На правах рукописи Дугарова Ирина Далаевна ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ КОНДЕНСАТА ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА У ПАЦИЕНТОВ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ 14.01.25 – пульмонология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научноисследовательский институт пульмонологии» Федерального медикобиологического агентства России Научный руководитель: доктор медицинских наук Анаев Эльдар Хусеевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Осипова Галина Леонидовна ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России доктор медицинских наук, профессор Ненашева Наталия Михайловна Российская медицинская академия последипломного образования Ведущая организация: ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России Защита состоится «……..» ……………………… 2010 г. в .……. часов на заседании диссертационного совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32) Автореферат разослан «……..» ……………………… 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Анаев Э.Х. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Бронхиальная астма (БА) является глобальной проблемой мирового здравоохранения. Люди всех возрастов во всем мире страдают этим хроническим заболеванием, и в случае тяжелого неконтролируемого течения эта болезнь ограничивает и значительно ухудшает качество жизни человека и подчас заканчивается летальным исходом. Эта болезнь приводит к потере трудоспособности и снижает участие пациента в жизни семьи [GINA, 2006]. Несмотря на большое число исследований, начиная от эпидемиологических и заканчивая изучением тонких механизмов реализации болезни на молекулярном уровне, в понимании БА, её течении, механизмах развития и подходах к лечению, существует много неясностей и противоречий, что заставляет продолжать исследования в данной области [Чучалин А.Г., 2007]. В настоящее время наибольшее значение для диагностики БА имеют клинические и функциональные тесты. Однако симптомы болезни не всегда отражают природу свидетельствуют и степень выраженности слабовыраженные взаимосвязи воспаления, между о чем значениями функциональных тестов и маркеров воспаления [Robroeks C.M. et al., 2007]. БА является комплексным хроническим воспалительным заболеванием с вовлечением многих структурных клеток и клеток воспаления, с высвобождением медиаторов воспаления, которые приводят к формированию основных патофизиологических механизмов заболевания [Barnes P.J., 1996]. На данный момент известно около 50 цитокинов и хемокинов, играющих важную роль в патогенезе БА [Barnes P.J., 2007], однако их роль в управлении патофизиологическими процессами до конца не изучена. Исследование маркеров воспаления в легких обычно осуществляется при использовании метода индуцированной мокроты [Berlyne G.S. et al., 2000; Hargreave F.E., 2007], бронхоальвеолярного 3 лаважа (БАЛ), бронхобиопсий [Adelroth E., 1998], а также сыворотки крови и мочи для оценки системных эффектов. Однако получение БАЛ и бронхобиоптатов являются инвазивными, травматичными методами, вызывающими множественные побочные эффекты, вследствие чего не могут проводиться через короткий промежуток времени, а также у тяжелых больных, детей и в амбулаторной практике [Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002]. В последние годы в клиническую практику широко внедряются неинвазивные методы диагностики и контроля лечения БА, в частности исследование биомаркеров в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) [Horvath I. et al., 2005]. Анализ КВВ позволяет оценить активность воспаления в легких и уточнить состояние местного воспаления в дыхательных путях, а также оценить роль цитокинов в нем. Однако работы, посвященные изучению концентраций цитокинов, как ключевого звена воспаления при БА, носят единичный, разрозненный, не систематизированный и дискуссионный характер. Цель исследования: Изучить значение цитокинов атопии (ИЛ-4, ИЛ-13), провоспалительных (ИЛ-6, ФНО-α), противовоспалительного (интерферон-) и хемокина (ИЛ-8) в КВВ и сыворотке крови, установить взаимосвязь между концентрацией цитокинов и клинико-функциональными показателями у больных БА среднетяжелого течения в разные фазы течения заболевания. Задачи исследования: 1. Определить содержание различных цитокинов в КВВ и сыворотке крови у здоровых субъектов и больных БА в период обострения и ремиссии. 2. Установить диагностическую значимость концентрации цитокинов в КВВ для оценки активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА. 4 3. Провести сравнительную оценку концентраций цитокинов в КВВ и сыворотке крови у больных БА в разные периоды заболевания. 