышей AKR, CBA и S8, n=21 животных
в каждой группе
Значения даны в
относительных
единицах.
*p<0.05,
**p<0.01, по сравнению с CBA, ###
p<0.001 по сравнению с AKR.
S8
Следовательно, животные с наследственно детерминированным высоким
уровнем оборонительного поведения характеризуются высокой амплитудой
рефлекторной реакции вздрагивания в ответ на неожиданный звуковой сигнал.
Поскольку рефлекс вздрагивания рассматривается как разновидность защитной
реакции на неожиданный стимул (Попова, Мальцева, 1998), то наблюдаемые
результаты позволяют предположить взаимосвязь между каталепсией и защитной
реакцией на потенциально опасный стимул.
6. Изменение концентрации генотипов и соответствующих аллелей СВА и AKR
полиморфных микросателлитных маркеров D13Mit76 и D13Mit202 у мышей в
ходе селекции на высокую предрасположенность к каталепсии
Предполагается, что наиболее вероятным кандидатом, определяющим
предрасположенность к каталепсии у мышей СВА, является ген, кодирующий 5НТ 1А
(58cМ) рецептор медиатора головного мозга серотонина, расположенный на
хромосоме 13 и сцепленный с маркером D13Mit76 (61сМ) (Куликов, Базовкина,
2003). Существует множество данных о вовлечении 5-НТ1А рецепторов в регуляцию
каталепсии (Kulikov et al., 1994; Popova et al., 1994; Wadenberg, Hillegaart, 1995;
Wadenberg, 1996). ВС и мыши S1 были прогенотипированы полиморфным
микросаттелитным маркером D13Mit76 и полиморфным микросаттелитным
маркером D13Mit202 (47сМ) в качестве контроля, мыши S2 – маркером D13Mit76.
Концентрации c (СВА) и a (AKR) аллелей маркеров D13Mit76 и D13Mit202 у BC, S1
13
и S2 представлены в таблице 3. Селекция не повлияла на концентрации D13Mit202 у
S1 (табл. 3). В то же время у мышей S1 было обнаружено возрастание доли c аллеля и
соответственно снижение доли a аллеля маркера D13Mit76 (табл. 3). Эти изменения
сопровождались возрастанием концентрации c/c генотипа и соответственно
снижением долей c/a и a/a генотипов для маркера D13Mit76 по сравнению с ВС
(p<0.01, табл. 4). У мышей S2 доля a аллеля микросателлита D13Mit76 была ниже и
доля c аллеля была выше по сравнению с этими показателями у животных S1 (табл.
3). Это изменение концентрации аллелей также сопровождалось повышением доли
c/c генотипа и соответственно снижением долей c/a и a/a генотипов для маркера
D13Mit76 по сравнению с ВС и S1 (p<0.001, табл.4).
Таблица 3. Концентрации CBA (c) и AKR (a)-аллелей маркеров D13Mit76 и D13Mit202
у ВС, S1 и S2 поколений.
D13Mit76
D13Mit202
самцы
самки
самцы
самки
c
a
c
a
c
a
c
a
BC
S1
S2
0.78
0.83
0.86
0.22
0.17
0.14
0.73
0.82
0.89
0.27
0.18
0.11
0.76
0.77
0.24
0.23
0.73
0.76
0.27
0.24
Концентрации c и a аллелей у ВС были посчитаны как (Nc/c + 0.5 x Nc/a)/(Nc/c + Nc/a) и 0.5 x
Nc/a/(Nc/c + Nc/a), для S1 и S2 они были посчитаны как (Nc/c + 0.5 x Nc/a)/N и (Na/a + 0.5 x Nc/a)/N,
соответственно, где Nc/c, Nc/a и Na/a – наблюдаемое число c/c, c/a и a/a генотипов, N = Nc/c +
Nc/a + Na/a.
Таблица 4. Число гомо – и гетерозигот для маркеров D13Mit76 и D13Mit202 у ВС, S1
и S2.
D13Mit76
D13Mit202
c/c
c/a
a/a
c/c
c/a
a/a
BC
284
265
264
281
S1
166
76
6
**
148
88
15
S2
280
87
2
***
###
Данные по самцам и самкам были объединены.
