Компенсаторно-приспособительные реакции нейронов и

ISBN 5-7262-0634-7. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2006. Часть 1
В.П. РЕУТОВ, Н.В. САМОСУДОВА, Н.П. ЛАРИОНОВА,
Л.М. ЧАЙЛАХЯН
Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва
Институт проблем передачи информации РАН, Москва
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
valreutov@mtu-net.ru
КОМПЕНСАТОРНО-ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ
НЕЙРОНОВ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК МОЗЖЕЧКА
ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
NO-ГЕНЕРИРУЮЩЕГО СОЕДИНЕНИЯ И ГЛУТАМАТА
В работе исследовали влияние токсических доз NO-генерирующего
соединения (NaNO2) и глутамата на появление спиралевидных структур,
образованных отростками глиальных клеток нейронной сети мозжечка
лягушки Rana Temporaria. Показано, что отростки клеток астроцитарной
глии мозжечка, как правило, закручиваются вокруг синапсов или их элементов. Полученные данные позволяют предположить, что образование
спиральных структур вокруг синапсов или их элементов является компенсаторно-приспособительной реакцией на повреждающее воздействие
нейронной сети мозжечка NO-генерирующим соединением или глутаматом, способным активировать синтез NO.
Ранее нами было показано, что при стимуляции параллельных волокон
(ПВ) МЖ в присутствии избытка раствора (1мМ) возбуждающего медиатора глутамата (ГЛУ), наблюдается появление спиралевидных структур,
образованных отростками глиальных клеток (астроцитарной глией), которые закручивались вокруг синапсов или их элементов. В некоторых экспериментах было отмечено появление спиралевидных структур и в опытах по инкубации МЖ лягушки в 1 мМ растворе ГЛУ и без стимуляции
ПВ. Такое поведение глиальных клеток нами было расценено, как защитная реакция на сильное повреждение нейронной сети МЖ токсическими
дозами ГЛУ [1]. Однако механизмы наблюдаемых явлений и вещества,
выполняющую сигнальную функцию, в случае подобных ультраструктурных изменений были не ясны. В связи с тем, что ГЛУ способен вызывать
повышение внутриклеточной концентрации Са2+, и тем самым, активировать синтез NO при участии нейрональных NO-синтаз, целесообразно было проверить возможную роль оксида азота в появлении спиралевидных
структур, образованных отростками глиальных клеток. В настоящей рабоУДК 004.032.26(06) Нейронные сети
142
ISBN 5-7262-0634-7. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2006. Часть 1
те, которая является продолжением предыдущих наших работ [1-8], проводили сопоставление воздействия токсических доз ГЛУ и NOгенерирующего соединения (NaNO2), в том числе и на появление спиралевидных структур, образованных отростками глиальных клеток [1].
Условия эксперимента, как в случае воздействия токсическими дозами
ГЛУ, так и NO-генерирующего соединения, моделировали повреждение
нейронной сети при инсульте. В связи с этим исследования условий и роли NO в образовании спиралевидных структур в нейронной сети мозжечка могут представлять интерес не только для биологов – морфологов, цитохимиков и физиологов, но и для патофизиологов, изучающих механизмы развития компенсаторно-приспособительных реакций при токсическом воздействии глутамата и имеющих место при инсультах.
Методика
В работе использовали мозжечки взрослых лягушек Rana Temporaria.
