А.Б. ДЖУСУПОВА, Е.Т. НИКИТИНА ВЫЯВЛЕНИЕ АКТИНОФАГОВ АКТИНОМИЦЕТА- ПРОДУЦЕНТА АНТИБИОТИКА РОЗЕОФУНГИНА
реклама
А.Б. ДЖУСУПОВА, Е.Т. НИКИТИНА ВЫЯВЛЕНИЕ АКТИНОФАГОВ АКТИНОМИЦЕТАПРОДУЦЕНТА АНТИБИОТИКА РОЗЕОФУНГИНА (Институт микробиологии и вирусологии МОиН РК) Показано, что в отличие от типовой культуры Streptomyces roseoflavus IPV 1344 S. roseoflavus var.roseofungini не является лизогенным. Из казахстанских почв впервые выделены актинофаги, способные оказывать литическое действие и подавлять спорообразование актиномицета-продуцента розеофунгина Исследование фаголизиса актиномицетов приобрело важное значение в связи с промышленным использованием этих организмов для биосинтеза биологически активных веществ. Актинофаги способны вызывать у актиномицетов высокую частоту морфологических мутаций, менять циклы развития, резко снижать антибиотическую активность /1-4/. Актинофаги распространены повсеместно и различаются по вирулентности и спектру литической активности. До сих пор отсутствуют сведения о лизогенности и актинофагах S. roseoflavus var.roseofungini - продуцента нового терапевтически ценного противогрибкового антибиотика розеофунгина /5/. Биосинтез антибиотика в промышленных условиях не исключает возможность возникновения фаголизиса. В связи с этим исследовалась лизогенность актиномицета-продуцента розеофунгина и распространение его фагов в почвах. Объекты и методы. Основными объектами исследования были S. roseoflavus var.roseofungini штамм ИМиВ 1128 и типовая культура S. roseoflavus штамм IРV 1344. В качестве индикаторных культур использовались S.coelicolor шт.А 3, S.venesualae АТСС 10 595, S.griseus шт.15-52, S.fradiae АТСС 3535, S.lateritius, S.peucetius шт. RIA - 5-57. Для выращивания культур стрептомицетов и получения культуральной жидкости применяли жидкую и агаризованную среду Гаузе-1. Для выделения актинофагов из почвы и их размножения применяли пептонно-кукурузный бульон и агар (ПКБ и ПКА). Спонтанный лизис культур стрептомицетов выявляли нанесением 1-2 капель культуры на газоны опытных штаммов. Чашки с посевами инкубировали при 300С в течение 5 суток, после чего определяли наличие лизиса. Для выявления лизогенности культур актиномицетов применяли УФ-облучение. Водную суспензию спор помещали в чашки Петри слоем 2 мм. После облучения культуру инкубировали в темноте, а затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость (супернатант) титровали методом агаровых слоев. Выделение актинофагов из почвы проводили в колбах, содержащих 30 мл ПКБ, навески почвы в количестве 5г и 1мл культуры актиномицета. Через 48 часов инкубирования содержимое колб центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин. Супернатанты испытывали на наличие актинофагов на газонах культур. Для индукции вторичного роста водную суспензию спор актиномицета и актинофага в равных соотношениях смешивали и равномерно распределяли по поверхности среды ПридхэмаГоттлиба. Чашки с посевами инкубировали при 300С в течение 15 и более суток. Результаты и обсуждение Проведено перекрестное испытание стрептомицетов штаммов 1128, 1344 на лизогенность, а также испытание их на штаммах других культур стрептомицетов. Установлено, что только штамм 1344 периодически продуцирует фаг. Размножение фага на культуре - хозяине не дало положительного результата, что свидетельствует о том, что фаг является умеренным. Не удалось найти индикаторную культуру, чувствительную к фагу, содержащемуся в штамме Str.roseoflavus 1344. Продуцент розеофунгина шт.1128 после облучения УФ-лучами не продуцировал фаги, т.е. он не лизогенен. Таблица. Влияние условий приготовления почвенных фильтратов на частоту выявления актинофагов Тест-культура Условия Продолжительно- Наличие фага в выдержи-вания сть опыта (в час) фильтрате колб с почвой S.roseoflavus Var.roseofungini шт.1128 На качалке В покое На качалке S.roseoflavus IРV 1344 В покое На качалке Act.peucetius 557 В покое 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 +++ ++ + +++ ++ ++ ++ ++ + - Примечание: (+++) - зоны отсутствия роста культуры (++) - многочисленные негативные колонии (н.