Праймеры P1 и Р2 синтезированы в фирмах ЗАО «Синтол

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ
И ФИТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ
Федеральное государственное бюджетное учреждение
«ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР КАРАНТИНА РАСТЕНИЙ»
(ФГБУ «ВНИИКР»)
УТВЕРЖДАЮ
Директор ФГБУ «Всероссийский
центр карантина растений»
(ФГБУ «ВНИИКР»)
_______________ У.Ш. Магомедов
«____» _________________ 2011 г.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА FLASH-ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА ШАРКИ СЛИВ
Plum pox virus
(отчет)
Москва – 2011 г.
Отчет по теме «Валидация метода FLASH-ПЦР для выявления и
идентификации вируса шарки слив Plum pox virus» подготовлен начальником
отдела диагностики ФГБУ «ВНИИКР» кандидатом сельскохозяйственных
наук Ю.Н. Приходько, младшим научным сотрудником лаборатории
вирусологии Т.С. Живаевой, младшим научным сотрудником лаборатории
вирусологии Ю.А. Шнейдером.
Материалы рассмотрены и одобрены научно-методическим советом
ФГБУ «ВНИИКР» (протокол № ____ от «______» _________ 2011 г.).
Редактор – Т.В. Артемьева.
2
Оглавление
Введение…………………………………………………………….………....4
1. Принцип метода FLASH-ПЦР…………………………………………….5
2. Материалы и методы…………………………………………....................9
3. Результаты исследований………………………………………………...16
3.1.
Аналитическая чувствительность……………………………….16
3.2.
Аналитическая специфичность……………………………….....21
3.3.
Селективность…………………………………………………....30
3.4.
Повторяемость…………………………………………………....32
3.5.
Воспроизводимость……………………………………………...32
Выводы………………………………………………………………………..35
Список использованной литературы………………………………………..37
3
Введение
В настоящее время методы, основанные на принципе полимеразной
цепной реакции (ПЦР), заняли одно из ведущих мест в лабораторной
диагностике фитопатогенов. Чаще всего используется классическая ПЦР с
детекцией результатов (продуктов амплификации) посредством электрофореза
в агарозном геле. Как известно, основными проблемами электрофореза
являются высокая вероятность контаминации ампликонами, использование
канцерогенного бромистого этидия, сравнительно высокая трудоемкость и
продолжительность проведения анализа. Для устранения этих проблем все
больше лабораторий предпочитают использовать ПЦР в реальном времени.
Однако оснащение лабораторий приборами для проведения ПЦР в реальном
времени связано со значительными материальными затратами. В связи с этим
в последние годы в российской медицинской и фитопатологической
диагностике начал применяться метод FLASH-ПЦР, основывающийся на том
же принципе, что и Real-time-ПЦР, но позволяющий использовать менее
дорогостоящее оборудование.
В
соответствии
с
требованиями
Стандарта
ЕОКЗР
РМ
7/98
«Специфические требования к лабораториям, ведущим подготовку к
аккредитации деятельности в сфере диагностики вредных организмов»,
лаборатории должны использовать только те тесты, которые прошли
валидацию (т.е. признаны надежными и достоверными). Тест считается
полностью прошедшим валидацию, когда предоставляются данные о
следующих
рабочих
критериях:
аналитическая
чувствительность,
аналитическая специфичность, воспроизводимость и повторяемость. В
зависимости от области применения также может возникнуть необходимость в
определении его селективности.
Признание надежности и достоверности (валидация) проводится для
предоставления объективных данных о том, что данный тест соответствует
4
условиям использования. В сфере диагностики вредных организмов растений
тест должен быть подходящим для рутинной диагностики.
В данном отчете приводятся результаты исследований по валидации
метода FLASH-ПЦР для выявления и идентификации вируса шарки слив
(PPV) c использованием соответствующих диагностических наборов фирмы
ООО «Агродиагностика» и оборудования фирмы ЗАО «НПФ ДНКТехнология»). Исследования проведены в лаборатории вирусологии отдела
диагностики ФГБУ «ВНИИКР».
1. Принцип метода FLASH-ПЦР
Метод
FLASH-PCR
(Fluorescent
Amplification-based
Specific
Hybridization) – это флуоресцентный ПЦР по конечной точке (end-point
fluorescent PCR).
В основе метода «FLASH» лежат три явления: эффект гашения
флуоресценции,
5'-экзонуклеазная
активность
Taq-полимеразы
и
взаимодействие комплементарных фрагментов ДНК. Ключевым элементом
технологии
FLASH-PCR
гибридизационных
является
олигонуклеотидных
использование
зондов,
меченных
разрушаемых
молекулами
флуорофора и гасителя флуоресценции.
Реакционная смесь для проведения реакции аналогична таковой для
постановки ПЦР в реальном времени, но реакция проводится в обычном
термоциклере. По окончании реакции закрытые пробирки устанавливают в
специальный прибор – детектор флуоресценции, где происходит считывание
уровня флуоресценции.
Первой
компанией,
начавшей
коммерческое
производство
диагностических наборов для детекции фитопатогенов методом ПЦР в
формате FLASH, стала фирма «Агродиагностика» (Москва). Диагностические
наборы адаптированы к оборудованию фирмы «ДНК-Технология» (Россия).
5
В состав диагностического набора входят микропробирки, каждая из
которых содержит реакционную смесь (ПЦР-mix) для проведения одной
реакции.
Реакционная
смесь
включает:
ПЦР-буфер,
MgCl2,
dNTP,
специфичные праймеры, специфичный зонд, меченный красителями FAM и
Dabcyl. В состав ПЦР-mix входит также универсальный внутренний контроль,
позволяющий контролировать корректность постановки реакции и отсутствие
ингибиторов. Внутренний контроль состоит из плазмидного вектора и зонда.
Вектор содержит вставку, отличающуюся от специфического фрагмента, но
имеющую на концах участки, комплементарные специфическим праймерам.
Зонд комплементарен вставке вектора и мечен флуорофором НЕХ и гасителем
Dabcyl.
Таким образом, внутренний контроль и специфический фрагмент
амплифицируются одинаковыми праймерами, но детектируются разными
зондами. В пробирке одновременно проходят две реакции – амплификация
специфического фрагмента генома патогенного организма и ДНК внутреннего
контроля. Количество матрицы для внутреннего контроля подобрано так,
чтобы не ингибировать амплификацию специфического фрагмента. Поэтому
при высокой концентрации специфической матрицы синтез внутреннего
контроля может отсутствовать. Стандартные величины специфического
продукта амплификации (268 пар нуклеотидов для праймеров s1/as2,
специфичных к PPV) и внутреннего контроля (560 пар нуклеотидов)
позволяют
в
качестве
альтернативного
способа
детекции
продуктов
амплификации использовать агарозный гель-электрофорез.