**p <0.01, *** p<0.001 по сравнению с ВС, ### p<0.001 по сравнению с S1
Не было обнаружено a аллеля маркера D13Mit76 у всех исследованных мышей S8
и S12 (рис.8).
Таким образом, селекция на каталепсию привела у мышей S 1 и S2 к повышению
концентрации СВА аллеля (с) и, соответственно, к снижению AKR аллеля (а)
маркера D13Mit76, тесно сцепленного с геном 5-НТ1А рецептора. Длительная
селекция привела к полной элиминации а аллеля маркера D13Mit76. В то же время
она не повлияла на концентрации с и а аллелей маркера D13Mit202, картированного
на расстоянии 11сМ дистальнее гена 5-НТ1А рецептора и на 14 сМ дистальнее
D13Mit76. Эти данные говорят о близкой связи каталепсии и гена 5-НТ1А рецептора
и, тем самым, подтверждают данные Куликова А.В и Базовкиной Д.В. (Куликов и
др., 2003; Куликов, Базовкина, 2003) о локализации главного гена каталепсии на
хромосоме 13.
14
концентрация аллеля
1,0
0,8
0,6
Рис.8. Концентрации CBA- (c) и
AKR(a)
аллелей
маркера
D13Mit76 у мышей ВС, S1, S2, S8 и
S12.
0,4
0,2
0,0
BC
S1
S2
S8
S12
CBA аллель
AKR аллель
0
снижение t, C тела
7. Функциональная активность серотониновых 5-НТ1А рецепторов у
родительских линий и мышей S12
Значительные межлинейные различия были обнаружены в ответе на введение 8OH-DPAT. Этот агонист 5-HT1A рецепторов не влиял на температуру тела у мышей
AKR и вызывал снижение температуры в среднем на 1.75C и 2.2C у линии СВА и
на 2.0C и 2.5C у мышей S12 в дозах 0.5 и 1.0 мг/кг, соответственно (рис.9).
1,0
S12
CBA
AKR
0,5
0,0
-0,5
-1,0
-1,5
-2,0
-2,5
###
###
###
###
Доза 8-ОН DPAT
0.5 мг/кг
1.0 мг/кг
Рис.9. Эффект введения 8OH-DPAT на температуру
тела у мышей AKR (n=8) и
CBA (n=11) и S12 (n=11).
Данные представлены как
разница
между
температурой тела до
введения и через 30 мин
после введения 8-ОН-DPAT
(в дозе 1 мг/кг и 0.5 мг/кг,
i.p.). ### p<0.001 по
сравнению с AKR
Выявленная повышенная функциональная активность 5-НТ1А рецептора у мышей
S12 хорошо согласуется с распределением аллелей микросателлитного маркера
D13Mit76. Действительно, мыши S12 содержат фрагмент хромосомы 13,
включающий аллель гена 5-НТ1А рецептора, полученный от мышей линии СВА, и в
то же время наследуют СВА подобную повышенную активность рецептора.
Следовательно, крайне высокая предрасположенность к каталепсии
сопровождается повышенной активностью 5-HT1A рецептора, которая в свою
очередь, может оказывать ингибирующее влияние на проявление агрессии,
поскольку введение агонистов 5-НТ1А рецептора приводит к ингибированию
15
межсамцовой внутривидовой агрессии у мышей и крыс (Olivier et al., 1995; de Boer et
al., 1998; Pruus et al., 2000; Вишнивецкая и др., 2001). К тому же, повышенная
плотность, высокая функциональная активность и высокий уровень мРНК гена 5НТ1А рецептора характерна для животных, селекционированных на низкую агрессию
по отношению к человеку (Popova et al., 1998, 2005). Эти данные дают основание
заключить, что 5-НТ1А рецепторы играют важную роль в подавлении агрессивного
поведения.
С другой стороны, можно предположить, что повышенная активность этого
рецептора регулирует предрасположенность к депрессивноподобному поведению у
крыс и мышей, поскольку показано, что его проявление у грызунов также
сопровождается повышением активности этих рецепторов (Overstreet, 1993;
Overstreet et al., 1996; Yacoubi et al., 2003).
