полный текст автореферата (doc
реклама
На правах рукописи НИКОЛАЕВА ВАРВАРА ВАЛЕРЬЕВНА СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОВ ДОФАМИН-БЕТАГИДРОКСИЛАЗЫ И КАТЕХОЛ-ОРТО-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ У БОЛЬНЫХ АЛКОГОЛИЗМОМ 14.01.27 наркология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2010 Работа выполнена в ФГУ «Национальный научный центр наркологии Росздрава» (и.о. директора – д.м.н., профессор М.А. Винникова) Научный руководитель Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Анохина Ирина Петровна Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук, профессор Москаленко Валентина Дмитриевна Коган Борис Михайлович Ведущая организация ФГУ «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского Росздрава» Защита состоится 30 марта 2010 г. В 10 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.051.01 при ФГУ ННЦ наркологии по адресу: 119002, г. Москва, Малый Могильцевский пер., д.3 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ННЦ наркологии по адресу: 119002, г. Москва, Малый Могильцевский пер., д.3 Автореферат разослан «______» __февраля__2010 г. Ученый секретарь совета, кандидат биологических наук Львова Ольга Федоровна Актуальность проблемы. Согласно данным современных нейрохимических и физиологических исследований, существенную роль в патогенезе алкогольной зависимости играют изменения обмена катехоламинов в мозге. В работах, проведенных под руководством академика И.П. Анохиной, убедительно показано, что состояние зависимости от алкоголя и других психоактивных веществ (ПАВ) обусловлено нарушением функционирования катехоламиновой нейромедиации в мезолимбических структурах мозга. Развивающиеся нейрохимические изменения приводят к формированию характерной клинической картины болезни – синдрому патологического влечения к алкоголю, синдрому отмены, психотическим осложнениям (Анохина И.П., Коган Б.М., 1988). Однако до настоящего времени остаются не полностью выясненными конкретные причины этих нарушений, их роль в генезе различных проявлений болезни, что в свою очередь ограничивает возможность изыскания и разработки эффективных средств патогенетической терапии алкоголизма и его осложнений. Известно, что алкоголизм имеет различные варианты течения у различных больных (прогредиентность, тяжесть синдрома отмены, осложнения) и в формировании зависимости от алкоголя огромное значение имеют индивидуальные биологические, личностные и социальные характеристики индивидуума. Во многих исследованиях показано, что наследственные факторы в развитии этого тяжелого заболевания играют не последнюю роль. Об этом убедительно свидетельствуют данные семейных и близнецовых исследований (Москаленко В.Д., 2000). Показано, что риск заболевания существенно возрастает при наличии в роду больных алкогольной зависимостью, у таких пациентов заболевание развивается ускоренно и в более раннем возрасте. Носителем наследственной информации в ряду поколений является генотип каждого человека, химической основой которого является молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Установлено, что основным отличием в ДНК людей являются единичные замены нуклеотидов или однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП). Некоторые из ОНП являются функциональными, т.е. замена одного нуклеотида на другой приводит к 3 изменению экспрессии гена или к изменению аминокислотной последовательности кодируемого геном белка и, следовательно, к изменению его свойств (активности ферментов). Полиморфизм генов приводит к существованию нескольких аллельных вариантов одного и того же гена. Следовательно, изучение аллельных вариантов генов, кодирующих белки катехоламиновой системы организма у больных с алкогольной зависимостью, позволит подойти к пониманию базовых генетических механизмов развития алкоголизма у человека. Важной составной частью катехоламиновой системы организма являются белки-ферменты, активность которых в значительной степени оказывает влияние на все процессы нейромедиации. В настоящем исследовании были выбраны однонуклеотидные функциональные полиморфизмы генов, кодирующих белки-ферменты синтеза и распада катехоламинов - дофаминбета-гидроксилазу (ДБГ) и катехол-орто-метилтрансферазу (КОМТ). Дофамин-бета-гидроксилаза – фермент, катализирующий реакцию синтеза норадреналина из дофамина путем β-гидроксилирования, является связующим звеном двух важнейших частей катехоламиновой системы организма - дофаминергической и норадренергической. ДБГ является одним из лимитирующих ферментов биосинтеза норадреналина. Катехол-ортометилтрансфераза – фермент, катаболизирующий катехоламины путем ометилирования. Основной функцией фермента катехол-ортометилтрансферазы в катехоламиновой системе является элиминация биологически активных катехоламинов. Цель исследования Изучить связь функциональных полиморфизмов генов ферментов синтеза и катаболизма катехоламинов - дофамин-бета-гидроксилазы и катехол-орто-метилтрансферазы – с развитием и особенностями течения алкогольной зависимости, а также с наследственным отягощением этим заболеванием. 