4. Изучить взаимосвязь уровня цитокинов с клинико-функциональными показателями БА в разные периоды течения заболевания. Научная новизна В представленной работе впервые: проведено определение цитокинового профиля КВВ у пациентов со среднетяжелым течением БА в разные фазы течения заболевания; показано, что частота определения различных интерлейкинов, ИФН-γ и ФНО-α в КВВ выше, чем в сыворотке крови; полученные значения неинвазивных маркеров определяют степень активности местного воспаления в дыхательных путях при БА; показано, что высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ свидетельствует о степени тяжести обострения заболевания; установлено, что обострение при БА проявляется воспалительным отеком в слизистой оболочке стенки бронхов и гиперсекрецией слизи, о чем свидетельствует достоверное увеличение объема КВВ и снижение его рН; выявленная высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ у пациентов с атопической БА указывает на наличие фенотипа заболевания с преобладанием Th2-типа иммунного ответа; обнаружена обратная корреляционная взаимосвязь между уровнем ИЛ4 в КВВ со степенью бронхиальной обструкции в фазе обострения БА; выявлена прямая взаимосвязь между содержанием ИЛ-13 в КВВ с показателями функции внешнего дыхания (ФВД) у пациентов с БА в период ремиссии, что свидетельствует о персистирующем характере воспаления в дыхательных путях; обнаружена прямая корреляционная зависимость между эозинофилией крови и коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН-γ в КВВ, что 5 отражает взаимосвязь системной реакции организма с активностью местного воспаления. Практическая значимость 1. Анализ цитокинов в КВВ следует использовать в качестве неинвазивного метода оценки активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА. 2. Определение концентрации различных интерлейкинов, ИФН-γ и ФНОα в КВВ позволяет оценить эффективность проводимого лечения. 3. Исследование цитокинов в КВВ, отражающих природу и особенности местного воспаления, позволяет корректировать дальнейшую тактику ведения пациентов с БА. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Анализ цитокинового профиля (различных интерлейкинов, ИФН-γ и ФНО-α) КВВ воспалительного более четко ответа в отражает дыхательных активность путях при местного БА, чем исследование сыворотки крови. 2. Высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ у пациентов с обострением БА, а также их взаимосвязь с легочной функцией указывает на преобладание Th2-типа иммунного ответа и персистирующий воспалительный процесс в дыхательных путях при ремиссии заболевания. 3. Выявленная прямая зависимость между эозинофилией крови и коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН-γ в КВВ указывает на взаимосвязь системной реакции организма с местным воспалением. Внедрение в практику здравоохранения Исследование цитокинов в КВВ внедрено в качестве дополнительного метода диагностики у больных БА в аллергологическом отделении ГКБ №57 6 г.Москвы. Материалы исследования включены в лекционный курс на кафедре пульмонологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: - 17-м, 19-м Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Казань, 2007; Москва, 2009); - Научной сессии НИИ пульмонологии Росздрава (Рязань, 2007); - 3-ей международной научной конференции (Улан-Удэ, 2008); - Ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Берлин, 2008); - Ежегодном конгрессе Германского общества пульмонологов (Маннхайм, 2009); - Совместном заседании Ученого совета ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 23.06.2010.). Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в журнале, входящем в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста. Состоит из введения, глав обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Иллюстрирована 15 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель включает 21 отечественных и 143 зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке. 7 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общее количество пациентов, участвовавших в исследовании, составило 28 больных БА и 14 здоровых добровольцев. Критерии включения: Обязательными клиническими и функциональными критериями для включения в исследование были: больные обоего пола в возрасте от 18 до 60 лет; пациенты с подтвержденным диагнозом БА среднетяжелого течения [в соответствии с критериями GINA, 2006]; наличие атопии в анамнезе, подтвержденной кожными пробами (prick-test) и повышением уровня общего иммуноглобулина Е (IgЕ) сыворотки крови; длительность заболевания более 2-х лет; базисная терапия ингаляционными глюкокортикоидами (ГК) в дозе ≤1000 мкг (в пересчете на беклометазон); обратимая обструкция дыхательных путей (КБДОФВ112% от должного и 200 мл); наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании. Критерии исключения: наличие ХОБЛ, туберкулеза и других заболеваний легких, в т.