Было выполнено семь экспериментальных вариантов: 1-й вариант – фиксация головного мозга сразу же после извлечения из черепной коробки,
затем изоляция мозжечка (норма); 2-й вариант – инкубация в чистом растворе Рингера (2 ч) – контроль инкубации; 3-й вариант – инкубация в растворе Рингера с L-глутаматом (1 мМ, 2 ч); 4-й вариант – инкубация в растворе Рингера с NaNO2 (1 мМ, 2 ч); 5-й вариант – стимуляция (1ч; 0,1 Гц)
параллельных волокон (ПВ) в чистом растворе Рингера, затем инкубация
(1 ч) в том же растворе; 6-й вариант – стимуляция ПВ (0,1 Гц, 1 ч) в растворе Рингера с 1 мМ L-глутамата, затем инкубация в той же среде (1 ч);
7-й вариант – стимуляция ПВ (0,1 Гц, 1ч) в растворе Рингера с NaNO2
(1 мМ, 1 ч), затем инкубация в той же среде (1 ч). Состав оксигенированного раствора Рингера: Na+ – 115 мМ, К+ – 2,5 мМ, Са2+ – 1,2 мМ,
NaHCO3 – 6,0 мМ, 2 г глюкозы на 1 л раствора, рН 7,2 – 7,4. Концентрации L-глутамата и NaNO2 составляли 1 мМ. Нитрит натрия использовали
как вещество, способное генерировать NO в результате восстановления
ионов NO2- в NO [9-12]. Фиксацию осуществляли 2,5 % раствором глутарового альдегида, приготовленном на 0,1 М Na-какодилатном буфере
(рН 7,2), содержащем 0,5 % таниновой кислоты и 3 % сахарозы. Далее
материал дофиксировали в 1 % OsO4 (рН 7,2 в том же буфере) в течение
1 ч при 4 С. Обезвоживание материала производили в этиловом спирте
возрастающей концентрации, абсолютном спирте и ацетоне, с последующим заключением в смесь эпон-арильдита. Срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Просмотр срезов осуществляли с помощью
УДК 004.032.26(06) Нейронные сети
143
ISBN 5-7262-0634-7. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2006. Часть 1
электронного микроскопа Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении
90 кВ. Статистический анализ проводили с использованием критерия
Стьюдента при обработке 10 окон размером 50 мкм 2 в каждом экспериментальном варианте.
Результаты экспериментов и их обсуждение
В настоящей работе проводили сопоставление данных по воздействию
токсических доз ГЛУ и NO-генерирующего соединения. Показано, что в
образовании спиральной структуры – «обкрутки» могут принимать участие несколько отростков одной глиальной клетки (ГК). Отростки ГК, как
правило, постоянно окружают синаптические контакты, как в норме, так и
при повреждении глутаматом или оксидом азота. Однако в норме отросток ГК наполнен цитоплазмой и имеет ширину от 33 до 40 нм. Кроме
того, в норме отросток ГК, как правило, делает не более одного витка вокруг синапса. По мере усложнения эксперимента от инкубации до стимуляции параллельных волокон-аксонов ЗК происходят значительные изменения самой структуры глиальных отростков, а именно, исчезает цитоплазма, стенки отростка сближаются и соединяются внутренними перегородками. Подобные контакты носят название аутотипических. Измененные отростки-ряды входят в состав спиралевидной структуры – «обкрутки».
Статистическая обработка материала, включающая измерение ширины
ряда и расстояния между внутренними перегородками показывает, что эти
величины изменяются в зависимости от экспериментального варианта –
от инкубации или стимуляции МЖ в чистом растворе Рингера (1), в присутствии глутамата (2) или оксида азота (3). Анализ статистической обработки материала позволил выявить, что стимуляция отличается от инкубации увеличением числа рядов и уменьшением расстояния между перегородками. Однако существуют отличия в зависимости от действующих
повреждающих факторов – глутамата или оксида азота. Самая большая
степень повреждения наблюдалась при стимуляции МЖ в присутствии
NO-генерирующего соединения. При этом число рядов в «обкрутках»
увеличивалось до 4-5, а расстояние между перегородками и ширина ряда
уменьшалась до 18-20 нм. При стимуляции МЖ в ГЛУ (1 мМ) или при
стимуляции его в «чистом» растворе Рингера в состав «обкрутки» входят
всего лишь два ряда. При этом ширина ряда и расстояние между перегородками, как правило, были выше, чем в случае инкубации в присутствии
NO-генерирующего соединения.