При постановке ПЦР в пробирку с готовым ПЦР-миксом добавляют
входящий в состав набора раствор термостабильной полимеразы (или буфер
без полимеразы для фоновых пробирок) и очищенную ДНК образца.
Для повышения эффективности ПЦР используется «горячий старт»,
уменьшающий риск образования неспецифических продуктов амплификации.
6
Он обеспечивается разделением компонентов ПЦР-смеси слоем парафина,
который предотвращает их смешивание до начала реакции.
На этапе детекции используется ПЦР-детектор «Джин». Приборы
различных модификаций могут иметь 2 или 4 канала детекции, что позволяет
использовать внутренний контроль или проводить мультиплексную реакцию.
Время детекции флуоресценции заполненного блока, включающего 12
пробирок, не более 15 секунд. Программное обеспечение позволяет быстро
оценить результаты исследований, которые выдаются в табличной и
графической
формах.
Программа
основана
на
сравнении
уровня
флуоресценции образца с уровнем флуоресценции фона и выдает результат в
относительных единицах (как частное значения флуоресценции образца к
значению фона). В качестве фона используется реакционная смесь без
полимеразы, содержащая ДНК отрицательного контроля. Полученные
результаты сохраняются в компьютерной базе данных.
В биологических образцах, содержащих ДНК объекта, программа
фиксирует положительный результат. Результат амплификации внутреннего
контроля в этом случае в учет не принимается. В биологических образцах, не
содержащих ДНК объекта, в которых получен положительный результат
амплификации внутреннего контроля, программа фиксирует отрицательный
результат. В случае отрицательного результата на наличие как ДНК объекта,
так и отрицательного результата амплификации внутреннего контроля,
программа фиксирует недостоверный результат (С.К. Завриев и др., 2007).
Наряду с комплектом реагентов для постановки ПЦР, фирма ООО
«Агродиагностика» производит также наборы для выделения РНК («ПробаНК») и ДНК («Проба-ГС») из растительной ткани и комплект реагентов для
проведения обратной транскрипции.
В карантинных лабораториях Российской Федерации метод FLASH-PCR
проходит апробацию для выявления и идентификации следующих патогенов:
Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Erwinia
7
amylovora, Pantoea stewartii subsp. stewartii, Beet necrotic yellow vein benyvirus,
Plum pox potyvirus, Potato spindle tuber pospiviroid, Globodera pallida,
Globodera
rostochiensis,
Bursaphelenchus
mucronatus,
Bursaphelenchus
xylophilus.
Об
испытании
данного
метода
для
диагностики
карантинных
организмов имеются отдельные сведения в литературе.
В частности, с использованием данного метода было установлено
широкое распространение в Приморском крае РФ нематоды B. mucronatus и
отсутствие карантинного вида B. xylophilus (О.А. Кулинич и др., 2008). Было
показано отсутствие реакции праймеров к B. mucronatus с ДНК B. xylophilus, а
также других видов Bursaphelenchus и Aphelenchoides. Тесты в равной степени
можно проводить как на личинках, так и на половозрелых самцах и самках
B. mucronatus и B. xylophilus. Для ПЦР-теста было достаточно выделить ДНК
всего одной особи этих видов (О.А. Кулинич и др., 2008, а, б).
В 2006 году в рамках европейского проекта по структурной программе
«Диагностика»
компания
HLB
(Нидерланды)
провела
сравнительное
исследование эффективности методов FLASH-PCR и Real-time-PCR для
идентификации
Globodera
pallida,
Globodera
rostochiensis,
Ralstonia
solanacearum и Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. При испытании
метода FLASH-PCR использовали диагностические наборы и специфические
праймеры фирмы «Агродиагностика» и ПЦР-детектор «Джин» фирмы «ДНКТехнология». Установлено, что диагностический набор для FLASH-PCR к
G. rostochiensis позволял выявлять все 5 используемых в тесте патотипов этой
нематоды без перекрестной реакции с G. pallida. Аналогичным образом набор
к G. pallida позволял выявлять специфические фрагменты ДНК восьми
патотипов этой нематоды без перекрестной реакции с G. rostochiensis. Набор
для FLASH-PCR к R. solanacearum обеспечивал эффективное выявление
специфической ДНК вплоть до разведения в 10-5 и не реагировал с
C. michiganensis subsp. sepedonicus. Набор к C. michiganensis subsp. sepedonicus
8
позволил
диагностировать
все
испытуемые
положительные
образцы.
Констатировано, что метод FLASH-PCR обеспечивает получение точных и
достоверных
результатов
и
может
быть
использован
в
практике
диагностических служб (R.A. Bosch, J. Reintke, 2007).
Литературные данные об
испытаниях
метода
FLAHS-ПЦР
для
выявления и идентификации вируса шарки слив отсутствуют.
2. Материалы и методы
Валидацию метода FLASH-ПЦР для выявления и идентификации вируса
шарки слив (PPV) проводили со следующими наборами фирмы ООО
«Агродиагностика»:
1.
Комплект реагентов для выделения РНК из растительной ткани
«Проба-НК».
2.
Комплект реагентов для проведения обратной транскрипции.
3.
Тест-набор для FLASH-ПЦР к вирусу шарки слив (серия А) F.
В состав комплекта реагентов для выделения РНК из растительной
ткани «Проба-НК» входят следующие компоненты: лизирующий раствор,
реагент для преципитации, промывочный раствор № 1, промывочный раствор
№ 2, буфер для растворения.
Использование данного набора осуществляется по следующей прописи
фирмы-изготовителя:
1.
Промаркировать необходимое количество пластиковых пробирок
объемом 1,5 мл с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца
– «К-».
2.
Поместить 20-30 мг растительной ткани в пластиковую пробирку
объемом 1,5 мл, добавить 100 мкл лизирующего раствора и тщательно
растереть с помощью пестика-гомогенизатора (отдельного для каждого
9
образца). В пробирку, маркированную «К-», внести 100 мкл лизирующего
раствора.
3.
Добавить в каждую пробирку 300 мкл лизирующего раствора,
закрыть крышки пробирок и встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с.
4.
Термостатировать пробирки при 65 °С в течение 20 мин.
5.
Центрифугировать пробирки при 2000 об/мин в течение 10 мин.
6.
Аккуратно, не задевая осадок, перенести 300 мкл надосадочной
жидкости в новые промаркированные пластиковые пробирки объемом 1,5 мл
(отдельным наконечником для каждой пробирки).