к.) (+) - единичные н.к. (-) - отсутствие актинофага Отсутствие лизогенности является дополнительным доказательством отличия продуцента розеофунгина от типовой культуры S.roseoflavus шт. IРV 1344. Вместе с тем обе культуры оказались чувствительными к фагам, выделенным из казахстанских почв, что указывает на возможность фаголизиса исследуемых стрептомицетов. Частота выделения из почв фагов культур S.roseoflavus зависела от условий приготовления фильтратов и продолжительности опытов (таблица). В качестве источников фагов были использованы следующие образцы почв: серозем, светло-каштановые, темно-каштановые и чернозем. Полученные данные свидетельствуют о неравномерном распространении фагов культур S.roseoflavus в испытанных казахстанских почвах. Наибольшее количество фагов выделено из темно-каштановых и черноземных почв. Методом обогащения получены супернатанты, которые при высеве на газоны штаммов 1344 и 1128 дали полосы лизиса: на штамме 1344 - 5 образцов и на штамме 1128 - 1 образец. Перевиваемость этих зон указывает на их фаговую природу. Экспериментально достигнута высокая концентрация фагов N 2 и N 3 (5.109 и 1010 частиц/мл) соответственно, которые использовали для выявления спектра изменчивости у исследуемых актиномицетов. При совместном посеве фагов и спор продуцента розеофунгина на среду Гаузе 1 выросшие колонии имели участки угнетенного роста с ослабленным или отсутствующим спорообразованием, оранжевой пигментацией, не свойственной продуценту розеофунгина в отсутствии актинофага. На среде Придхэма-Готтлиба с фруктозой S. roseoflavus var.roseofungini на второй - третьей неделе культивирования формирует вторичные проактиномицетоподобные колонии. В литературе /6/ имеются данные о роли фагов в индукции вторичного роста у актиномицетов. На этом основании предполагалось увеличение частоты образования вторичных колоний у продуцента розеофунгина и типовой культуры S.roseoflavus при их инфицировании актинофагами N 2 и N 3. Однако, в наших опытах это предположение не подтвердилось. В присутствии актинофагов вторичные колонии у исследованных актиномицетов возникали с обычной частотой, но отличались от контрольных жесткой консистенцией, более мелкими размерами и менее складчатой поверхностью. Таким образом, показано, что продуцент антибиотика розеофунгина (S. roseoflavus var.roseofungini) не является лизогенным, что отличает его от типовой культуры S.roseoflavus IРV 1344. Впервые из почв выделены актинофаги, которые оказывают литическое действие на обе исследованные культуры S.roseoflavus. Инфицирование спор актиномицетов актинофагами при посеве угнетает последующий рост, подавляет спорообразование, но вторичный рост при пролонгированном культивировании не стимулирует. ЛИТЕРАТУРА 1. Алиханян С.И., Ильина Т.С. Мутагенное действие актинофага // Доклады АН СССР. 1958. т.120. N 5. с. 1122-1125. 2. Тетерятник А.Ф., Михайлова Г.Р. Изменчивость культуры Actinomyces floridaе под воздействием актинофага // Антибиотики. 1964. N9. с.792 - 796. 3. Ломовская Н.Д., Алиханян С.И. Особенности действия двух актинофагов на культуру Actinomyces spheroides //Антибиотики. 1965. N9. с.793. 4. Раутенштейн Я.И. Практическое значение вирусов микроорганизмов для микробиологических производств //Известия АН СССР. сер-биол. 1983. N 1. с. 122 - 126. 5. Ветлугина Л.А., Никитина Е.Т. Противогрибковые полиеновые антибиотики. Алма-Ата, Наука. 1980. 248 с. 6. Deschampes A., Plichon B., Petitprez A. Induction d'anomalies morphologiques par irradiation ultra violette chez une souche de streptomyces fradiae // Coрmtes rendus hebdomadaires des seances de l'academie des sciences. 1974. V.278. N 23. p. 3007-3010. SUMMARY The Streptomyces roseoflavus var.roseofungini in differens of typical culture Streptomyces roseoflavus IРV 1344 is not lysogenic. The first time actinophages which has lytilic effect and inhibition of sporulation of actinomycetes - producer of roseofungini from Kazakstane soils was isolated. А.