ч. пневмония в течение последних 6 месяцев; тяжелые сопутствующие заболевания сердечно-сосудистой системы, органов пищеварения, мочеполовой и нервной системы; прием системных ГК; курение (ИКЧ 10 пачка/лет); злоупотребление алкоголем и наркотиками в анамнезе; хронические инфекционные заболевания верхних дыхательных путей (гаймориты и другие); беременность и кормление грудью. В исследование было включено 28 больных БА средней степени тяжести заболевания (диагноз подтвержден данными анамнеза, клинической картиной, рентгенологическими, функциональными методами диагностики), из них 14 пациентов в стадии обострения средней тяжести и 14 - в стадии стабильного течения заболевания. Контрольную группу составили 14 человек – здоровые добровольцы (ИКЧ 5 пачка/лет), не страдающие аллергическими и хроническими, в т.ч. бронхолегочными заболеваниями. 8 Пациенты в стадии обострения находились на стационарном лечении в аллергологическом отделении ГКБ №57 с 2006 по 2009 год, остальные пациенты наблюдались амбулаторно в ФГУ НИИ пульмонологии. Характеристика больных БА и здоровых добровольцев, включенных в исследование, представлена в табл. 1. Таблица 1. Характеристика больных БА, включенных в исследование. Признаки Mean±SD БА, стадия БА, стадия Здоровые обострения ремиссии добровольцы (n=14) (n=14) (n=14) 2/12 4/10 2/12 47,412,7 36,913,7 25,95,3 2 2 2 Длительность заболевания, лет 6,42,5 6,83,1 - Кашель, баллы 3,50,7 0,90,5 - Приступы удушья, 5,41,0 0,90,4 - 6,81,5 1,40,6 - Лейкоциты крови, 109/л 10,32,63* 8,862,30 6,180,91 Эозинофилы крови, % 3,571,83* 2,640,93 2,241,29 287118 16659 11265 ОФВ1, %должн. 66,721,3* 78,114,7* 102,79,8 ФЖЕЛ, %должн. 85,633,1* 93,314,7 114,19,4 ОФВ1/ФЖЕЛ, %должн. 71,519,6 78,47,7 84,52,1 КБДОФВ1, % 29,510,1* 14,74,2* 3,82,0 Пол, муж/жен (n) Возраст, лет Курящие, n в сутки Потребность в 2-агонистах, в сутки Эозинофилы крови, клеток/мкл Примечание: * - р<0,05 по сравнению со здоровыми добровольцами. 9 Методы исследования. Во всех группах проводилась оценка клинико-функциональных показателей, маркеров системного воспаления, оценка взаимосвязи иммунологических маркеров воспаления с клинико-функциональными показателями. У всех больных оценивались приведенные ниже клинические и функциональные показатели: Клинико-физикальное обследование включало сбор анамнеза и жалоб пациента, оценку объективных данных. Клиническая оценка симптомов БА (кашель, мокрота, одышка) проводилась однократно по 4-х балльной шкале (0 – отсутствие симптома, 3 – максимальное проявление симптома). Также оценивали число приступов удушья и потребность в симпатомиметиках короткого действия. Лабораторно-инструментальные исследования включали: общий и биохимический анализ крови, анализ мокроты, ЭКГ, рентгенографию органов грудной клетки. Аллергологическое обследование включало: сбор аллергологического анамнеза, методы, подтверждающие наличие атопии у пациентов (уровень общего IgE, кожные аллергопробы – Prick-test с бытовыми, эпидермальными, пыльцевыми аллергенами) вне обострения БА. Уровень общего IgE измеряли с использованием реагентов для количественного иммуноферментного анализа определения общего IgE в сыворотке крови в соответствии с инструкцией по применению. За нормальный уровень общего IgЕ принимали значения ниже 130 МЕ/мл. Исследование ФВД проводили с помощью прибора MasterScreen Spiro фирмы "Erich JAEGER" (Германия) в соответствии с рекомендациями ERS (Европейского респираторного общества). Оценивали объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), ОФВ1/ФЖЕЛ. Оценку полученных результатов проводили при сопоставлении данных с должными величинами, вычисленными по 10 формулам, предложенным консенсусом ERS и ATS (Американского торакального общества) [Miller M.R. et al., 2005], а их интерпретацию осуществляли с использованием методических рекомендаций [Чучалин А.