4 Задачи исследования 1. Определить активность фермента дофамин-бета-гидроксилазы в плазме крови больных алкоголизмом с различной наследственной отягощенностью и различным течением. 2. Провести у больных алкоголизмом генотипирование генов ферментов дофамин-бета-гидроксилазы и катехол-орто-метилтрансферазы по функционально значимым полиморфным локусам. 3. Изучить возможную связь аллельных вариантов гена дофамин-бетагидроксилазы с активностью данного фермента. 4. Исследовать распределение аллельных вариантов генов дофамин-бетагидроксилазы и катехол-орто-метилтрансферазы по изучаемым полиморфизмам в группах больных с наличием или отсутствием наследственной отягощенности алкоголизмом. 5. Исследовать распределение аллельных вариантов генов дофамин-бетагидроксилазы и катехол-орто-метилтрансферазы по изучаемым полиморфизмам в группах больных с различным течением алкогольной зависимости (прогредиентность, тяжесть синдрома отмены, осложнения). Научная новизна Впервые у больных алкоголизмом российской популяции проведено клинико-генетическое исследование функциональных полиморфизмов гена дофамин-бета-гидроксилазы в сопоставлении с активностью данного фермента и установлена их связь с наследственной отягощенностью и особенностями течения болезни. Впервые у больных алкоголизмом российской популяции проведено клинико-генетическое исследование функционального полиморфизма гена катехол-орто-метилтрансферазы и установлена корреляция молекулярногенетических особенностей с наследственной отягощенностью и особенностями течения болезни. 5 Положения, выносимые на защиту 1. В данном исследовании установлено, что замена цитозина на тимин С/Т в положении -1021 гена дофамин-бета-гидроксилазы приводит к статистически значимому снижению активности фермента. В группе больных с высокопрогредиентным течением заболевания уровень активности фермента снижен и имеется выраженная тенденция к увеличению количества низкоактивных Т-аллелей по 1021 С/Т полиморфизму гена дофамин-бета-гидроксилазы по сравнению с контрольной группой здоровых людей. 2. У больных с наследственной отягощенностью уровень активности дофамин-бета-гидроксилазы статистически достоверно снижен и выявлено статистически достоверное увеличение гетерозиготных С/Т и гомозиготных Т/Т вариантов генотипов по 1021 С/Т полиморфизму гена дофамин-бета-гидроксилазы, определяющих низкую активность фермента, по сравнению со здоровыми людьми и больными без наследственного отягощения. С увеличением степени семейной отягощенности наблюдается тенденция к увеличению доли носителей низкоактивных Т-вариантов гена дофамин-бета-гидроксилазы по 1021 С/Т полиморфизму по сравнению со здоровыми людьми и группой больных без наследственного отягощения. 3. При алкоголизме с наследственной отягощенностью наблюдается статистически достоверное увеличение высокоактивных валиновых G-аллелей по Val158/108Met полиморфизму гена катехол-ортометилтрансферазы по сравнению с контрольной группой здоровых лиц. 4. При осложненном течении заболевания при синдроме отнятия (алкогольный делирий, алкогольный галлюциноз, судорожный синдром) выявлено статистически достоверное увеличение низкоактивных А аллелей по 444 G/A полиморфизму гена дофамин-бета-гидроксилазы по сравнению с группой больных с неосложненным течением заболевания, что позволяет говорить о носительстве А-аллеля, как о предрасполагающем к развитию этих тяжелых осложнений. 6 Практическая значимость Результаты исследования могут быть использованы для медикогенетического консультирования пациентов по проблеме риска развития алкогольной зависимости и ее осложнений. Апробация работы Основные положения диссертационной работы были доложены на внутрилабораторной конференции лаборатории психофармакологии ННЦ наркологии Росздрава, заседании Проблемной комиссии по медикобиологическим проблемам наркологии ННЦ наркологии Росздрава, 1 Российском Национальном конгрессе по наркологии. Публикация результатов исследования По теме диссертации опубликовано 6 работ, перечень которых приведен в автореферате. Внедрение результатов исследования Данные выполненной работы о связи полиморфизмов 1021 С/Т и 444 G/A гена дофамин-бета-гидроксилазы с клиническими проявлениями и наследственным отягощением алкоголизма используются в практике медико-генетического консультирования пациентов с целью уяснения риска развития алкоголизма в отделе «Постгеномные и нанотехнологические инновации» на базе Инновационного центра медицинских нанобиотехнологий ФГУ НИИ Физико-химической медицины Росздрава. Объем и структура диссертационной работы Диссертация объемом 155 страниц включает введение, литературный обзор, 6 глав, выводы, заключение, список литературы, состоящий из 48 источников отечественных авторов, 264 - зарубежных авторов, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. 