7.
Добавить по 300 мкл реагента для преципитации и встряхнуть
пробирки на вортексе в течение 3-5 с.
8.
Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 15 мин.
9.
Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость
отдельным наконечником для каждой пробирки.
10. Добавить к осадку по 500 мкл промывочного раствора № 1 и
встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с.
11. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 5 мин.
12. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость
отдельным наконечником для каждой пробирки.
13. Добавить к осадку по 500 мкл промывочного раствора № 2 и
встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с.
14. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 5 мин.
15. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость
отдельным наконечником для каждой пробирки.
16. Открыть крышки пробирок и высушить осадок при 65 °С в течение
5 мин.
17. Добавить к осадку по 100 мкл буфера для растворения, закрыть
крышки пробирок и термостатировать пробирки при 65 °С в течение 10 мин.
10
18. Встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с, осадить капли
кратковременным центрифугированием на вортексе.
Полученный препарат РНК используют для постановки реакции
обратной транскрипции.
В состав комплекта реагентов для проведения обратной транскрипции
входят следующие компоненты: прймер ОТ-PPV (5'-TCT TСT TGT GTT CCG
A-3') + дНТФ, обратная транскриптаза, буфер для обратной транскрипции
(ОТ-буфер).
Постановка
реакции
обратной
транскрипции
осуществляется
по
следующей прописи фирмы-изготовителя:
1. Промаркировать необходимое количество новых пластиковых
пробирок объемом 0,6 мл с учетом пробирки для отрицательного
контрольного образца «К-».
2. Приготовить ОТ-смесь, для этого смешать в отдельной пробирке 2,0 x
(N+l) мкл ОТ-буфера, l,0 x (N+l) мкл праймеров OT-PPV+дНТФ и 0,5 x (N+l)
мкл обратной транскриптазы, где N+1 – количество анализируемых образцов с
учетом «К-» (N) с запасом на 1 образец.
3. Внести по 3,5 мкл ОТ-смеси в промаркированные пробирки.
4. Внести по 16,5 мкл соответствующего образца РНК (кроме пробирки
«К-») в пробирки с ОТ-смесью; в пробирку «К-» внести отрицательный
контрольный образец, прошедший этап выделения РНК.
5. Встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с.
6. Осадить капли со стенок пробирок центрифугированием при 1000
об/мин. в течение 3-5 с.
7. Термостатировать пробирки при 40 °С в течение 40 мин, затем
инактивировать обратную транскриптазу прогреванием при 95 °С в течение 10
мин.
8.
Осадить
капли
со
стенок
пробирок
кратковременным
центрифугированием на вортексе.
11
9. Во все пробирки внести по 80 мкл буфера для растворения из
комплекта реагентов для выделения РНК.
10. Встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с.
11.
Осадить
капли
со
стенок
пробирок
кратковременным
центрифугированием на вортексе.
Полученный препарат кДНК готов к внесению в реакционную смесь для
амплификации.
В
состав
комплекта
реагентов
для
ПЦР-амплификации
входит
следующее: реакционная смесь, включающая специфические праймеры PPV
s1 и PPV as2 (запечатанная парафином), минеральное масло, раствор Taqполимеразы, положительный контрольный образец кДНК, ПЦР-буфер.
Постановка реакция ПЦР-амплификации осуществляется по следующей
прописи фирмы-изготовителя:
1. Промаркировать пробирки с запечатанной парафином смесью для
амплификации (с учетом пробирок для положительного контрольного образца
– «К+» и для отрицательного контрольного образца – «К-»). При
использовании
для
учета
результатов
амплификации
ПЦР-детектора
промаркировать дополнительно две пробирки («ФОН») для контроля фона
флуоресценции.
2. Добавить в каждую пробирку (кроме пробирок «ФОН»), не повреждая
слой парафина, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taqполимеразы. В пробирки, маркированные «ФОН», добавить по 10 мкл ПЦРбуфера.
3. Добавить в каждую пробирку по 20 мкл минерального масла, плотно
закрыть пробирки.
4. Добавить в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 5,0
мкл препарата кДНК (кроме пробирок «К-», «К+», «ФОН»). В пробирки,
маркированные «К-» и «ФОН», внести 5,0 мкл отрицательного контрольного
образца, прошедшего пробоподготовку и реакцию обратной транскрипции. В
12
пробирку,
маркированную
«К+»,
внести
5,0
мкл
положительного
контрольного образца.
5. Центрифугировать пробирки на вортексе при 1000 об/мин в течение 35 с.
6. Установить все пробирки в амплификатор и провести ПЦР в режимах,
соответствующим формату набора, с учетом объема реакционной смеси 35
мкл.
ПЦР-амплификацию
проводили
на
амплификаторе
«Терцик»
производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология», используя следующий режим:
94 ºС 90 сек.; 5 циклов (94 ºС 20 сек., 64 ºС 5 сек., 67 ºС 5 сек.); 40
циклов (94 ºС 1 сек., 64 ºС 5 сек., 67 ºС 5 сек.); хранение при 10 ºС.
Детекцию
результатов
ПЦР-амплификации
проводили
на
ПЦР-
детекторе «Джин» производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология» согласно
инструкции к прибору.
В ряде экспериментов наряду с форматом «FLASH» комплект реагентов
для ПЦР-амплификации испытывали также в формате «Форез». В этом случае
выделение РНК и постановку реакции обратной транскрипции проводили, как
описано выше, но для постановки реакции ПЦР-амплификации использовали
следующую реакционную смесь: 5х мастер-микс для ПЦР с красным
красителем фирмы ПКЗАО «Диалат Лтд» – 5 мкл, праймеры PPV s1 (5'-CCC
ACT TTT AGA CAA ATT ATG GCA-3') и PPV as2 (GTG TTC CGA CGT TTC
CAT CCA AG-3') – по 25 пМоль, кДНК – 5 мкл, вода – до 25 мкл. Режим ПЦРамплификации не изменяли.
При оценке некоторых критериев, эффективность набора к PPV фирмы
ООО «Агродиагностика» сравнивали с ПЦР-тестом, рекомендованным для
PPV диагностическим протоколом ЕОКЗР РМ 7/32 (1) (EPPO, 2004). В
последнем случае для постановки реакции ПЦР-амплификации использовали
следующую реакционную смесь: 5х мастер-микс для ПЦР с красным
красителем фирмы ПКЗАО «Диалат Лтд» – 5 мкл, праймеры P1 (5'-ACC GAG
13
ACC ACT ACA CTC CC-3´) и P2 (5'-CAG ACT ACA GCC TCG CCA GA-3´) –
по 25 пМоль, кДНК – 5 мкл, вода – до 25 мкл. Режим ПЦР-амплификации: 96
°С 15 мин, 40 циклов (95 °С 30 сек, 60 °С 30 сек, 72 °С 1 мин), 72 °С 10 мин;
хранение при 4 °С.