Г., 2009]. Сбор КВВ. Сбор КВВ проводили в утренние часы, после двукратного ополаскивания ротовой полости водой. Для сбора КВВ использовался аппарат ECoScreen (Erich JAEGER GmbH, Германия), снабженный клапанной системой, которая позволяет осуществлять вдох из окружающей среды, а выдох – в устройство с конденсацией паров, то есть клапан не позволяет смешиваться вдыхаемому и выдыхаемому воздуху. Двухсторонний клапан используется также как уловитель слюны. Метод основывается на так называемом принципе противотока. Вещества охлаждаются приблизительно до -10 С. Сбор проводили в течение 10 мин в сидячем положении и спокойном дыхании обследуемого со средней частотой 15 в мин. Для исключения носового дыхания использовали специальные зажимы для носа. Измеряли объем собранного КВВ и немедленно помещали его в герметичные сухие термоустойчивые ДНК- и РНК- очищенные стерильные полипропиленовые пробирки типа Эппендорф (компания GREINER BIO-ONE, Австрия) объемом 1,5 мл. Пробирки с материалом немедленно замораживались в морозильнике при температуре -70 C. Собранные образцы хранились при данной температуре до проведения анализов сроком не более 1 месяца. Сбор КВВ и сыворотки крови здоровым добровольцам и больным с ремиссией БА проводили однократно. Пациентам с обострением заболевания сбор КВВ и сыворотки проводился однократно в первый-второй день поступления в стационар. Сразу после сбора проводилось измерение объема и уровня рН полученного КВВ. Измерение pH КВВ проводили немедленно после получения образца с помощью ф32 рН-метра (Beckman, США) со стеклянным микроэлектродом. 11 Калибровку рН-метра проводили стандартными растворами с рН 4,00; 7,00 и 10,00. Измерения рН в образцах КВВ проводили четырехкратно, и полученные значения обрабатывали статистически для получения средней величины. Для анализа требовалось 0,3 мл КВВ. Определение цитокинов в КВВ. Количественные уровни цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-13, ФНО-, ИФН-) в КВВ и параллельно в сыворотке крови определяли методом ИФА с помощью тест-систем «BioSource» (Бельгия) согласно приложенным инструкциям на базе лаборатории индукторов интерферона ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН. Работа выполнена совместно с к.м.н. Оспельниковой Т.П. Данный тест основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Микропланшет покрывается моноклональными антителами к исследуемому цитокину (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13). В ходе реакции в лунки планшеты добавляются стандарты, контроли и исследуемые образцы. Во время первой инкубации антиген цитокина (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13) связывается с иммобилизованными в лунках антителами одним сайтом связывания. После промывки добавляются вторые биотилированные моноклональные антитела против антигена (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13). Во время второй инкубации эти антитела связываются с иммобилизованным антигеном (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13), захваченным во время первой инкубации. После удаления избытка вторых антител добавляется стрептавидин-пероксидаза, которая связывается с биотилированными антителами с формированием сэндвичкомплекса из 4-х реагентов. После третьей инкубации и промывки удаляется несвязавшийся фермент, после чего добавляется субстратный раствор, который взаимодействует с ферментом с образованием цветного комплекса. Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации 12 цитокина (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13), присутствующего в образце. Оптическая плотность содержимого ячеек определялась с использованием автоматического фотометра для микропланшетов при длине волны 450 нм. Концентрация цитокинов определялась по калибровочной кривой «оптическая плотность/концентрация», используя данные по проводилась с концентрациям стандартов. Статистическая обработка результатов использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 for Windows. Все численные данные представлены как meanSD. Достоверность различий одноименных показателей внутри одной группы определяли при помощи парного t-критерия. Различия считались статистически достоверными при p<0,05. Для выявления зависимости между показателями использовали линейный регрессионный анализ и метод Спирмена. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Уровень рН и объем КВВ. Объем собранных образцов КВВ в группах с обострением и ремиссией БА, и в группе здорового контроля достоверно не различался (1,64±0,51 мл/10 мин; 1,48±0,22 мл/10 мин и 1,61±0,25 мл/10 мин, соответственно; р>0,05). Уровень рН КВВ у больных с обострением и ремиссией БА был достоверно ниже, чем у здоровых добровольцев (6,12±0,47 и 6,41±0,49 напротив 6,99±0,36; p<0,05) (Рис. 1). В группе с обострением БА средние значения рН были достоверно ниже по сравнению с группой ремиссии, что указывает на высокую степень активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА и разнородность исследуемых групп. Концентрация цитокинов в КВВ и сыворотке крови. Все цитокины, за исключением ИЛ-8, удалось обнаружить во всех образцах КВВ у здоровых добровольцев, тогда как в сыворотке крови удалось определить их содержание менее чем в половине образцов (рис. 2). 13 *- p<0,05 по сравнению со здоровыми людьми; **- p<0,05 по сравнению с обострением БА. 7,5 7 *,** 6,5 * 6 5,5 5 Здоровые БА,обостр. БА,ремис. Рис. 1. Уровень рН КВВ у здоровых людей и больных БА. % 100 80 % 60 сыворотка КВВ 40 20 0 ИЛ-4 ИЛ-6 ИЛ-8 ИЛ-13 ФНО-а ИФН-г Рис. 2. Частота обнаружения цитокинов в КВВ и сыворотке крови у здоровых добровольцев. Аналогичная ситуация была у больных БА (рис. 3), то есть все цитокины, за исключением ИЛ-8, в КВВ определялись намного чаще, чем в образцах сыворотки крови. 14 % 100 % 80 60 сыворотка КВВ 40 20 0 ИЛ-4 ИЛ-6 ИЛ-8 ИЛ-13 ФНО-а ИФН-г Рис. 3. Частота обнаружения цитокинов в КВВ и сыворотке крови при БА. Частота определения цитокинов в сыворотке крови распределилась следующим образом. В группе с обострением ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8, ФНО-α и ИФН-γ удалось определить в 21,4%, 28,6%, 21,4%, 28,6%, 100% и 64,3% случаев, соответственно. У пациентов с ремиссией заболевания ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8, ФНО-α и ИФН-γ удалось определить в 28,6%, 28,6%, 21,4%, 28,6%, 100% и 64,3% случаев, соответственно. В группе здорового контроля ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8, ФНО-α и ИФН-γ удалось определить в 21,4%, 14,3%, 14,3%, 21,4%, 100% и 85,7% случаев, соответственно. Средние значения ИЛ-4 в КВВ у пациентов с БА в фазе обострения и ремиссии болезни были достоверно выше по сравнению со здоровыми добровольцами (1,49±0,53 и 1,44±0,50 напротив 0,81±0,36 пг/мл; p<0,05) (Рис. 4). Содержание ИЛ-4 в сыворотке крови удалось определить у 3 человек в фазе обострения и у 4 пациентов в фазе ремиссии, и у 3 человек в группе здорового контроля. Повышение уровня ИЛ-4 в КВВ у пациентов с БА можно объяснить основными свойствами ИЛ-4. Этот цитокин относят к основным пусковым медиаторам воспаления Th2-типа. ИЛ-4 выполняет ключевую роль в 15 продукции IgЕ и экспрессии молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1) на эндотелиальных клетках, который тем самым вызывает миграцию эозинофилов из крови [Moser R. et al., 1992]. Многие авторы отмечают более высокие концентрации ИЛ-4 в КВВ у больных БА [Суровенко Т.Н. и др., 2002; Shahid S.K. et al., 2002; Matsunaga K et al., 2006; Brunetti L. et al., 2008]. В работе Robroeks и соавт. (2007) методом мультивариантной статистической регрессии показана диагностическая значимость ИЛ-4 в КВВ при постановке диагноза БА. *- p<0,05 по сравнению со здоровыми людьми Концентрация, пг/мл 2 * 1,5 * 1 0,5 0 Здоровые БА,обостр. БА,ремис. Рис. 4. Концентрация ИЛ-4 в КВВ у больных БА. У больных с обострением БА концентрация ИЛ-13 в КВВ была достоверно выше на 43% по сравнению со здоровыми добровольцами, а именно в фазе обострения его значения составили 21,05±10,04 пг/мл, в фазе ремиссии - 15,06±9,42 пг/мл, в группе здоровых добровольцев - 11,97±6,29 пг/мл (Рис. 5). Однако уровень ИЛ-13 в КВВ был значимо повышен в группе с обострением БА (p<0,05). В сыворотке крови ИЛ-13 удалось определить у небольшой части больных: в группе обострения БА – у 3 больных, в группе ремиссии - у 3 пациентов, в группе контроля - у 2 человек. 16 *- p<0,05 по сравнению со здоровыми людьми 25 Концентрация, пг/мл * 20 15 10 5 0 Здоровые БА,обостр. БА,ремис. Рис. 5. Концентрация ИЛ-13 в КВВ у здоровых людей и больных БА. Повышение ИЛ-13 можно объяснить рядом его свойств, а именно, он имеет схожую биологическую активность c ИЛ-4. ИЛ-13 также повышает синтез ИЛ-4, увеличивая количество В-лимфоцитов, усиливая синтез IgE, увеличивает экспрессию CD23 на В-лимфоцитах. ИЛ-13 отвечает за развитие и поддержание воспалительного процесса при БА. Одним из его общих свойств с ИЛ-4 является подавление Th1-клеток путем подавления продукции ИЛ-12 моноцитами, тем самым, активируя развитие Th2-типа воспалительной реакции [Le Gros G. et al., 1990; Swain S.L. et al., 1990]. Повышение экспрессии мРНК ИЛ-13 в гладкомышечном слое бронха было обнаружено у пациентов с атопической и неатопической БА [Humbert M. et al., 1997; Naseer T. et al., 1997]. Также отмечалось увеличение концентрации ИЛ-13 в БАЛ у больных БА после введения аллергена в дыхательные пути [Kroegel С. et al., 1996]. Лишь в одной работе данный биомаркер был определен в КВВ у пациентов с БА при использовании белкового чипа [Matsunaga K. et al., 2007]. 