7 Материалы и методы исследования. Клинический метод. В соответствии с поставленной целью и задачами были обследованы 260 больных алкоголизмом мужского пола, находившихся на стационарном лечении в клинике ННЦ наркологии Росздрава. Все пациенты имели диагноз алкоголизма 2 или 3 стадий, средний возраст больных составлял 42±12,5 года. Пациенты с верифицированной психопатологией (шизофрения, депрессивные состояния и др.) исключались из исследования. В контрольную группу вошли 93 здоровых мужчины, средний возраст 41,5 ± 11,3 года, не употребляющие алкоголь систематически. Данные об анамнезе заболевания содержали следующую информацию возраст начала систематического употребления алкоголя, возраст формирования алкогольного абстинентного синдрома (ААС), осложнения заболевания (алкогольные психозы, алкогольная эпилепсия), длительность ремиссий. Семейный анамнез включал в себя данные о наличии или отсутствии алкоголизма и других зависимостей от ПАВ у родственников 1 и 2 степеней родства пробандов. Эти данные были получены со слов больного и доступных для интервью родственников. Также проводилась подробная клиническая оценка течения алкоголизма у каждого больного, участвующего в исследовании - стадия болезни, толерантность к алкоголю, прогредиентность заболевания, особенности ААС, развившиеся осложнения. Анамнестические и клинические данные об особенностях заболевания, наследственной отягощенности, сопутствующей патологии вошли в специально разработанную в ННЦ наркологии анкету. Клиническое обследование больных и заполнение анкеты проводилось врачами психиатрами-наркологами ННЦ наркологии Росздрава. Молекулярно-генетические методы. Для проведения генотипирования по 2 функциональным однонуклеотидным полиморфизмам в гене ДБГ полиморфизму1021 С/Т и полиморфизму 444 G/A был использован высокопроизводительный метод анализа путем минисеквенирования с MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionisation) масс-спектрометрией. Генотипирование гена КОМТ по Val 158/108 Met однонуклеотидному полиморфизму было проведено методом анализа полиморфизма длины 8 рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Биохимический гидроксилазы метод. Определение активности дофамин-бета- в плазме крови больных алкоголизмом и здоровых испытуемых проводили спектрофотометрическим методом по Nagatsu и Udenfriend (1979). Статистический методы. Результаты клинического, биохимического и молекулярно-генетического исследований больных алкоголизмом и здоровых испытуемых контрольной группы были обработаны согласно правилам и критериям, применяемым в медицинской генетике и медикобиологической статистике. При статистическом анализе количественных признаков использовался подсчет среднего значения, стандартного отклонения, медианы, процентилей. Проводился анализ вида распределения вариант в исследуемых группах по критерию Лиллиефорса, критерию Шапиро-Уилка. При сравнении двух групп по количественному признаку при нормальном распределении вариант был применен критерий Стьюдента. При распределении вариант в сравниваемых группах, отличном от нормального, использовались непараметрические критерии МаннаУитни, Колмогорова-Смирнова, Краскела-Уоллиса. Сравнение групп между собой по распределению качественного признака проводилось с применением критерия χ2 Пирсона, критерия χ2 с поправкой Йетса для таблиц 2х2. При малом числе наблюдений в группах использовался расчет точного двустороннего критерия Фишера. Статистический анализ материала был проведен с использованием компьютерных программ Statistica 6.0 для Windows, Microsoft Excel 2003, Biostat. Результаты исследования. В работе было проведено исследование активности дофамин-бетагидроксилазы в плазме крови у группы больных алкоголизмом 2 и 3 стадий заболевания параллельно с генотипированием по 1021 С/Т полиморфизму гена дофамин-бета-гидроксилазы. Среднее значение активности дофаминбета-гидроксилазы в группе больных алкоголизмом составило 33,66 ± 16,54 нмоль/мл/мин. В контрольной группе здоровых доноров активность дофамин-бета-гидроксилазы составила 38,45 ± 15,5 нмоль/мл/мин, что статистически достоверно выше, чем у больных алкоголизмом ( критерий 9 Манна-Уитни р<0,05). В исследуемой группе были выделены подгруппы больных с наследственным отягощением алкоголизмом (2 и более родственника 1- 2 степени родства больны алкоголизмом) и без наследственного отягощения. Среднее значение активности ДБГ в группе наследственно неотягощенных больных было выше и составило 36,37 ±15,0 нмоль/мл/мин, чем в группе больных с наследственным отягощением алкоголизмом 29,85±14,04 нмоль/мл/мин (межгрупповые различия статистически достоверны по критерию Колмогорова-Смирнова, p<0,05 и по критерию Манна-Уитни, p<0,05). В исследуемой группе больных были выделены подгруппы больных с высокопрогредиентным и малопрогредиентным течением алкоголизма. Активность дофамин-бета-гидроксилазы у больных с высокопрогредиентным вариантом течения алкоголизма была ниже (27,9±11,73 нмоль/мл/мин), чем у больных с малопрогредиентным течением заболевания (36,4±13,19 нмоль/мл/мин) (критерий Манна-Уитни, p=0,08). У всех больных с крайне низкой активностью