УДК 004.032.26(06) Нейронные сети
144
ISBN 5-7262-0634-7. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2006. Часть 1
Глиальные клетки, как правило, всегда находятся рядом с нервными
клетками. Получено достаточно много данных, свидетельствующих о том,
что активация глиальных клеток, сопровождается их морфологическими
изменениями, которые активно проходят на фоне повышенного синтеза
NO [13]. Относительно недавно было показано, что стимуляция параллельных волокон в срезах мозжечка мыши, приводящая к увеличению
внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в глиальных клетках Бергмана, активировала также и синтез NO [14]. Эти авторы считают, что методами path-clamping и imagin techniques ими было установлено, что нейронглиальные взаимодействия опосредуются NO, поскольку клеточные ответы блокировались ингибиторами NO-синтазы и возобновлялись после
использования NO-доноров. Предполагается, что эти изменения связаны с
нитрованием тирозиновых остатков белков, входящих в состав этих клеток. В пользу этих представлений могут также свидетельствовать и наши
более ранние исследования [3], в которых было показано, что NO может
выступать в качестве модулятора контрастности основных элементов цитоскелета и влиять на морфологию нервных клеток мозжечка. Таким образом, имеющиеся данные литературы не противоречат развиваемым
нами представлениям о том, что NO может участвовать в реализации
нейрон-глиальных взаимодействий, которые осуществляются на фоне
ультраструктурных изменений глиальных клеток и нейронов.
В связи с этим можно предположить, что образование таких структур,
как «обкрутки», в условиях повреждения нейронной сети МЖ ГЛУ или
NO-генерирующими веществами является закономерным результатом и
его можно рассматривать как компенсаторно-приспособительную реакцию в ответ на воздействие токсических доз указанных выше веществ.
Такая структура, состоящая из нескольких скрепленных между собой рядов спиралевидных «обкруток» является, по-видимому, достаточно прочным образованием, способным защитить синапс и обеспечить проведение
сигнала через синаптическую щель. Можно предположить, что изменение
ультраструктуры отростков глиальных клеток, а именно, появление внутренних перегородок свидетельствует о возможном участии в этом процессе адгезивных белков. Эти белки представляют особый интерес еще и в
связи с тем, что ранее в ряде работ [3, 5, 11] нами было отмечено явление
перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние при воздействии токсических доз ГЛУ и NO-генерирующего соединения. Такие явления, связанные с адсорбцией цитоплазматических белков на мембранных структурах, вряд ли могут протекать без участия адгезивных белков. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что
УДК 004.032.26(06) Нейронные сети
145
ISBN 5-7262-0634-7. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2006. Часть 1
клеточные адгезивные белки могут играть как структурную, так и сигнальную роль в синаптической пластичности и механизмах обучения и
памяти [15]. Так, например, показано, что важную роль в синаптогенезе и
реализации синаптической специфичности играют кадгерины [16]. Эти
белки относятся к семейству трансмембранных гликопротеинов. Экспрессия разных кадгеринов (например, N-, E-типа и др.) соответствует разным
этапам жизнедеятельности, функционирования синапсов и в развитии
компенсаторно-приспособительных реакций [17]. Поэтому можно ожидать, что и эти белки могут принимать участие в развитии компенсаторноприспособительных реакций в ответ на токсическое воздействие ГЛУ и
NO-генерирующих соединений. Вместе с тем возникает вопрос: какова
роль самих спиралевидных «обкруток» и, каким образом эти структуры
могут участвовать в защите нейронов от повреждающего действия NO и
других свободных радикалов?
Ранее было показано, что мишенями токсического действия окислов
азота могут быть как белки (тирозиновые остатки), так и ненасыщенные
жирные кислоты (НЖК) [18]. Результаты этих исследований были развиты и подтверждены в другой работе [19]. В этих исследованиях было показано, что при токсическом действии ГЛУ и NO-генерирующих соединений (NaNO2, нитропруссида натрия) мишенями токсического действия
могут быть НЖК, поскольку альбумин, способный связывать жирные
кислоты, усиливал повреждающее воздействие этих веществ на зернистые
клетки мозжечка. Эти данные хорошо согласуются с нашим предположением о том, что NO-генерирующие соединения играют важную роль в
механизме повреждения мембран нейронов. Потенцирующее (усиливающее) действие альбумина на гибель нейронов в присутствии нитритов
может быть обусловлено повреждающим воздействием NO и, возможно,
продуктов превращения этого высокореакционного соединения, например, двуокиси азота NO2 и пероксинитрита (ОNOO-). Какие структуры,
входящие в состав мембран клеток и субклеточных структур, могут повреждаться в первую очередь?