Обнаружено, что введение агонистов 5-НТ1А рецептора 8-ОН DPAT и 5-Me
ODMT вызывают повышение акустического рефлекса вздрагивания у крыс (Nanry,
Tilson, 1989). Следовательно, увеличение активности рецептора связано с
возрастанием амплитуды рефлекса вздрагивания, что хорошо согласуется с нашими
результатами о закреплении у селекционированных мышей высокого значения
рефлекса вздрагивания и повышенной активности рецептора.
Что касается тревожного поведения, то оно связано с пониженной активностью
5-НТ1А рецептора, так как агонисты этих рецепторов уменьшают тревожность у
мышей и крыс в тестах приподнятого крестообразного лабиринта и свет/темнота
(Chopin, Briley, 1987; Broekkamp et al., 1989; Barrett, Gleeson, 1991; Barrett, Witkin,
1991; Barrett, Vanover, 1993; Griebel, 1995). Следовательно, тот факт, что у
селекционируемых мышей и каталептической родительской линии СВА не
наблюдается повышенной тревожности, является закономерным проявлением
повышенной активности рецептора.
Таким образом, высокая предрасположенность к каталепсии характеризуется
повышенной активностью 5-HT1A рецептора, которая в свою очередь, может
оказывать ингибирующее влияние на проявление агрессии, способствовать
проявлению депрессивноподобного поведения и повышению акустического
рефлекса вздрагивания, не усиливая тревожности селекционируемых мышей.
8. Картирование генома селекционируемых мышей с помощью набора
полиморфных микросателлитов для получения карты расположения
фрагментов геномов родительских линий AKR и CBA
Возможно, повышение пенетрантности каталепсии и проявление коррелятивных
признаков у селекционируемых мышей связано с накоплением генов
модификаторов, усиливающих действие основного гена.
В связи с этим интересным было посмотреть, как располагаются фрагменты
хромосом родительских линий по геному у этих животных.
Изучение распределения с-аллелей и а-аллелей 50 полиморфных
микросателлитных маркеров у селекционированных животных выявило, что помимо
основного с-локуса на дистальном конце хромосомы 13, участвуют, по меньшей
мере, 29 других локусов, распределенных по 19 аутосомам селекционируемых
мышей. Усиливающие каталепсию аллели, полученные от CBA, локализованы в
основном на хромосомах 1, 4 и 6, в то время как полученные от AKR аллели – на
хромосомах 10, 12, 13, 16, 17, 18 и 19. Несмотря на то, что эти дополнительные
локусы в сумме контролируют больше пенетрантности признака, чем основной
16
локус, их действие проявляется только в присутствии с-аллеля главного локуса,
расположенного в дистальном сегменте хромосомы 13 (рис. 10).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
cM
10
30
50
70
90
110
130
11
12
13
14
15
16
17
18
19
cM
10
30
50
70
90
Рис.10. Карта расположения в
геноме
мышей
S18
50
полиморфных микросателлитов
и
сцепленных
с
ними
фрагментов
хромосом
родительских линий AKR и CBA.
Цифрами
указаны
номера
хромосом (1 по 19). Белым
цветом
показаны
не
исследованные
на
данный
момент области.
110
Локус, полученный от линии СВА
Локус, полученный от линии AKR
Локус, на который селекция не оказала влияния
Полученные результаты дают основание надеяться, что составленная карта
генома мышей позволит на следующем этапе исследования выявить локусы,
контролирующие «депрессивные» черты, реакцию страха и агрессивность у мышей.
ВЫВОДЫ
1. Быстрое увеличение доли каталептиков в ходе селекции мышей на
предрасположенность к каталепсии хорошо соответствует представлению об
олигогеном наследовании признака.
2. Из 50 исследованных локусов генома селекционируемых мышей 25
унаследованы от CBA, 8 – от AKR. Селекция на каталепсию не изменила
исходного распределения аллелей в 17 локусах. Помимо основного с-локуса на
дистальном конце хромосомы 13, в регуляции каталепсии участвуют 29 других
локусов, распределенных по аутосомам селекционируемых мышей.