дофамин-бета-гидроксилазы (11,17±5,8 нмоль/мл/мин) высокой прогредиентности заболевания сопутствовал тяжело протекающий абстинентный синдром, также для них было характерно постоянное влечение к алкоголю, частые рецидивы заболевания. Больные с различной прогредиентностью заболевания были различны по возрасту (критерий Стьюдента p < 0,001). Пациенты с высокопрогредиентным алкоголизмом были значительно моложе - их средний возраст составлял 35,04 ± 11,48, в то время как средний возраст больных с малопрогредиентным течением алкоголизма – 50,06 ± 10,0 лет. Средний возраст начала систематического употребления алкоголя при высокопрогредиентном алкоголизме составил 21,2 года, а при малопрогредиентном – 27,12 года. Таким образом, сниженная активность дофамин-бета-гидроксилазы, приводящая к дисбалансу обмена катехоламинов при алкоголизации (росту соотношения дофамин/норадреналин), способствует раннему началу систематического употребления алкоголя и высокопрогредиентному течению заболевания. Возникающее при хронической алкоголизации угнетение ДБГ вследствие 10 токсического действия этанола на нейроны синего пятна (Locus cereleus) головного мозга в сочетании с прямым ингибированием этанолом функции фермента обусловливает стремительное формирование абстинентного синдрома и его тяжелое течение у больных с высокопрогредиентным алкоголизмом, выраженное влечение у них к алкоголю. Далее в работе был проведен анализ влияния полиморфизма 1021 C/T гена дофамин-бета-гидроксилазы на активность данного фермента в плазме крови больных алкоголизмом. Было установлено, что в группе больных, имеющих вариант генотипа 1021 C/C, активность дофамин-бетагидроксилазы была выше (34,83 ±11,65 нмоль/мл/мин), чем в группах с генотипами 1021 C/T (27,68±12,48 нмоль/мл/мин) и 1021 T/T (22,82±13,32 нмоль/мл/мин) (межгрупповые различия достоверны по критерию Краскела – Уоллиса, p=0,04). Таким образом, изученный полиморфизм оказывает заметное влияние на активность фермента - замена цитозина на тимин (С/Т) в положении 1021 гена дофамин-бета-гидроксилазы приводит к статистически значимому снижению активности фермента. С целью выявления возможной связи аллельных вариантов гена дофамин-бета-гидроксилазы с формированием алкогольной зависимости был проведен анализ частот распределения генотипов и аллелей по 1021 С/Т и 444 G/A полиморфным локусам гена дофамин-бета-гидроксилазы в группах здоровых людей и больных алкоголизмом, различающихся по прогредиентности, наличию осложнений, наличию или отсутствию наследственной отягощенности алкоголизмом. В группу с осложненным течением вошли больные, перенесшие алкогольный делирий (58%), алкогольный галлюциноз (25%), судорожные припадки (алкогольная эпилепсия) (17%) в абстинентном состоянии. 11 Таблица 1. Генотип 1021 С/Т гена дофамин-бета-гидроксилазы и течение хронического алкоголизма. Генотипы Группа CT TT 0,58 0,38 0,04 Больные хроническим 0,55 0,34 алкоголизмом N-260 0,11 Здоровые люди (контроль) N-93 CC Больные алкоголизмом 0,37 с 0,50 высокопрогредиентным течением N-61 аллели C T 0,77 0,23 0,72 0,28 0,68 0,32* 0,13 * критерий χ2 с поправкой Йетса 2,88, р =0,07 по со сравнению с контролем Из данных, представленных в таблице 1, следует, что в общей группе больных алкоголизмом имеется тенденция к увеличению доли гомозиготного низкоактивного Т/Т генотипа по 1021 С/Т полиморфизму гена ДБГ, детерминирующего низкую активность фермента и соответственно процесса β-гидроксилирования дофамина по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 =3,83, df=2, р=0,14). В группе больных с высокопрогредиентным течением заболевания наблюдается увеличение количества низкоактивных гомозиготных вариантов генотипов Т/Т (критерий χ2= 4,2, df=2, р=0,12) и количества Т-аллелей по сравнению с контрольной группой здоровых людей (критерий χ2 с поправкой Йетса 2,88, р=0,07). Установлено также, что частота гомозиготного генотипа 444 A/A по 444 G/A полиморфизму, связанного с низкой активностью дофамин-бетагидроксилазы в спинномозговой жидкости, в группе больных высокопрогредиентным алкоголизмом была выше, чем в группе здоровых людей. Таким образом, как и в случае 1021 C/T полиморфизма, наблюдается небольшой, но устойчивый рост числа низкоактивных аллелей гена дофаминбета-гидроксилазы по 444 G/A полиморфизму в группе больных высокопрогредиентным алкоголизмом по сравнению с группой здоровых 12 лиц. Известно, что для высокопрогредиентного алкоголизма характерно раннее начало, массивная алкоголизация, стремительное формирование психологической зависимости, быстрое развитие (до 5 лет) алкогольного абстинентного синдрома (физической зависимости) после начала систематического употребления алкоголя, малая курабельность, короткие ремиссии. Накопление низкоактивных Т - аллелей гена дофамин-бетагидроксилазы по 1021 С/Т полиморфизму и гомозиготных низкоактивных вариантов генотипов 444 А/А при высокопрогредиентном алкоголизме, повидимому, может обусловливать раннее формирование синдрома лишения при этом варианте заболевания. Так как генетически