Б. ДЖУСУПОВА, Е.Т. НИКИТИНА ВЫЯВЛЕНИЕ АКТИНОФАГОВ АКТИНОМИЦЕТАПРОДУЦЕНТА АНТИБИОТИКА РОЗЕОФУНГИНА (Институт микробиологии и вирусологии МОиН РК) Показано, что в отличие от типовой культуры Streptomyces roseoflavus IPV 1344 S. roseoflavus var.roseofungini не является лизогенным. Из казахстанских почв впервые выделены актинофаги, способные оказывать литическое действие и подавлять спорообразование актиномицета-продуцента розеофунгина Исследование фаголизиса актиномицетов приобрело важное значение в связи с промышленным использованием этих организмов для биосинтеза биологически активных веществ. Актинофаги способны вызывать у актиномицетов высокую частоту морфологических мутаций, менять циклы развития, резко снижать антибиотическую активность /1-4/. Актинофаги распространены повсеместно и различаются по вирулентности и спектру литической активности. До сих пор отсутствуют сведения о лизогенности и актинофагах S. roseoflavus var.roseofungini - продуцента нового терапевтически ценного противогрибкового антибиотика розеофунгина /5/. Биосинтез антибиотика в промышленных условиях не исключает возможность возникновения фаголизиса. В связи с этим исследовалась лизогенность актиномицета-продуцента розеофунгина и распространение его фагов в почвах. Объекты и методы. Основными объектами исследования были S. roseoflavus var.roseofungini штамм ИМиВ 1128 и типовая культура S. roseoflavus штамм IРV 1344. В качестве индикаторных культур использовались S.coelicolor шт.А 3, S.venesualae АТСС 10 595, S.griseus шт.15-52, S.fradiae АТСС 3535, S.lateritius, S.peucetius шт. RIA - 5-57. Для выращивания культур стрептомицетов и получения культуральной жидкости применяли жидкую и агаризованную среду Гаузе-1. Для выделения актинофагов из почвы и их размножения применяли пептонно-кукурузный бульон и агар (ПКБ и ПКА). Спонтанный лизис культур стрептомицетов выявляли нанесением 1-2 капель культуры на газоны опытных штаммов. Чашки с посевами инкубировали при 300С в течение 5 суток, после чего определяли наличие лизиса. Для выявления лизогенности культур актиномицетов применяли УФ-облучение. Водную суспензию спор помещали в чашки Петри слоем 2 мм. После облучения культуру инкубировали в темноте, а затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость (супернатант) титровали методом агаровых слоев. Выделение актинофагов из почвы проводили в колбах, содержащих 30 мл ПКБ, навески почвы в количестве 5г и 1мл культуры актиномицета. Через 48 часов инкубирования содержимое колб центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин. Супернатанты испытывали на наличие актинофагов на газонах культур. Для индукции вторичного роста водную суспензию спор актиномицета и актинофага в равных соотношениях смешивали и равномерно распределяли по поверхности среды ПридхэмаГоттлиба. Чашки с посевами инкубировали при 300С в течение 15 и более суток. Результаты и обсуждение Проведено перекрестное испытание стрептомицетов штаммов 1128, 1344 на лизогенность, а также испытание их на штаммах других культур стрептомицетов. Установлено, что только штамм 1344 периодически продуцирует фаг. Размножение фага на культуре - хозяине не дало положительного результата, что свидетельствует о том, что фаг является умеренным. Не удалось найти индикаторную культуру, чувствительную к фагу, содержащемуся в штамме Str.roseoflavus 1344. Продуцент розеофунгина шт.1128 после облучения УФ-лучами не продуцировал фаги, т.е. он не лизогенен. Таблица. Влияние условий приготовления почвенных фильтратов на частоту выявления актинофагов Условия Продолжительно- Наличие фага в Тест-культура выдержи-вания сть опыта (в час) фильтрате колб с почвой 24 На качалке 48 +++ S.roseoflavus 72 ++ Var.roseofungini 24 шт.1128 В покое 48 72 24 + На качалке 48 +++ 72 ++ S.roseoflavus IРV 1344 24 В покое 48 ++ 72 ++ 24 На качалке 48 ++ 72 + Act.peucetius 557 24 В покое 48 72 Примечание: (+++) - зоны отсутствия роста культуры (++) - многочисленные негативные колонии (н.