5х мастер-микс для ПЦР с красным красителем фирмы ПКЗАО «Диалат
Лтд» (5хMasDRTaqMIX-2025) состоит из следующих компонентов: 2,5U Smar
Taq-полимеразы, dNTPs – по 200 мкM, краситель, 10 мМ MgCl2, (NH4)2SO4.
Праймеры P1 и Р2 синтезированы в фирмах ЗАО «Синтол» и НПО
«СибЭнзим».
Детекцию результатов ПЦР-амплификации методом электрофореза
проводили в 1,5%-м агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.
Результаты RT-PCR регистрировали в гель-документирующей системе
Quantum-ST-4-1500. Размер продуктов ПЦР определяли, используя маркеры
молекулярного веса GeneRulerTM 100 и FastRulerTM (Fermentas).
Растительный материал
Для валидации набора FLASH-PCR к потивирусу шарки слив (Plum pox
potyvirus, PPV) использовали свежеотобранные и замороженные при -20 °С
листья растений сливы (Prunus domestica), вишни (Prunus cerasus), черешни
(Prunus avium), абрикоса (P. armeniaca), персика (Prunus persica) и алычи
(Prunus cerasifera), зараженные изолятами вируса из различных регионов
Российской Федерации, а также листья с контрольных здоровых растений этих
культур.
Инокулюмы
Валидацию проводили с изолятами PPV, выявленными на косточковых
культурах в РФ и полученными из DSMZ Plant Virus Collection (Германия).
14
Для валидации были использованы следующие изоляты PPV:
1.
RD-1 на сливе (Prunus domestica), смешанная инфекция штаммов
PPV-D и PPV-W, выявлен в Московской области.
2.
RD-2 на вишне войлочной (Prunus tomentosa), штамм PPV-D,
выявлен в Московской области.
3.
PV-0001, DSMZ.
4.
PV-0209, DSMZ.
5.
PV-0305, DSMZ.
6.
PV-0430, DSMZ.
Для
определения
специфичности
набора
FLASH-PCR
к
PPV
использовали изоляты и положительные контроли для ИФА следующих
вирусов:
1. Вирус скручивания листьев черешни (CLRV), изолят PV-0797,
DSMZ.
2. Вирус мозаики яблони (ApMV), положительный контроль для ИФА
фирмы Agdia.
3. Вирус кольцевой пятнистости томата (ToRSV), изолят PV-0380,
DSMZ.
4. Вирус кольцевой пятнистости табака (TBRV), изолят PV-0521,
DSMZ.
5. Вирус некротической кольцевой пятнистости косточковых (PNRSV),
изолят на Prunus avium, выявлен в Московской области.
6. Вирус хлоротической
пятнистости листьев яблони (ACLSV),
положительный контроль для ИФА фирмы Adgen.
7. Вирус карликовости сливы (PDV), положительный контроль для
ИФА фирмы ACD.
8. Вирус Y картофеля, некротический штамм (PVY-NTN), изолят PV0410, DSMZ.
9.
Вирус А картофеля (PVA), изолят PV-0760, DSMZ.
15
3.
Результаты исследований
3.1. Аналитическая чувствительность
В
соответствии
аналитической
со
Стандартом
чувствительности
ЕОКЗР
проводится
РМ
не
7/98
менее
определение
чем
в
трех
экспериментах с использованием серии из 8 разведений.
Для экспериментов в качестве инокулюма были использованы листья
изолята PPV РД-2 (штамм PPV-D, вишня войлочная), которые были отобраны
в июле 2009 г. и хранились при -80 °С.
Испытывались следующие 5-кратные разведения инокулюма: 0 (30 мг
инфицированных листьев в 400 мкл лизирующего буфера), 1:5, 1:25, 1:125,
1:625, 1:3125, 1:15625, 1:78125.
Разведения готовили с помощью лизирующего буфера.
Выделение РНК, реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации
проводили соответствующими наборами ООО «Агродиагностика».
Эксперименты были проведены 3.02.2011 г., 7.02.2011 г. и 17.08.2011 г.
(рисунки 1-3).
В
трех
проведенных
экспериментах
с
5-кратным
разведением
инокулюма было получено 100%-е совпадение результатов: чувствительность
используемой тест-системы не изменялась при увеличении разведения
инфекционного сока от 1:5 до 1:78125.
Для уточнения чувствительности испытуемой тест-системы было
проведено несколько дополнительных экспериментов.
В эксперименте № 4 была испытана серия из 8 10-кратных разведений
инокулюма лизирующим буфером: от 0 до 1000000. Испытуемая тест-система
позволяла выявлять патоген во всех разведениях (рисунок 4).
В эксперименте № 5 была испытана серия из 8 5-кратных разведений,
которые готовили не с лизирующим буфером, а с соком листьев здорового
растения вишни войлочной, хранящихся при -80 °С (рисунок 5).
16
Использование
для
приготовления
серии
разведений
вместо
лизирующего буфера сока здорового растения вишни войлочной закономерно
снизило чувствительность испытуемой тест-системы. В разведении 1:78125
вирус не был выявлен, а для разведения 1:15625 был получен недостоверный
результат (рисунок 5). Очевидно, данное снижение чувствительности связано
с повышением содержания веществ, ингибирующих реакцию амплификации.
Было проведено также сравнение чувствительности набора для FLASHPCR с чувствительностью стандартного RT-PCR с электрофоретической
детекцией результатов, в котором использовали специфичные к PPV
праймеры s1/as2 (те же праймеры, что и в наборе FLASH-PCR ООО
«Агродиагностика»).