детерминированная сниженная способность к β-гидроксилированию дофамина наряду с ускорением его синтеза и выброса при хронической алкоголизации и особенно при прекращении систематического приема алкоголя имеет следствием разбалансировку функционирования катехоламиновой системы организма, росту соотношения дофамин/норадреналин в мозге и крови, которое и обусловливает симптоматику синдрома отмены. Продемонстрированное ранее влияние недостаточности процесса βгидроксилирования дофамина на развитие психогенных депрессий и неустойчивость к стрессу может объяснить большое число срывов у больных высокопрогредиентным алкоголизмом, уменьшение сроков ремиссий, так как именно сниженная реакция на стресс и депрессивные состояния являются мотивацией к употреблению алкоголя. 13 Таблица 2. Полиморфизм 444G/A гена ДБГ и течение хронического алкоголизма Генотипы Группа GG GA Здоровые люди ( контроль) N-93 0,25 0,50 Больные с неосложненным течением алкоголизма N-80 Больные с осложненным течением алкоголизма N-40 аллели AA G A Носители A-аллеля 0,50 0,50 0,75 0,48 0,51 0,25 0,24 0,49 0,27 0,76 0,10 0,53 0,37 0,363 0,637* 0,9 * критерий χ2с поправкой Йетса 3,37, p=0,04 по сравнению с неосложненным течением алкоголизма Большой исследовательский интерес представляла группа больных с осложненным течением алкоголизма (см. Таблицу 2). В данную группу были включены больные (40 человек) с алкогольным делирием (58%), эпилептическими припадками (17%) в ААС, алкогольным галлюцинозом (25%) в анамнезе. По распределению генотипов по 444 G/A полиморфизму гена дофамин-бета-гидроксилазы группа больных с осложненным алкоголизмом отличалась от группы больных с неосложненным алкоголизмом в сторону увеличения гомозиготных низкоактивных А/А генотипов (критерий χ2 = 4,23, df=2, p=0,12) и количества А-аллелей (критерий χ2с поправкой Йетса 3,37, p=0,04), в то время как распределение генотипов и аллелей в группах здоровых людей и больных без осложнений не отличались между собой (критерий χ2=0,196, df=2, р=0,9). Увеличение доли А-аллелей и 444 А/А гомозигот гена ДБГ в этой группе по сравнению с группой больных без осложнений позволяет говорить о 444 А/А генотипе как о предрасполагающем к их развитию. Следует отметить, что все 14 больные с судорожным синдромом в ААС имели G/A или A/A, но не G/G генотип по 444 полиморфному локусу ДБГ. В целом, в результате анализа данных генотипирования, мы отмечаем стойкую тенденцию к увеличению носителей низкоактивного А-аллеля ДБГ с увеличением степени тяжести алкоголизма, особенно в группе больных с осложнениями. Ранее было показано, что средний уровень активности ДБГ в спинномозговой жидкости у 444 G/G гомозигот выше, чем у 444 А/А гомозигот (Cubells J.F., 1998). Известно, что полиморфизм 444G/A гена ДБГ представляет собой синонимичную замену гуанина на аденин в крайнем 3'положении 2 экзона гена ДБГ (Kobayashi K., 1989). Предполагается, что данная замена может оказывать влияние на эффективность процесса сплайсинга, изменяя таким образом количество зрелой матричной РНК (мРНК) ДБГ. Снижение количества молекул зрелой мРНК у А/А гомозигот гена ДБГ приводит к уменьшению количества молекул фермента и соответственному уменьшению его активности, менее активному процессу β-гидроксилирования дофамина при отмене алкоголя. Как следствие этого происходит рост соотношения дофами/норадреналин в тканях мозга. Предположительно, именно данный дисбаланс является главной биохимической основой развития психотических и судорожных состояний в абстиненции. Далее в работе была проведена оценка влияния наследственного фактора на течение алкоголизма в исследуемой группе пациентов. В изучаемой выборке течение алкоголизма у лиц с наследственным отягощением было несколько более тяжелым по сравнению с больными без наследственной отягощенности, что согласуется с наблюдениями, сделанными ранее другими исследователями (Таблица 3). 15 Таблица 3. Характеристика групп наследственно отягощенных и неотягощенных больных по клиническим признакам течения хронического алкоголизма Наследственно Наследственно неотягощенные отягощенные больные больные алкоголизмом N-74 алкоголизмом N-63 41,06±10,16 Средний возраст больных, годы 45,11±11,7 Высокопрогредиентное течение алкоголизма, частота 0,17 0,31* Начало систематического употребления алкоголя до 20 лет, частота 0,19 0,28 0,14 0,27 0,08 0,20 0,14 0,20 Тяжелый ААС, частота Психопатологическая составляющая ААС, частота Осложненный алкоголизм, частота * критерий χ2 с поправкой Йетса=2,69 р=0,10 по сравнению с наследственно неотягощенными Из данных таблицы 3 следует, что у больных с наследственной отягощенностью алкоголизмом имела место повышенная частота высокопрогредиентного варианта течения заболевания (критерий χ2 с поправкой Йетса 2,69, р=0,10), чаще наблюдался абстинентный синдром в тяжелой форме (критерий χ2 с поправкой Йетса 2,59, р=0,1) и его психопатологические проявления (критерий χ2 с поправкой Йетса 3,22, 16 р=0,046). Психопатологические проявления ААС включают в себя суицидальные