17 Уровень ИЛ-6 у пациентов в стадии обострения БА составил 2,13±1,84 пг/мл, в фазе ремиссии - 1,37±0,25 пг/мл, и в группе контроля - 1,29±0,34 пг/мл. Имелась тенденция к повышению концентрации ИЛ-6 в КВВ в группе с обострением БА, однако разница была недостоверной (p>0,05). Повышение провоспалительной группы цитокинов при БА описано и в других работах. Так, при измерении цитокинов в сыворотке крови у пациентов с БА обнаружены более высокие значения, в частности ИЛ-6, у пациентов с тяжелым течением БА по сравнению со среднетяжелым течением заболевания [Дюсембаева Н.К. и др., 2006]. Это объясняется провоспалительными свойствами цитокинов, в частности, они способны активировать воспалительный процесс путем воздействия на провоспалительные факторы транскрипции, которые отвечают за запуск воспалительного процесса. Взаимосвязь ИЛ-6 с воспалительным процессом описывается и в ряде других работ. Повышенный уровень ИЛ-6 в назальных смывах был обнаружен у детей, перенесших риновирусную инфекцию (Zhou Y. et al., 2001). Другими исследователями продемонстрировано повышение концентрации ИЛ-6 в КВВ у женщин с гормональным вариантом БА [Carpagnano G.E. et al., 2009]. ИЛ-8 не удалось определить ни в одном образце КВВ. В сыворотке крови ИЛ-8 определили в стадии обострения у 4 больных, в стадии ремиссии - у 4 пациентов, в группе контроля - у 3 человек. По своим свойствам ИЛ-8 относится к группе хемокинов. Было показано, что ИЛ-8 вызывает активацию и хемотаксис лейкоцитов [Teran L.M. et al., 1996]. Также было обнаружено, что ИЛ-8 в индуцированной мокроте удается определить лишь у больных с тяжелым течением БА. Этот факт объясняет, почему мы не смогли определить ИЛ-8 в КВВ у больных атопической формой БА среднетяжелого течения. Связь повышенного уровня ИЛ-8 и содержания нейтрофилов в индуцированной мокроте у пациентов с тяжелым течением БА описывает ряд 18 исследователей, объясняя это наличием персистирующей вирусной инфекции у данной категории больных [Shannon J. et al., 2008]. Концентрация ФНО-α в КВВ у больных БА в стадии обострения составила 4,35±2,14 пг/мл, в фазе ремиссии - 4,06±1,18 пг/мл, а в группе здорового контроля - 3,80±1,45 пг/мл (p>0,05). Уровень ФНО-α в сыворотке крови в группе обострения составил 3,19±2,94 пг/мл, в группе ремиссии 2,61±2,13 пг/мл и 3,09±2,01 пг/мл - в группе здоровых добровольцев. Однако различия были незначимыми. ФНО-α, как и ИЛ-6, относится к провоспалительной группе цитокинов. Согласно имеющимся данным, ФНО-α повышает гиперреактивность дыхательных путей и число нейтрофилов в индуцированной мокроте [Yates D.H. et al., 1993]. Также были получены сильные корреляционные взаимосвязи между содержанием ФНО-α и трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) в КВВ с концентрацией метахолина при проведении провокационного теста и недельным разбросом значений пиковой скорости выдоха (ПСВ) [Matsunaga K. et al., 2007]. Роль ФНО-α в развитии бронхообструктивных нарушений была подтверждена в исследовании с использованием антител к рецептору ФНО-α у больных с тяжелой БА. На фоне лечения этим препаратом отмечалась положительная динамика, в т.ч. снижение гиперреактивности бронхов [Hanania N., 2010]. Концентрация ИФН-γ в КВВ была ниже у пациентов с обострением БА, но разница была недостоверной. Данный маркер относится к группе Th1цитокинов. Исследования показали, что он способен снижать аллергический тип воспаления, уменьшая эозинофилию и явления гиперреактивности дыхательных путей. При анализе цитокинового профиля у детей с БА установлено достоверное снижение содержания ИФН-γ в КВВ [Shahid S.K. et al., 2002]. Также снижение уровня ИФН-γ в сыворотке крови обнаружено у пациентов с тяжелым течением БА [Hamzaoui A. et al., 2009]. Это подтверждает подавление Th1-иммунного аллергического механизма воспаления при БА. 19 ответа и преобладание С целью оценки баланса Th1- к Th2-типу воспалительной реакции в патогенезе БА проводили определение соотношения ИЛ-4 к ИФН-γ в КВВ. У пациентов с БА этот коэффициент был выше, чем у здоровых, однако разница была незначимой. В работе Shahid et al. (2002) показан дисбаланс между Th2- и Th1ответом при БА, о чем свидетельствовало достоверное повышение уровня ИЛ-4 и коэффициента соотношения