к.) (+) - единичные н.к. (-) - отсутствие актинофага Отсутствие лизогенности является дополнительным доказательством отличия продуцента розеофунгина от типовой культуры S.roseoflavus шт. IРV 1344. Вместе с тем обе культуры оказались чувствительными к фагам, выделенным из казахстанских почв, что указывает на возможность фаголизиса исследуемых стрептомицетов. Частота выделения из почв фагов культур S.roseoflavus зависела от условий приготовления фильтратов и продолжительности опытов (таблица). В качестве источников фагов были использованы следующие образцы почв: серозем, светло-каштановые, темно-каштановые и чернозем. Полученные данные свидетельствуют о неравномерном распространении фагов культур S.roseoflavus в испытанных казахстанских почвах. Наибольшее количество фагов выделено из темно-каштановых и черноземных почв. Методом обогащения получены супернатанты, которые при высеве на газоны штаммов 1344 и 1128 дали полосы лизиса: на штамме 1344 - 5 образцов и на штамме 1128 - 1 образец. Перевиваемость этих зон указывает на их фаговую природу. Экспериментально достигнута высокая концентрация фагов N 2 и N 3 (5.109 и 1010 частиц/мл) соответственно, которые использовали для выявления спектра изменчивости у исследуемых актиномицетов. При совместном посеве фагов и спор продуцента розеофунгина на среду Гаузе 1 выросшие колонии имели участки угнетенного роста с ослабленным или отсутствующим спорообразованием, оранжевой пигментацией, не свойственной продуценту розеофунгина в отсутствии актинофага. На среде Придхэма-Готтлиба с фруктозой S. roseoflavus var.roseofungini на второй - третьей неделе культивирования формирует вторичные проактиномицетоподобные колонии. В литературе /6/ имеются данные о роли фагов в индукции вторичного роста у актиномицетов. На этом основании предполагалось увеличение частоты образования вторичных колоний у продуцента розеофунгина и типовой культуры S.roseoflavus при их инфицировании актинофагами N 2 и N 3. Однако, в наших опытах это предположение не подтвердилось. В присутствии актинофагов вторичные колонии у исследованных актиномицетов возникали с обычной частотой, но отличались от контрольных жесткой консистенцией, более мелкими размерами и менее складчатой поверхностью. Таким образом, показано, что продуцент антибиотика розеофунгина (S. roseoflavus var.roseofungini) не является лизогенным, что отличает его от типовой культуры S.roseoflavus IРV 1344. Впервые из почв выделены актинофаги, которые оказывают литическое действие на обе исследованные культуры S.roseoflavus. Инфицирование спор актиномицетов актинофагами при посеве угнетает последующий рост, подавляет спорообразование, но вторичный рост при пролонгированном культивировании не стимулирует. ЛИТЕРАТУРА 1. Алиханян С.И., Ильина Т.С. Мутагенное действие актинофага // Доклады АН СССР. 1958. т.120. N 5. с. 1122-1125. 2. Тетерятник А.Ф., Михайлова Г.Р. Изменчивость культуры Actinomyces floridaе под воздействием актинофага // Антибиотики. 1964. N9. с.792 - 796. 3. Ломовская Н.Д., Алиханян С.И. Особенности действия двух актинофагов на культуру Actinomyces spheroides //Антибиотики. 1965. N9. с.793. 4. Раутенштейн Я.И. Практическое значение вирусов микроорганизмов для микробиологических производств //Известия АН СССР. сер-биол. 1983. N 1. с. 122 - 126. 5. Ветлугина Л.А., Никитина Е.Т. Противогрибковые полиеновые антибиотики. Алма-Ата, Наука. 1980. 248 с. 6. Deschampes A., Plichon B., Petitprez A. Induction d'anomalies morphologiques par irradiation ultra violette chez une souche de streptomyces fradiae // Coрmtes rendus hebdomadaires des seances de l'academie des sciences. 1974. V.278. N 23. p. 3007-3010. SUMMARY The Streptomyces roseoflavus var.roseofungini in differens of typical culture Streptomyces roseoflavus IРV 1344 is not lysogenic. The first time actinophages which has lytilic effect and inhibition of sporulation of actinomycetes - producer of roseofungini from Kazakstane soils was isolated.