мысли и поведение, тревогу, страх, подавленность, дисфорию, идеи отношения и виновности, тотальную бессонницу, гипнагогические галлюцинации, слуховые и зрительные иллюзорные обманы, яркие сновидения, просоночные состояния с временной дезориентировкой в окружающем. Таблица 4. Полиморфизм 1021 С/Т гена ДБГ и наследственная отягощенность больных по алкоголизму. Генотипы аллели Носители Т-аллеля Группа CC CT TT C T Здоровые люди (контроль) N-93 0,58 0,38 0,04 0,77 0,23 0,41 0,58 Наследственно неотягощенные больные алкоголизмом N-46 0,33 0,09 0,74 0,26 0,43 Наследственно отягощенные больные алкоголизмом N-67 0,41 0,49* 0,10 0,655 0,335 0,59 Больные алкоголизмом, наследственно отягощенные по обеим линиям родства N-18 0,33 0,55 0,11 0,64 0,66 0,36 * критерий χ2 =5,8, df=2, р=0,045 по сравнению с контрольной группой Как следует из данных таблицы 4 в группе больных с наследственной отягощенностью алкоголизмом наблюдалось статистически достоверное увеличение гетеро - (С/Т) и гомозиготных (Т/Т) низкоактивных вариантов генотипов гена дофамин-бета-гидроксилазы по сравнению с группой здоровых (критерий χ2=5,8, df=2, р=0,045) (Таблица 4). При наследственно отягощенном алкоголизме наблюдается тенденция к увеличению частоты 17 С/Т гетерозиготного генотипа гена дофамин-бета-гидроксилазы (критерий χ2 =3,79, df=2, р=0,15) по сравнению с алкоголизмом без наследственного отягощения. По-видимому, присутствие гетерозиготного С/Т варианта генотипа дофамин-бета-гидроксилазы, определяющего сниженную активность фермента, у наследственно отягощенных больных предрасполагает к развитию вышеуказанных психопатологических проявлений в ААС и к развитию более тяжелой формы абстинентного синдрома, связанной с высоким содержанием дофамина в мозге. Результаты проведенного исследования показывают, что с увеличением степени семейной отягощенности алкоголизмом наблюдается тенденция к увеличению количества носителей низкоактивных гетерозиготных вариантов гена дофамин-бета-гидроксилазы по 1021 С/Т полиморфизму. Анализ распределения генотипов в группе больных (18 человек), имеющих родственников, страдающих алкогольной зависимостью с обеих сторон родства – материнской и отцовской, показал, что 1021 С/Т гетерозигот в ней на 22 % больше, чем в группе больных алкоголизмом без наследственного отягощения (критерий χ2 с поправкой Йетса 1,8, р=0,16). В исследуемой выборке присутствовали больные, имеющие отца и мать, страдающих алкогольной зависимостью. В этой группе наблюдалось увеличение доли гомозиготных 444 A/A генотипов, связанных с низкоактивной формой дофамин-бета-гидроксилазы, на 34% по сравнению с контрольной группой здоровых людей (точный двусторонний критерий Фишера р=0,034). Для больных алкоголизмом, у которых алкогольной зависимостью страдали оба родителя – отец и мать, было характерно тяжелое течение заболевания (высокопрогредиентное течение, тяжелая форма ААС, отсутствие спонтанных ремиссий, продуктивные осложнения в ААС). Наиболее вероятным фактором, вносящим свой вклад в утяжеление течения алкоголизма у сыновей по сравнению с болезнью их отцов, представляется ассортативность браков, установленная в семьях больных алкоголизмом (Гунько А.А.,1991). В результате ассортативности браков происходит накопление генов в нисходящих поколениях, которые модифицируют тяжесть заболевания. Рассматривая сочетания генотипов по обоим полиморфным локусам гена ДБГ в группе больных, у которых 18 алкоголизмом страдали оба родителя, важно отметить, что в данной группе 1 больной имел сочетание генотипов CCAA, 3 человека – CTAA, 1 человек CТGA, 1 человек TTAA. Таким образом, в этой группе не выявлено ни одного сочетания CCGG или CCGA, т.е. ни один из этих больных не имел двух высокоактивных аллелей гена ДБГ. На основании полученных в нашем исследовании данных можно предположить, что увеличение доли низкоактивных Т-аллелей по 1021 С/Т полиморфизму и А-аллелей по 444 G/A полиморфизму гена ДБГ, определяющих сниженную активность фермента ДБГ, в группе больных алкоголизмом с наследственной отягощенностью, может служить генетической основой утяжеления течения болезни у данных пациентов. Фермент катехол-орто-метилтрансфераза (КОМТ) катаболизирует катехоламины путем о-метилирования. Основной функцией этого фермента в катехоламиновой системе является элиминация биологически активных катехоламинов. Активность КОМТ регулирует количество свободного дофамина и норадреналина в различных областях мозга и, вследствие этого оказывает влияние на настроение и другие психические процессы. Известно, что замена гуанина на аденин в 158/108 положении гена КОМТ, приводящая к замене аминокислоты валина на метионин в молекуле белка ( ATG/Met/низкоактивный аллель, GTG/Val/высокоактивный аллель) снижает активность фермента в 3-4 раза (Grossman M.H., 1992; Lotta T., 1995). В работе было изучено распределение аллельных вариантов гена фермента катехол-орто-метилтрансферазы по Val 158/108 Met полиморфизму в группах больных алкоголизмом и здоровых людей контрольной группы. Как следует из таблицы 5, при сравнении частот распределения аллельных вариантов гена катехол-орто-метилтрансферазы по Val 158/108 Met полиморфизму была обнаружено статистически достоверное увеличение высокоактивных валиновыхG-аллелей(критерий χ2 с поправкой Йетса 3,26, р=0,04) и G/G гомозиготных вариантов гена в группе больных с наследственным отягощением по алкоголизму (критерий χ2=3,65, df=2, р=0,16) по сравнению с группой контроля. 