3. Селекция мышей на высокую предрасположенность к каталепсии
сопровождается появлением коррелятивных признаков: депрессивноподобного
поведения, снижения агрессивного поведения, повышения амплитуды
акустического рефлекса вздрагивания.
4. У селекционируемых мышей происходит фиксация СВА аллеля и элиминация
AKR
аллеля
полиморфного
микросателлитного
маркера
D13Mit76,
расположенного на расстоянии 3 сМ от гена 5-НТ1А рецептора нейромедиатора
серотонина, сопровождающаяся повышением активности 5-НТ1А рецептора
17
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ:
Базовкина Д.В., Куликов А.В., Кондаурова Е.М., Попова Н.К. Селекция на
предрасположенность к каталепсии усиливает депрессивноподобное поведение
у мышей // Генетика, 2005. Т.41(9). С. 1222-1228.
2.
Науменко В.С., Кондаурова Е.М., Куликов А.В., Попова Н.К. Влияние
селекции на высокую предрасположенность к каталепсии, на функциональную
активность 5-НТ1А-рецепторов и экспрессию кодирующего их гена // Докл.
Акад. Наук, 2006. Т.409(1). С.133-135.
3.
Kondaurova E.M., Bazovkina D.V., Kulikov A.V., Popovа N.K. Selective
breeding for catalepsy changes the distribution of microsatellite D13Mit76 alleles
linked to the 5-HT1A serotonin receptor gene in mice // Genes Brain and Behavior,
2006. V.5. P.596-601.
4.
Кондаурова Е.М., Куликов А.В., Базовкина Д.В. Попова Н.К. Высокая
предрасположенность к каталепсии снижает межсамцовую агрессию и
повышает амплитуду акустического рефлекса вздрагивания // Журн. Высш.
Нервн. Деят., 2007. Т.57 (4). С. 527-533.
5.
Кондаурова Е.М.,. Базовкина Д.В. Изменения поведения мышей в ходе
селекции на каталептическую реакцию // Материалы ХLII международной
научной студенческой конференции “Студент и научно-технический прогресс”,
Новосибирск, 2004, ч. «Биология». С.51-52.
6.
Кондаурова Е.М., Базовкина Д.В. Изменения поведения в ходе селекции
мышей на каталепсию // Седьмая Всероссийская медико-биологическая
конференция молодых исследователей “Человек и его здоровье”, изд.
СПбГЭТУ ”ЛЭТИ” г. Санкт-Петербург, 2004. С.126.
7.
Базовкина Д.В., Куликов А.В., Кондаурова Е.М., Попова Н.К. Селекция на
предрасположенность к каталепсии усиливает депрессивноподобное поведение
у мышей // Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда, Бюлл.
Сиб. Мед. 2005. Т.4 (приложение 1). С. 103.
8.
Kondaurova E.M., Bazovkina D.V., Kulikov A.V., Popova N.K. Selective
breeding for catalepsy in mice effect on the allele concentration of microsatellite
D13Mit76 linked to the 5-HT1A receptor gene // International Summer School in
Behavioral Neurogenetics, Moscow, 2005. Р. 54-55.
9.
Кондаурова Е.М., Базовкина Д.В., Куликов А.В. Генетическая ассоциация
между наследственной предрасположенностью к каталепсии у мышей и
другими формами защитного поведения // Материалы международной
конференции «Генетика в России и мире» посвященной 40-летию Института
общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва, 2006. С. 95.
10.
Базовкина Д.В., Кондаурова Е.М., Куликов А.В. Исследование локализации
гена предрасположенности к каталепсии у мышей методом QTL-анализа с
помощью полиморфных микросателлитных маркеров // Материалы
международной конференции «Генетика в России и мире» посвященной 40летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва, 2006. С. 10.
11.
Bazovkina D.V., Kondaurova E.M., Kulikov A.V., Popova N.K. Modifications of
behavior in mice selected for the high predisposition to catalepsy // International
conference of biological psychiatry “Stress and behavior”. St-Petersburg, 2007. P.36.
1.
18