Можно было предполагать, что потенцирующее действие альбумина
на гибель клеток связано, прежде всего, с действием NO и NO 2 на ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав липидов мембран [20, 21].
В работе [19] было показано, что потенцирующее действие альбумина на
гибель нейронов может быть связано с прооксидантным действием свободно-радикальных соединений, поскольку воздействие прооксиданта
FeCI2 (10 мкМ) в присутствии альбумина в 2,5 раза увеличивало гибель
нейронов. Кроме того, по-видимому, следует учитывать и то, что окислы
УДК 004.032.26(06) Нейронные сети
146
ISBN 5-7262-0634-7. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2006. Часть 1
азота способны влиять на цитоскелет нервных клеток [3]. Не исключено,
что с изменением цитоскелета клеток связано и механическое (осмотическое) растяжение мембран клеток [20]. Ю.А. Владимиров в своей концепции об универсальных молекулярных механизмах повреждения биологических мембран, сформулированной более 30 лет назад, предположил
участие 5 основных механизмов. Эти механизмы сводятся к следующим:
1) усиление перекисного окисления липидов; 2) активация мембранных
фосфолипаз; 3) механическое (осмотическое) растяжение мембран; 4) адсорбция белков на мембране и, наконец, 5) повреждение в результате
пробоя мембраны собственным электрическим полем. В свете концепции
[20] и результатов наших исследований можно ожидать, что образование
спиралевидных «обкруток», препятствует механическому (осмотическому) растяжению мембран. Кроме того, образование спиралевидных «обкруток» вокруг синапсов может препятствовать повреждению клеточных
мембран оксидом азота и другими свободно-радикальными соединениями, образующими при метаболизме NO, за счет того, что ненасыщенные
жирные кислоты (НЖК), входящие в состав мембран спиралевидных «обкруток», способны конкурировать с теми НЖК, которые выполняют важную роль в составе мембран нейронов. В таких условиях свободнорадикальному повреждению будут подвергаться, прежде всего, спиралевидные отростки глиальных клеток и НЖК, входящие в состав мембран
этих отростков, а не функционально активные нейроны вместе с их синапсами. Таким образом, мы полагаем, что наличие подобного компенсаторно-приспособительного механизма образования спиралевидных «обкруток» вокруг синапсов нейронов, способно, во-первых, создавать условия для удержания нейронов от осмотического растяжения, и, во-вторых,
принимать на свои НЖК атаку свободно-радикальными соединениями.
Список литературы
1. Самосудова Н.В., Ларионова Н.П., Чайлахян Л.М. 1996. Аутотпические септальноподобные контакты глиальных клеток в мозжечке лягушки in vitro и их возможная роль в
норме и патологии. Докл. РАН. 351 (6): 821-826.
2. Самосудова Н.В., Ларионова Н.П., Реутов В.П., Чайлахян Л.М. 1998. Изменение молекулярного слоя мозжечка лягушки Rana temporaria под влиянием NO-генерирующего
соединения. Докл. РАН. 361 (5): 704-708.
3. Самосудова Н.В., Реутов В.П., Ларионова Н.П. 2000. Оксид азота как модулятор
контрастности основных элементов цитоскелета. Цитология. 42 (1): 72-78.
4. Самосудова Н.В., Реутов В.П., Ларионова Н.П., Чайлахян Л.М. 2001. Возможное
учаcтие оксида азота в межнейронном взаимодействии. Докл. РАН. 378 (3): 417-420.
5. Самосудова Н.В., Реутов В.П., Ларионова Н.П., Чайлахян Л.М. 2003. Локализация
кальция в микротрубочках, выявляемая электрической стимуляцией мозжечка в присутствии
NO-генерирующего соединения. Биол. мембраны. 20 (1): 27-33.