19 Таблица 5. Полиморфизм Val 158/108 Met гена катехол-Ометилтрансферазы и наследственная отягощенность больных по алкоголизму. Генотипы аллели Группа GG GA AA G A Здоровые люди (контроль)N-87 0,18 0,47 0,35 0,42 0,58 Наследственно неотягощенные больные алкоголизмом N-56 0,18 0,54 0,28 0,45 0,55 Наследственно отягощенные больные алкоголизмом N-65 0,30 0,45 0,25 0,54* 0,46 *критерий χ2 с поправкой Йетса 3,26, р=0,04 по сравнению с контрольной группой Наличие двух высокоактивных аллелей гена катехол-ортометилтрансферазы приводит к высокой активности данного фермента в лимбической области и в области фронтальной коры, что имеет следствием снижение содержания свободного дофамина. По-видимому, именно снижение дофаминергического влияния в этих областях мозга, может служить патофизиологической основой развития аффективных расстройств (стертые апато-ангедонические состояния) в преморбидном периоде у больных хроническим алкоголизмом. В группе больных с наследственной отягощенностью по алкоголизму, как указывалось выше, имела место повышенная частота высокопрогредиентного варианта течения заболевания по сравнению с группой больных без наследственной отягощенности, чаще наблюдался 20 абстинентный синдром в тяжелой форме и его психопатологические проявления. Для высокопрогредиентного алкоголизма характерно высокое патологическое влечение к алкоголю. Увеличение количества аллелей, детерминирующих высокую активность катехол-орто-метилтрансферазы в группе больных с наследственной отягощенностью, приводит к ускоренной деградации у них моноаминов и таким образом создает биохимические предпосылки для роста ПВА и массивного потребления алкоголя, прогредиентного течения заболевания. Увеличенная скорость инактивации катехоламинов в лимбических структурах мозга определяет возникновение дефицита катехоламинов, что способствует высокой мотивации к злоупотреблению алкоголем, который временно повышает активность катехоламиновой нейромедиации в мозге. Высокое содержание 3,4диметоксипроизводных катехоламинов, продуктов, катализируемой катехолорто-метилтрансферазой реакции, близких по биологической активности соединениям с психо- и нейротропным действием у больных с наследственным отягощением, для которых характерно тяжелое течение ААС и особенно его психопатологические проявления, также, по-видимому, имеет связь с этими проявлениями заболевания. При сравнении распределения аллельных вариантов гена катехол-ортометилтрансферазы по Val158/108Met полиморфизму было выявлено увеличение доли носителей низкоактивного метионинового аллеля т.е. больных с генотипами GA и AA, в группе больных с осложненным течением алкоголизма (точный двусторонний критерий Фишера р=0,14). В данную группу были включены больные алкоголизмом, перенесшие алкогольный делирий, алкогольный галлюциноз, судорожные припадки (алкогольная эпилепсия) в состоянии синдрома отмены. Наблюдаемое увеличение низкоактивных метиониновых вариантов гена катехол-ортометилтрансферазы в группе больных с психотическими осложнениями непосредственно связано с механизмом развития данного состояния. Известно, что внезапное прерывание систематического употребления этанола довольно быстро вызывает повышение концентрации дофамина в мезолимбических структурах мозга. Усиленное образование дофамина происходит на фоне значительного снижения активности ферментов его метаболизма - дофамин-бета-гидроксилазы, и особенно моноаминоксидазы, 21 что приводит к росту уровня дофамина в мозге и крови. Фермент катехолорто-метилтрансфераза осуществляет деградацию данного нейромедиатора, и соответственно при снижении его активности, вызванной заменой валина на метионин в 108/158 положении белка, происходит снижение скорости инактивации дофамина. Рост концентрации дофамина приводит к усилению его взаимодействия с постсинаптическими дофаминовыми рецепторами и запуску внутриклеточной цепи реакций в нейронах. Вследствие этого возникает чрезмерная активация мезолимбических дофаминергических структур, что способствует перерастанию абстинентного синдрома в алкогольный делирий. По-видимому, генетически детерминированная сниженная активность катехол-орто-метилтрансферазы при замене аминокислоты валина на метионин в 158/108 положении снижает способность организма к инактивации дофамина и способствует развитию психотических состояний при алкоголизме, а возможно их затяжному течению. Выводы: 1. Полиморфизм 1021 С/Т гена дофамин-бета-гидроксилазы оказывает выраженное влияние на активность фермента дофамин-бета-гидроксилазы у больных алкоголизмом. Замена цитозина на тимин С/Т в положении -1021 гена дофамин-бета-гидроксилазы приводит к статистически значимому снижению активности фермента. 