Рис. 1. Оценка чувствительности метода FLASH-PCR
в выявлении вируса шарки слив (PPV), 5-кратные разведения
нокулюма лизирующим буфером, 3.02.2011 г. (эксперимент № 1)
17
Рис. 2. Оценка чувствительности метода FLASH-PCR
в выявлении вируса шарки слив (PPV), 5-кратные разведения
инокулюма лизирующим буфером, 7.02.2011 г. (эксперимент № 2)
Рис. 3. Оценка чувствительности метода FLASH-PCR
в выявлении вируса шарки слив (PPV), 5-кратные разведения
инокулюма лизирующим буфером, 17.08.2011 г. (эксперимент № 3)
18
Рис. 4. Оценка чувствительности метода FLASH-PCR
в выявлении вируса шарки слив (PPV), 10-кратные разведения
инокулюма лизирующим буфером, 1.03.2011 г. (эксперимент № 4)
Р1/Р2 (Wetzel et al., 1991; рекомендованы в диагностическом протоколе
ЕОКЗР РМ 7/32). Как и в описанных выше экспериментах, использовали тот же
инокулюм (листья изолята PPV РД-2, которые были отобраны в июле 2009г. и
хранились при -80 °С); выделение РНК и постановку реакции обратной
транскрипции
проводили
соответствующими
наборами
ООО
«Агродиагностика», но реакцию ПЦР-амплификации ставили с реакционными
смесями, приведенными в разделе «Материалы и методы». Результаты этих
экспериментов представлены на рисунках 6-7.
В результате проведенных экспериментов установлено, что набор для
FLASH-PCR не уступает по чувствительности выявления PPV стандартным
ПЦР-тестам с детекцией результатов методом электрофореза (рисунки 6-7).
19
Рис. 5. Оценка чувствительности метода FLASH-PCR
в выявлении вируса шарки слив (PPV), 5-кратные разведения
инокулюма соком листьев здорового растения вишни войлочной,
18.11.2011 г. (эксперимент № 5)
Рис. 6. Оценка чувствительности набора для ПЦР
c электрофоретической детекцией результатов к PPV фирмы
ООО «Агродиагностика», праймеры s1/as2,
специфический продукт – 268 п.о. (19.08.2011 г.)
Варианты (5-кратные разведения инокулюма лизирующим буфером):
1.
0 (30 мг инфицированных листьев в 400 мкл лизирующего буфера);
2.
1:5;
3.
1:25;
4.
1:125;
5.
1:625;
6.
1:3125;
7.
1:15625;
8.
1:78125;
9-10 – Лизирующий буфер (К-).
20
Рис. 7. Оценка чувствительности ПЦР c праймерами Р1/Р2
(Wetzel et al., 1991) в выявлении вируса шарки слив (PPV),
специфический продукт – 243 п.о. (24.08.2011 г.)
Варианты (5-кратные разведения инокулюма лизирующим буфером):
1.
0 (30 мг инфицированных листьев в 400 мкл лизирующего буфера);
2.
1:5;
3.
1:25;
4.
1:125;
5.
1:625;
6.
1:3125;
7.
1:15625;
8.
1:78125;
9-10 – Лизирующий буфер (К-).
3.2. Аналитическая специфичность
Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98 для определения аналитической
специфичности
испытуемой
тест-системы
отношению
целевым
нецелевым
к
присутствовать
в
и
образце.
В
проводится
скрининг
организмам,
дополнение
которые
желателен
по
могут
компьютерный
сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов используемых
праймеров и сиквенсов изолятов данного патогена в генбанке.
Специфичность набора для FLASH-PCR к PPV оценивали по реакции со
следующими вирусами:
1.
(ACLSV),
Триховирус
хлоротической
положительный
контроль
пятнистости
для
ИФА
листьев
яблони
фирмы
Adgen
21
(Великобритания), широко распространен на косточковых культурах (вариант
2).
2.
Иларвирус карликовости сливы (PDV), положительный контроль
для ИФА фирмы ACD (США), широко распространен на косточковых
культурах (вариант 3).
3.
Иларвирус некротической кольцевой пятнистости косточковых
(PNRSV), изолят выявлен на черешне (Prunus avium) в Московской области,
широко распространен на косточковых культурах (вариант 4).
4.
Неповирус скручивания листьев черешни (CLRV), изолят PV-
0797 DSMZ (Германия), широко распространен на косточковых культурах
(вариант 5).
5.
Иларвирус мозаики яблони (ApMV), положительный контроль
для ИФА фирмы Agdia (США), широко распространен на косточковых
культурах (вариант 6).
6.
Неповирус кольцевой пятнистости томата (ToRSV), изолят PV-
0380 DSMZ (Германия), встречается на косточковых культурах (вариант 7).
7.
Неповирус черной кольчатости томата (TBRV), изолят PV-0521
DSMZ (Германия), встречается на косточковых культурах (вариант 8).
8.
Потивирус Y картофеля, некротический штамм (PVY-NTN),
изолят PV-0410 DSMZ (Германия), не встречается на косточковых культурах,
член общего с PPV рода Potyvirus (вариант 9).
9.
Потивирус
А
картофеля
(PVА),
изолят
PV-0760
DSMZ
(Германия), не встречается на косточковых культурах, член общего с PPV
рода Potyvirus (вариант 10).
В качестве отрицательных контролей использовали листья здорового
растения вишни-магалепки (Prunus mahaleb) (вариант 1) и соответствующие
отрицательные контроли из набора для FLASH-PCR к PPV (варианты 16-17).
В качестве положительных контролей использовали листья вишни
войлочной (Prunus tomentosa), зараженной изолятом PPV RD-2 из Московской
22
области (вариант 11), изоляты PPV PV-0001, PV-0209, PV-0305, PV-0430 из
DSMZ (Германия) (варианты 12-15) и соответствующий положительный
контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (вариант 19).
Все изоляты DSMZ представляли собой лиофилизированные листья,
положительные контроли для ИФА – лиофилизированный сок; листья Prunus
avium, зараженные изолятом PNRSV, и листья Prunus tomentosa, зараженные
изолятом RD-2 PPV, хранились при -20 °С.
Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификации
проводили соответствующими наборами фирмы ООО «Агродиагностика».
Результаты эксперимента представлены на рисунке 8.
В результате проведенного эксперимента не отмечено неспецифической
реакции используемых праймеров с двумя потивирусами (PVA, PVY) и
несколькими вирусами, встречающимися на косточковых плодовых культурах
(PNRSV, PDV, ACLSV, CLRV, ApMV, ToRSV, TBRV). Наряду с этим
наблюдалась специфическая реакция с изолятами PPV из РФ и DSMZ Plant
Virus Collection (Германия). Проведенный эксперимент выявил высокую
специфичность набора для FLASH-PCR к PPV.
Специфичность праймеров, используемых в тест-системе для FLASHПЦР к PPV, была оценена также с помощью компьютерной программы PrimerBLAST. Программа подтвердила высокую специфичность используемых
праймеров и отсутствие их комплементарности с участками генома какихлибо иных нецелевых организмов.