УДК 004.032.26(06) Нейронные сети
147
ISBN 5-7262-0634-7. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2006. Часть 1
6. Ларионова Н.П., Реутов В.П., Самосудова Н.В., Чайлахян Л.М. 2003. Сравнительный
анализ пластичности нейро-нейронных и нейро-глиальных инкапсулирующих взаимодействий молекулярного слоя изолированного мозжечка лягушки в условиях избытка Lглутамата и NO-генерирующего соединения. Докл. РАН. 393 (5): 698-702.
7. Ларионова Н.П., Самосудова Н.В., Реутов В.П., Чайлахян Л.М. 1999. Сравнительное
исследование изменения количественных характеристик структуры молекулярного слоя
мозжечка лягушки Rana Temporaria под влиянием L-глутамата и NO-генерирующего соединения. Докл. РАН. 309 (6): 836-840.
8. Ларионова Н.П., Самосудова Н.В., Реутов В.П., Чайлахян Л.М. 2001. Сравнительное
исследование изменений структуры нейрон-нейронного взаимодействия в молекулярном
слое мозжечка лягушки Rana Temporaria под влиянием L-глутамата и NO-генерирующего
соединения. Докл. РАН. 376 (5): 701-706.
9. Реутов В.П., Ажипа Я.И., Каюшин Л.П. 1983. Кислород как ингибитор нитритредуктазной активности гемоглобина. Изв. АН СССР. сер. биол. (3): 408-418.
10. Реутов В.П., Косицын Н.С., Свинов М.М. и др. 1998. Активация цикла окиси азота
при гипоксии индуцирует перераспределение белков в клетках тканей млекопитающих из
растворимого в мембранно-связанное состояние. Мол. биол. 32 (2): 378-379.
11. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. 1998. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М.: Наука. 156 с.
12. Ажипа Я.И., Реутов В.П., Каюшин Л.П. 1990. Экологические и медикобиологические аспекты проблемы загрязнения окружающей среды нитратами и нитритами.
Физиология человека. 20 (3): 165-174.
13. Perez-Capote K., Serratosa J., Sola C. 2004. Glial activation modulates glutamate neurotoxicity in cerebellar granula cell cultures. Glia. 45: 258-268.
14. Matyash V., Filippov V., Mohrhagen K., Kettenmann H. 2001. Nitric oxide signals parallel fiber activity to Bergmann glial cells in the mouse cerebellar slice. Mol. Cell Neurosci. 18
(6):664-670.
15. Murase S., Schuman E.M. 1999. The role of cell adhesion molecules in synaptic plasticity
and memory. Current Opinion in Cell Biology. 11: 549-553.
16. Fanon A.M., Sherman E.L., Ilyina-Gzagerova G., Brophy P.I., Freidrich V.L., Colman D.R. 1995. Novel E-cadherin mediated adhesion in peripheral nerve: Schwann cell. J. Cell
Biol. 129 (1): 189-202.
17. Obst-Pernerg K., Redies Ch. 1999. Cadherins and synaptic specificity. J. Neurosci. Res.
58:130-138.
18. Реутов В.П., Ажипа Я.И., Каюшин Л.П. Изучение методом электронного парамагнитного резонанса продуктов взаимодействия окислов азота с некоторыми органическими
соединениями // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1978. №9. С.299-301.
19. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Вергун О.В., Ходоров Б.И.
Механизм потенцирующего действия альбумина при токсическом воздействии глутамата:
возможная роль окиси азота // Биологические мембраны. 1999. Т.16.№3. С.318-323.
20. Владимиров Ю.А. 1973. Универсальные молекулярные механизмы повреждения
биологических мембран. В кн: Проблемы молекулярной и клеточной патологии и фармакологии. М.: 2-ой МОЛГМИ: 10-12.
21. Владимиров Ю.А. 2004. Активные формы кислорода и азота: значение для диагностики, профилактики и терапии. Биохимия. 69 (1): 5-7.
УДК 004.032.26(06) Нейронные сети
148