2. Уровень активности дофамин-бета-гидроксилазы в плазме крови у больных с высокопрогредиентным течением алкоголизма ниже, чем у здоровых людей и больных с низкопрогредиентным течением. В группе больных с высокопрогредиентным течением заболевания наблюдается статистическая тенденция к увеличению количества низкоактивных Таллелей по 1021 С/Т полиморфизму гена дофамин-бета-гидроксилазы по сравнению с контрольной группой здоровых людей. 3. Уровень активности фермента дофамин-бета-гидроксилазы в плазме крови у больных с наследственно отягощенным алкоголизмом статистически достоверно ниже, чем у больных без наследственного отягощения. У 22 больных с наследственной отягощенностью по алкоголизму имеет место повышенная частота высокопрогредиентного варианта течения заболевания по сравнению с больными без наследственной отягощенности, чаще наблюдается абстинентный синдром в тяжелой форме и его психопатологические проявления. 4. В группе больных с наследственной отягощенностью алкоголизмом наблюдалось статистически достоверное увеличение гетерозиготных С/Т и гомозиготных Т/Т вариантов генотипов по 1021 С/Т полиморфизму гена дофамин-бета-гидроксилазы, определяющих сниженную активность фермента, по сравнению с группой здоровых и по сравнению с больными без наследственного отягощения. С увеличением степени семейной отягощенности алкоголизмом (отягощенность по обеим линиям родства) наблюдается тенденция к увеличению доли носителей низкоактивных Твариантов гена дофамин-бета-гидроксилазы по 1021 С/Т полиморфизму по сравнению с контрольной группой и группой больных без наследственного отягощения. 5. В группе больных с наследственной отягощенностью по алкоголизму наблюдается статистически достоверное увеличение количества высокоактивных валиновых G аллелей и высокоактивных гомозиготных валиновых G/G вариантов генотипов по Val158/108Met полиморфизму гена катехол-орто-метилтрансферазы по сравнению с контрольной группой здоровых лиц. Увеличенная вследствие этого скорость инактивации катехоламинов в лимбических структурах мозга определяет возникновение их дефицита, что способствует высокой мотивации к злоупотреблению алкоголем, который временно повышает активность катехоламиновой нейромедиации в мозге. 6. Для группы больных с осложненным течением заболевания при синдроме отнятия (алкогольный делирий, алкогольный галлюциноз, судорожный синдром) характерно статистически достоверное увеличение Ааллелей и гомозиготных А/А низкоактивных вариантов генотипов по 444 G/A полиморфизму гена дофамин-бета-гидроксилазы по сравнению с 23 контрольной группой и группой больных с неосложненным течением заболевания, что позволяет говорить о А/А гомозиготном варианте генотипа, как о предрасполагающем к развитию этих осложнений. 7. Таким образом, проведенные исследования показали, что полиморфизм генов дофамин-бета-гидроксилазы и катехол-ортометилтрансферазы являются составной частью генетического комплекса, определяющего предрасположенность к злоупотреблению алкоголем, формированию алкоголизма и особенности течения этого заболевания. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Анохина И.П., Николаева В.В., Чоговадзе А.Г., Генерозов Э.В., Веретинская А.Г., Агибалова Т.В., Умарова Е.Р., Шамакина И.Ю. Структурные особенности гена дофамин-бета-гидроксилазы у больных алкоголизмом // Вопросы наркологии. 2008. №2. С.31-40 2. Николаева В.В., Шамакина И.Ю., Веретинская А.Г., Анохина И.П. Активность дофамин-бета-гидроксилазы и структурные особенности гена этого фермента у больных алкоголизмом. /Тезисы в сборнике Общероссийской конференции «Реализация подпрограммы «Психические расстройства» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально-значимыми заболеваниями (2007-2011 гг.)» 28-30 октября 2008 . Москва. С.28. 3. Николаева В.В., Веретинская А.Г. Особенности функционирования катехоламиновой системы у здоровых подростков с наследственным отягощением алкоголизмом. /Тезисы в сборнике Общероссийской конференции «Реализация подпрограммы «Психические расстройства» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социальнозначимыми заболеваниями (2007-2011 гг.)».28-30 октября 2008 г. Москва. С.36. 4. Веретинская А.Г., Кузнецова М.Н, Николаева В.В. Показатели обмена катехоламинов в плазме крови подростков с отягощенной алкоголизмом наследственностью. // Вопросы наркологии. 2008. № 4. С. 29-35. 24 5. Николаева В.В., Чоговадзе А.Г., Веретинская А.Г., Шамакина И.Ю., Анохина И.П. Роль полиморфизма гена дофамин-бета-гидроксилазы и активности этого фермента в формировании и течении алкоголизма./ Материалы 1 Российского национального конгресса по наркологии. Москва. 24-27 ноября 2009 г.С.15-16. 6. Николаева В.В., Чоговадзе А.Г., Веретинская А.Г., Шамакина И.Ю., Генерозов Э.В., Анохина И.П. / Активность дофамин-бета-гидроксилазы и полиморфизм 1021 С/Т гена ДБГ у больных алкоголизмом. // Вопросы наркологии. 2009. № 4. С.57-65. 25