Используемый в тест-системе для FLASH-ПЦР к PPV прямой праймер
s1 комплементарен участку 9201-9224 полного сиквенса генома PPV, а
обратный праймер as2 – участку 9443-9465. Данные участки близки к 5'-концу
гена
белка
оболочки,
который
характеризуется
наиболее
высокой
генетической вариабельностью и может существенно различаться между
штаммами PPV. В этой связи необходимо оценить также универсальность
23
пары праймеров s1/as2, то есть их способность выявлять все известные
штаммы PPV.
Программа Primer-BLAST показала, что оба испытуемых праймера были
полностью комплементарны участкам генома-мишени 232 референтных
изолятов PPV: 146 изолятам штамма PPV-D, 43 изолятам штамма PPV-Rec, 41
изолятам штамма PPV-M и 2 изолятам штамма PPV-T.
В то же время была констатирована частичная некомплементарность
испытуемых праймеров (по 1-3 нуклеотидам) с участками генома 39 других
изолятов PPV, имеющихся в генбанке данных. Большинство из данных
изолятов относятся к штаммам PPV-C (Cherry) – 2 изолята, PPV-W (Winona) –
4 изолята и PPV-EA (El Amar) – 20 изолятов, либо же к изолятам
неопределенного статуса, но наиболее генетически близким к штамму PPV-C
– 4 изолята. Оставшиеся 9 изолятов относятся к следующим штаммам: PPV-D
6 изолятов, PPV-Rec – 2 изолята и PPV-M – 1 изолят.
Рис. 8. Определение специфичности набора для FLASH-PCR к PPV
(16.08.2011 г.)
24
Варианты:
1.
Prunus mahaleb, здоровое растение (-K);
2.
ACLSV, положительный контроль для ИФА фирмы Adgen;
3.
PDV, положительный контроль для ИФА фирмы ACD;
4.
PNRSV, изолят на Prunus avium (-20 ºC);
5.
CLRV, изолят PV-0797, DSMZ;
6.
ApMV, положительный контроль для ИФА фирмы Agdia;
7.
ToRSV, изолят PV-0380, DSMZ;
8.
TBRV, изолят PV-0521, DSMZ;
9.
PVY-NTN, изолят PV-0410, DSMZ;
10.
PVA, изолят PV-0760, DSMZ;
11.
PPV, изолят RD-2 на Prunus tomentosa (-20 ºC);
12.
PPV, изолят PV-0001, DSMZ;
13.
PPV, изолят PV-0209, DSMZ;
14.
PPV, изолят PV-0305, DSMZ;
15.
PPV, изолят PV-0430, DSMZ;
16.
Отрицательный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (-K);
17.
Отрицательный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (-K);
18.
Вода (H2O);
19.
Положительный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (+К);
20-21. Фон.
Таким образом, используемые в тест-системе для FLASH-ПЦР к PPV
специфические
праймеры
s1/as2
комплементарны
участкам
генома
большинства референтных изолятов этого вируса, относящимся к штаммам
PPV-D, PPV-M, PPV-Rec и PPV-T. В то же время данные праймеры частично
некомплементарны участкам генома-мишени всех референтных изолятов
штаммов PPV-C и PPV-W. Будет ли данная некомплементарность оказывать
влияние на эффективность выявления штаммов PPV-C и PPV-W, было
изучено в нескольких дополнительных экспериментах с использованием
изолятов этих штаммов PPV, выявленных нами в различных регионах РФ
(рисунки
определена
8-11).
в
Штаммовая
2010-2011
гг.
принадлежность
с
данных
использованием
изолятов
была
штаммспецифичных
моноклональных антител и праймеров, ПЦР-RFLP и по результатам
сиквенирования продуктов амплификации. Листья косточковых культур,
инфицированные данными изолятами, хранились при -80 °С.
В первом из таких экспериментов (рисунок 9) установлено, что
испытуемая тест-система в формате FLASH эффективно выявляла изоляты
четырех различных штаммов вируса: PPV-W (изоляты VorR-85, Belt-122, BL25
1, RD-1, RD-3), PPV-C (изолят BelR-131), PPV-D (изоляты LipA-17, RosA-6,
RosPP-11, VolV-5, VolV-16, VolV-17, VolK-28, RP-1, TamM-17, StM-10) и
нового необычного вишневого штамма, наиболее близкого к штамму PPV-C
(изолят SamS-21).
Аналогичные результаты для этих изолятов получены и в проведенном
параллельно тесте c праймерами Р1/Р2 (Wetzel et al., 1991), рекомендованных
в диагностическом протоколе ЕОКЗР для универсального выявления всех
штаммов PPV (рисунок 10).
Используемые в тест-системе к PPV фирмы ООО «Агродиагностика»
праймеры s1/as2 реагировали с изолятами 5 штаммов этого вируса и в
стандартном ПЦР-тесте с детекцией продуктов амплификации методом
электрофореза (рисунок 11).
Универсальность праймеров s1/as2 была подтверждена также на
примере нескольких изолятов PPV, выявленных на различных косточковых
культурах в Волгоградской и Саратовской областях (рисунок 12).
Таким образом, установлено, что используемые в наборе FLASH-PCR
праймеры s1/as2 позволяют диагностировать различные изоляты PPV,
относящиеся к штаммам PPV-D, PPV-M, PPV-W и PPV-C, равно как и
генетически необычные изоляты этого вируса, вероятно, являющиеся новым
штаммом. Универсальность данных праймеров позволяет использовать
FLASH-PCR в качестве отборочного теста и для подтверждения результатов
ELISA-тестов с использованием поликлональных антител.
26
Рис. 9. Эффективность набора FLASH-ПЦР (праймеров s1/as2)
в выявлении изолятов различных штаммов PPV (27.10.2010 г.)
Изоляты:
1. LipA-17 (PPV-D, слива, Липецкая область;
2. RosA-6 (PPV-D, слива, Ростовская область);
3. RosPP-11 (PPV-D, слива, Ростовская область);
4. SamS-21 (необычный штамм, наиболее близок к PPV-C, вишня, Самарская
область);
5. VolV-5 (PPV-D, слива, Волгоградская область);
6. VolV-16 (PPV-D, слива, Волгоградская область);
7. VolV-17 (PPV-D, слива, Волгоградская область);
8. VorR-85 (PPV-W, слива, Воронежская область);
9. VolK-28 (PPV-D, слива, Волгоградская область);
10. RP-1 (PPV-D, слива, Московская область);
11. BelT-122 (PPV-W, слива, Белгородская область);
12. BelR-131 (PPV-C, вишня, Белгородская область);
13. BL-1 (PPV-W, слива, Московская область);
14. RD-1 (PPV-W, слива, Московская область);
15. RD-3 (PPV-W + PPV-D, слива, Московская область);
16. TamM-17 (PPV-D, слива, Тамбовская область);
17. StМ-10 (PPV-D, слива, Ставропольский край);
18. Отрицательный контроль для ИФА (-K) фирмы «Agritest»;
19. Положительный контроль из набора FLASH-ПЦР к PPV (+).