ИЛ-4/ИФН-γ, а также снижение концентрации ИФН-γ в КВВ у детей с БА по сравнению с группой здорового контроля. Другие исследователи продемонстрировали, что коэффициент ИЛ4/ИФН-γ был повышен в группе больных БА по сравнению с больными атопическим дерматитом, и его уровень снижался на фоне терапии ГК [Brunetti L. et al., 2008]. Таким образом, с помощью данного коэффициента можно оценивать эффективность проводимого лечения. Корреляционный анализ. Проведенный линейный корреляционный анализ выявил обратную связь между концентрацией ИЛ-4 в КВВ и показателем ОФВ1 (r=-0,56; р<0,05) в группе с обострением БА (Рис. 6). Это связано с основными патологическими свойствами ИЛ-4, прежде всего он запускает аллергический тип воспалительной реакции, вследствие чего развивается бронхиальная обструкция. Также при обострении БА была обнаружена корреляционная связь между коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН-γ и абсолютным количеством эозинофилов крови (r=0,65; р<0,05). Данную взаимосвязь можно объяснить основными свойствами ИЛ-4, который способен индуцировать Th2 тип воспаления и параллельно вызывать хемотаксис эозинофилов (Рис. 7). В фазе ремиссии БА была выявлена прямая корреляционная взаимосвязь между уровнем ИЛ-13 и значением ОФВ1 (r=0,73; р<0,05). Это 20 свидетельствует о том, что, несмотря на купирование бронхообструктивных нарушений сохраняются явления воспаления в дыхательных путях (Рис. 8). r = - 0,56 85 80 ОФВ1,%должн. 75 70 65 60 55 50 45 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 ИЛ-4 в КВВ, пг/мл Рис. 6. Корреляция между концентрацией ИЛ-4 в КВВ и лёгочной функцией при обострении БА. r = 0,65 900 800 Эозинофилы, клеток/мкл 700 600 500 400 300 200 100 0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 ИЛ-4 / ИФН-гамма в КВВ Рис. 7. Корреляция между коэффициентом ИЛ-4/ИФН-γ в КВВ и эозинофилией крови при обострении БА. 21 При помощи непараметрического корреляционного анализа Спирмена у больных с обострением БА была обнаружена обратная взаимосвязь между объемом КВВ и значением ОФВ1 (r=-0,53; р=0,049). r = 0,73 30 25 ИЛ-13 в КВВ, пг/мл 20 15 10 5 0 -5 50 60 90 80 70 110 100 ОФВ1, %должн. Рис. 8. Корреляция между концентрацией ИЛ-13 в КВВ и лёгочной функцией при ремиссии БА. Это свидетельствует о том, что обструктивные нарушения связаны с развитием отека слизистой стенки бронхов и непосредственно гиперсекрецией слизи, которые являются проявлением воспалительного процесса при БА. Также корреляционный анализ (метод Спирмена) в группе с обострением БА выявил корреляционную связь между уровнем ИЛ-4 (цитокина атопии) в КВВ и концентрацией ФНО-α (провоспалительного цитокина) в сыворотке крови (r=0,73; р=0,003). Это указывает на синергизм ФНО-α с ИЛ-4 [Thornhill M.H. et al., 1991] и взаимосвязь местного воспаления с проявлениями провоспалительной активности. Помимо этого, с использованием метода непараметрической корреляции Спирмена в группе больных с ремиссией БА была обнаружена корреляционная связь между концентрацией ИФН-γ в КВВ и ФНО-α в 22 сыворотке крови (r=-0,61; р=0,021). Это указывает на то, что наряду с продукцией ФНО-α (провоспалительного фактора), происходит последующая активация Th2-типа воспаления, и параллельное подавление Th1-иммунного ответа на местном уровне. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о доминирующей роли атопии в патогенезе БА, о наличии сохраняющейся воспалительной активности даже в фазе ремиссии заболевания. Следовательно, определение цитокинов в КВВ расширяет возможности изучения патогенеза БА, поможет определить основные биомаркеры в диагностике этого заболевания. В данной работе нами проведено одномоментное исследование цитокинового паттерна КВВ и сыворотки крови, и полученные данные указывают на перспективу данной методики. Для более глубокого понимания роли цитокинов при БА следует оценить содержание цитокинов в КВВ у больных с разным течением и фенотипами БА, измерить их концентрацию на фоне проводимого противовоспалительного лечения. Однако в настоящее время сохраняется ряд вопросов по методике определения различных цитокинов в КВВ. До сих пор не определен, какой из методов является наиболее оптимальным, учитывая низкие их концентрации в этой биологической жидкости. Необходимо проведение дальнейших исследований с целью разработки методологических стандартов и внедрения этого метода в повседневную клиническую практику. ВЫВОДЫ 1. В КВВ больных БА удалось определить как провоспалительные, так и противовоспалительные цитокины, за исключением ИЛ-8. 