27
Рис. 10. Эффективность праймеров Р1/Р2 (Wetzel et al., 1991)
в выявлении российских изолятов различных штаммов PPV
(специфический продукт – 243 п.о.)
Изоляты:
1. LipA-17 (PPV-D, слива, Липецкая область;
2. RosA-6 (PPV-D, слива, Ростовская область);
3. RosPP-11 (PPV-D, слива, Ростовская область);
4. SamS-21 (необычный штамм, наиболее близок к PPV-C, вишня, Самарская
область);
5. VolV-5 (PPV-D, слива, Волгоградская область);
6. VolV-16 (PPV-D, слива, Волгоградская область);
7. VolV-17 (PPV-D, слива, Волгоградская область);
8. VorR-85 (PPV-W, слива, Воронежская область);
9. VolK-28 (PPV-D, слива, Волгоградская область);
10. RP-1 (PPV-D, слива, Московская область);
11. BelT-122 (PPV-W, слива, Белгородская область);
12. BelR-131 (PPV-C, вишня, Белгородская область);
13. BL-1 (PPV-W, слива, Московская область);
14. RD-1 (PPV-W, слива, Московская область);
15. RD-3 (PPV-W + PPV-D, слива, Московская область);
16. TamM-17 (PPV-D, слива, Тамбовская область);
17. StМ-10 (PPV-D, слива, Ставропольский край);
18. Отрицательный контроль для ИФА (-K) фирмы «Agritest»;
19. Положительный контроль из набора FLASH-ПЦР к PPV (+).
28
Рис. 11. Реакция праймеров s1/as2 (ООО «Агродиагностика»)
с российскими изолятами 5 штаммов PPV (формат «Форез»,
специфический продукт – 268 п.о., 7.05.2011 г.)
Изоляты:
1 – RosP-11 (PPV-D);
2 – STN (PPV-D, слива, Московская область);
3 – LipA-17 (PPV-D);
4 – RD-2 (PPV-D, вишня войлочная, Московская область);
5 – KrD-44 (PPV-M, персик, Краснодарский край);
6 – SamM-40 (необычный штамм, наиболее близок к PPV-C, слива, Самарская
область);
7 – SamM-41 (необычный штамм, наиболее близок к PPV-C, вишня, Самарская
область);
8 – SamS (необычный штамм, наиболее близок к PPV-C, вишня, Самарская область);
9 – BelR-131 (PPV-C);
10 – VorR-85 (PPV-W);
11-12 – Лизирующий буфер.
29
Рис. 12. Реакция праймеров s1/as2 (ООО «Агродиагностика»)
с изолятами PPV, выявленными на косточковых культурах
в Саратовской и Волгоградской областях (формат FLASH, 16.09.2011 г.)
Изоляты:
1. SarG-75 (вишня, необычный изолят, наиболее близкий к PPV-C);
2. SarG-79 (вишня, необычный изолят, наиболее близкий к PPV-C);
3. SarH-83 (вишня, необычный изолят, наиболее близкий к PPV-C);
4. VolV-95 (слива, PPV-D);
5. VolV-99 (слива, PPV-D);
6. VolV-114 (вишня, PPV-D);
7. VolP-130 (вишня войлочная, PPV-D);
8. VolP-134 (вишня войлочная, PPV-D);
9. VolK-143 (вишня, PPV-C);
10. VolK-144 (вишня, PPV-C).
3.3. Селективность
Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98 для определения селективности
необходимо оценить влияние природного субстрата, что применительно к
вирусам означает оценку влияния экстрактов сока различных растений-хозяев.
Определение селективности осуществляется путем добавления инокулюма в
экстракты сока здоровых растений различных культур.
30
В опыте были использованы листья здоровых растений алычи
(P. cerasifera), абрикоса (P. armeniaca), персика (P. persica) и сливы
(P. domestica), которые были проанализированы методом FLASH-PCR без
добавления инокулюма (варианты 1-4) и с добавлением инокулюма (10 мкл
гомогенизата листьев вишни войлочной, зараженной изолятом РД-2 PPV,
добавляли к 400 мкл гомогенизата листьев здоровых растений) (варианты 5-8).
Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификации
проводили соответствующими наборами фирмы ООО «Агродиагностика».
Результаты эксперимента представлены на рисунке 13.
В результате проведенного эксперимента не отмечено влияния
природного субстрата (сока четырех различных видов косточковых культур)
на эффективность выявления PPV испытуемым набором.
Рис. 13. Определение селективности набора для FLASH-PCR к PPV
(15.08.2011 г.)
Варианты:
1.
Алыча (P. cerasifera), без добавления инокулюма;
2.
Абрикос (P. armeniaca), без добавления инокулюма;
3.
Персик (P. persica), без добавления инокулюма;
4.
Слива (P. domestica), без добавления инокулюма;
5.
P. cerasifera + PPV;
6.
P. armeniaca + PPV;
7.
P. persica + PPV;
8.
P. domestica + PPV;
9.
Отрицательный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (-K);
31
10. Отрицательный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (-K);
11. Положительный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (+K);
12-13. Фон.
3.4. Повторяемость
Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98 для определения повторяемости
необходимо проанализировать не менее двух образцов: с низким и средним
уровнем заражения исследуемым вирусом. Каждый образец должен состоять
из двух субобразцов, которые должны быть проанализированы не менее чем в
трех повторностях.
В нашем эксперименте в качестве образцов были использованы листья
растения сливы, зараженной изолятом РД-1 PPV (смешанная инфекция
штаммов PPV-W и
PPV-D),
и
листья
растения
вишни
войлочной,
инфицированной изолятом РД-2 PPV (штамм PPV-D). Данные растения
содержатся на инфекционном участке ФГБУ «ВНИИКР».
Каждый образец был разделен на два субобразца (образец № 1 и образец
№ 2), каждый субобразец был проанализирован в 4-кратной повторности.
Результаты эксперимента представлены на рисунке 14.
PPV был выявлен во всех образцах-повторностях. Тем самым
констатирована возможность высокой повторяемости результатов при
использовании испытуемой тест-системы.
3.5. Воспроизводимость
Согласно
Стандарту
ЕОКЗР
РМ
7/98
эксперимент
по
оценке
воспроизводимости проводится по такой же методике, что и определение
повторяемости, но другим оператором, в другие сроки и по возможности на
другом оборудовании.
32
Для оценки воспроизводимости набора для FLASH-PCR к PPV
эксперимент, описанный в разделе 3.4 и выполненный оператором – младшим
научным сотрудником Т.С. Живаевой, был воспроизведен другим оператором
–
младшим
научным
сотрудником
Ю.А. Шнейдером.
Результаты
эксперимента представлены на рисунке 15.
Результаты
тестов,
выполненных
операторами
Т.С. Живаевой
и
Ю.А. Шнейдером, оказались полностью идентичными. Это свидетельствует о
возможности высокой воспроизводимости результатов при использовании
испытуемой тест-системы.
Рис. 14. Определение повторяемости набора для FLASH-PCR к PPV
(оператор Живаева Т.С., 26.08.2011 г.)
Варианты:
1-4 – Изолят РД-1, образец № 1;
5-8 – Изолят РД-1, образец № 2;
9-12 – Изолят РД-2, образец № 1;
13-16 – Изолят РД-2, образец № 2;
17-19 – Отрицательный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (-K);
20 – Положительный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (+K).
33
Рис. 15. Определение воспроизводимости набора для FLASH-PCR
к PPV (оператор Шнейдер Ю.А., 30.08.2011 г.)
Варианты:
1-4 – Изолят РД-1, образец № 1;
5-8 – Изолят РД-1, образец № 2;
9-12 – Изолят РД-2, образец № 1;
13-16 – Изолят РД-2, образец № 2;
17-18 – Отрицательный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (-K);
19 – Положительный контроль из набора для FLASH-PCR к PPV (+K).
34
Выводы
1.
При
использовании
лизирующего
буфера
для
разбавления
инокулюма тест-система для FLASH-ПЦР к PPV позволяла выявлять вирус
при разведении 1:1000000. В трех проведенных тестах получено полное
совпадение результатов.
При использовании для разбавления инокулюма неинфицированного
сока вирус выявляли при разведении 1:3125.
2.
PPV
Набор для FLASH-PCR не уступает по чувствительности выявления
стандартным
ПЦР-тестам
с
детекцией
результатов
методом
электрофореза.
3.
Установлена высокая специфичность набора FLASH-PCR к PPV. Не
отмечено неспецифической реакции используемых праймеров с двумя
потивирусами (PVA, PVY) и несколькими вирусами, встречающимися на
косточковых плодовых культурах (PNRSV, PDV, ACLSV, CLRV, ApMV,
ToRSV, TBRV).
4.
Установлено, что используемые в наборе FLASH-PCR праймеры
s1/as2 позволяют диагностировать различные изоляты PPV, относящиеся к
штаммам PPV-D, PPV-M, PPV-W и PPV-C, равно как и генетически
необычные изоляты этого вируса, вероятно, являющиеся новым штаммом.
Универсальность данных праймеров позволяет использовать FLASH-PCR в
качестве отборочного теста и для подтверждения результатов ELISA-тестов с
использованием поликлональных антител.
5.
Не отмечено влияния природного субстрата (сока четырех
различных видов косточковых культур) на эффективность выявления PPV
испытуемым набором.
6.
Проведенные
повторяемости
и
испытания
воспроизводимости
свидетельствуют
результатов
при
о
высокой
использовании
испытуемой тест-системы.
35
7.
Выпускаемая фирмой ООО «Агродиагностика» тест-система для
FLASH-ПЦР
к
чувствительностью
селективностью,
PPV
характеризуется
и
специфичностью,
обеспечивает
высокий
высокой
обладает
уровень
аналитической
необходимой
повторяемости
и
воспроизводимости результатов и может быть рекомендована для проведения
лабораторной
экспертизы
для
выявления
и
идентификации
этого
карантинного организма.
36
Список использованной литературы
1.
Варицев
Ю.А.,
Мазурин
Е.С.,
Дренова
Н.В.,
Усков
А.И.,
Джалилов Ф.С., Шероколава Н.А. Результаты сравнительного испытания
российских и зарубежных тест-систем для выявления латентной инфекции
возбудителя кольцевой гнили картофеля // Картофелеводство / сборник науч.
трудов. – Минск, 2008. – С. 350-357.
2. Завриев С.К., Рязанцев Д.Ю., Кошкина Т.Е., Абрамов Д.Д.
Эффективный
и
экономичный
метод
чувствительной
диагностики
и
идентификации патогенов картофеля // Материалы международного конгресса
«Картофель. Россия-2007». – С. 100-103.
3. Кулинич О.А., Рогожин Е.А., Рысс А.Ю., Дренова Н.В., Пономарев
В.Л. Сосновая стволовая нематода: освоен экспресс-метод ее выявления //
Защита и карантин растений. – 2008. – № 11. – С. 19-20.
4. Кулинич О.А., Чернецкая А.Ю., Рысс А.Ю., Рязанцев Д.Ю.,
Завриев С.К. Испытание ПЦР-систем в формате FLASH для диагностики и
идентификации стволовых нематод группы видов Bursaphelenchus xylophillus
// Труды центра паразитологии. – Т. XLV: Систематика и биология паразитов.
М., 2008а. – С. 314-318.
5. Кулинич О.А., Рысс А.Ю., Чернецкая А.Ю., Пономарев В.Л.,
Рязанцев Д.Ю.,
Завриев
С.К.
Использование
ПЦР-диагностики
для
идентификации карантинных видов нематод // Защита и карантин растений. –
2008б. – № 9. – С. 36-38.
4. Походенко П.А., Упадышев М.Т. Диагностика вируса шарки сливы на
косточковых культурах // Защита и карантин растений. – 2008. – № 7. – С. 2526.
5. Шафикова Т.Н., Бояркина С.В., Эпова Е.Ю., Кузнецова Е.В.
Диагностика возбудителя кольцевой гнили в клубнях картофеля методом
37
полимеразной цепной реакции / Картофелеводство. – 2007. – Т. 12 – С. 384389.
6. Bosch R.A., Reintke J. Detection of quarantine organisms using FLASHPCR and GENE // HLB-report 571. – 2007.
7. EPPO, 2004. Diagnostic protocols for regulated pests. Plum pox potyvirus.
РМ 7/34 // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. - 2004. - Vol. 34. - P. 247-256.
8. Pastrik K.H. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in
potato tubers by multiptex PCR with coamplification of host DNA // European J.
Plant Pathology. – 2000. – Vol. 106. – P. 155.
38