2. Анализ цитокинов в КВВ позволил всесторонне оценить активность местного воспаления в дыхательных путях у пациентов с БА, в то время как их уровень в сыворотке крови отражает системный характер воспаления в период обострения и ремиссии. 23 3. Увеличение концентрации ИЛ-4, 6 и 13 в КВВ у больных БА указывает на степень выраженности воспалительного процесса в дыхательных путях и позволяет оценить эффективность проводимого лечения. 4. Наличие взаимосвязи между содержанием ИЛ-4 в КВВ и показателем ОФВ1, а также коэффициента ИЛ-4/ИФН-γ в КВВ и эозинофилии крови у больных с обострением БА свидетельствует о доминирующей роли атопического компонента в воспалительной реакции дыхательных путей. 5. Выявленная корреляционная взаимосвязь между содержанием ИЛ-13 в КВВ и значением ОФВ1 в период ремиссии свидетельствует о персистирующем характере воспаления дыхательных путей у больных БА. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Анализ цитокинов в КВВ следует использовать в качестве неинвазивного метода оценки активности местного воспалительного процесса в дыхательных путях при БА. 2. Определение концентрации различных интерлейкинов, ИФН-γ и ФНОα в КВВ является важным способом оценки эффективности проводимого лечения. 3. Исследование цитокинов в КВВ следует использовать для оценки степени выраженности и природы обострения для определения фенотипа заболевания, что позволяет уточнить дальнейшую тактику ведения пациентов с БА. Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Анохина Т.Н., Чучалин А.Г. Цитокиновый статус конденсата выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме. Пульмонология. 17-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сборник трудов конгресса. Казань, 2007; А255, с.105. 2. Анохина Т.Н., Анаев Э.Х., Дугарова И.Д., Чучалин А.Г. Оценка 24 функции легких при сборе конденсата выдыхаемого воздуха. Пульмонология. 17-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сборник трудов конгресса. Казань, 2007; А254, с.105. 3. Dugarova I., Anaev E., Ospel`nikova T., Anokhina T., Chuchalin A. Inflammatory markers in exhaled breath condensate in patients with asthma. Materials of the III international scientific conference “Traditional medicine: a current situation and perspectives of development”. August 1822, 2008; Ulan-Ude, Russia. - P.145. 4. Dugarova I., Anaev E., Ospelnikova T., Anokhina T., Chuchalin A. Cytokines in exhaled breath condensate of patients with asthma. Eur Respir J. 2008; Vol.32, (Suppl.52). - P.187s-188s. 5. Anaev E., Chuchalin A., Dugarova I., Ospelnikova T. Inflammatorische Zytokine im Atemkondensat und Serum bei Asthma bronchiale. Pneumologie. 2009; Vol.63, Suppl. - S.32. 6. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г. Экспрессия цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха и ее взаимосвязь с клинико-функциональными показателями бронхиальной астмы. Тезисы докладов научно-практической конференции «Актуальные вопросы респираторной медицины», Москва, 4-5 марта 2009 г., с.50. 7. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Чучалин А.Г. О роли цитокинов при бронхиальной астме. Пульмонология. 2009; №4, с.96-102. 8. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Чучалин А.Г. Цитокины в конденсате выдыхаемого воздуха и их взаимосвязь с клинико-функциональными показателями бронхиальной астмы. 19-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сборник трудов конгресса. Москва, 2009; А175, с.156. 9. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Чучалин А.Г. Экспрессия цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха и её взаимосвязь с клинико-функциональными бронхиальной астмы. Пульмонология. 2010; №3, с.57-61. 25 показателями Список сокращений БА – бронхиальная астма БАЛ – бронхоальвеолярный лаваж ГК – глюкокортикоиды ИКЧ – индекс курящего человека ИЛ-4 – интерлейкин-4 ИЛ-6 – интерлейкин-6 ИЛ-8 – интерлейкин-8 ИЛ-13 – интерлейкин-13 ИФН-γ – интерферон-гамма КБД – коэффициент бронходилатации КВВ – конденсат выдыхаемого воздуха ОФВ1 – объем форсированного выдоха за первую секунду ПСВ – пиковая скорость выдоха ФВД – функция внешнего дыхания ФЖЕЛ – форсированная жизненная ёмкость легких ФНО-α – фактор некроза опухолей-α ХОБЛ – хроническая обструктивная болезнь лёгких ATS – Американское торакальное общество ERS – Европейское респираторное общество GINA – Глобальная стратегия по бронхиальной астме IgE – иммуноглобулин класса Е TGF-β – трансформирующий фактор роста-β VCAM-1 – молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа 26