Микроорганизмы как агенты биологического контроля патогенных грибков Fusarium на озимой пшенице. Urszula Wachowska, Katarzyna Kucharska, Malgorzata J^dryczka, Natalia Lobik 'Department of Phytopathology and Entomology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Prawochen skiego 17,10-957 Olsztyn, Poland institute of Plant Genetics of the Polish Academy of Sciences, Strzeszyn ska 34, 60-479 Poznan , Poland Received: 13 September 2012 Accepted: 26 November 2012 Аннотация В лабораторных условиях была проверена эффективность бактерий рода Sphingomonas и Bacillus, а так же дрожжей рода Cryptococcus, Rhodotorula, и Saccharomyces в качестве агентов контроля патогенных микроорганизмов, колонизирующих озимую пшеницу. Все испытанные изоляты дрожжей произвели эффект замедления развития на колонии F. sporotrichioides. В тех же самых условиях изолят бактерии Sphingomonas S 11 был враждебен по отношению к F. avenaceum, F. culmorum, F. tricinctum, и F. graminearum. Саженцы озимой пшеницы сорта Sumai, которые были обработаны бактериальной суспензией микроорганизмов Sphingomonas S 11 и привиты F. Culmorum, продемонстрировали гораздо меньше симптомов заболевания, чем необработанные саженцы, так же привитые указанным выше патогеном. Введение Грибы рода Fusarium являются некротрофными патогенами озимой пшеницы и могут заражать урожаи в целых регионах, вызывая Фузариозную корневую гниль пшеницы, Фузариозную гниль прикорневой части стебля, Фузариоз всходов пшеницы и Фузариоз колоса (Fusarium head blight - FHB). Следующие виды Fusarium наиболее часто изолируют из озимой пшеницы: F. culmorum, F. avenaceum, F. poae, F. graminearum, F. sporotrichioides, F. tricinctum, F. proliferatum, и F. Langsethiae, в которой они определяются спорадически [1-4]. Эти патогены снижают урожайность пшеницы и могут колонизировать зерно в зернохранилищах. Микотоксины, которые накапливаются зараженной вышеуказанным грибком пшенице, представляют опасность для здоровья человека и животных. Каждый вид Фузариоза производит один и более видов микотоксинов. Следующие виды микотоксинов чаще всего находятся в зернах озимой пшеницы: Дезоксинваленол (DON) [5, 6] и другие трихотецины, зеараленон (ZEA) [6], фумонизины, монилиформины и энниатины [1, 4, 7, 8]. Вид F. culmorum вызывает системное заражение растений пшеницы проникая в них через корни, стебли и шипы [9]. Преобладающая роль F. culmorum в патогенезе корневой гнили и фузариоза колоса, широко обсуждалась многими авторами [9-11]. Основная стратегия контроля заболевания включает в себя применение системы севооборота, внедрение менее чувствительных к заболеванию сортов, адекватное применение различных способов обработки почвы, внесение удобрений, и применение фунгицидов: бензимидазол, азол, стробилурин [10,12]. Сгласно некоторым отчетам фунгициды имеющие в своем составе тебуконазол [12] и азоксистробин [13] не всегда эффективно подавляют фузариоз колоса или понижают уровни дезоксинваленола в зерне пшеницы [12, 13]. Эти недостатки определяют необходимость поиска альтернативной стратегии включающей биологические методы контроля распространения патогенов Fusarium. Биологические препараты могут быть высоко эффективны при органическом земледелии, в котором не допускается применение химических веществ по причине требований сертификации продукции и ожиданий со стороны потребителей. Они так же могут быть использованы для защиты зерна на хранении [14]. Вишневська (Wisniewska) и другие [15] продемонстрировали, что виды антагонисты Trichoderma harzianum подавляют рост колоний Fusarium sporotrichioides и понижают концентрацию трихотецина типа А в семенах овса и пшеницы. Кхан и Духан (Khan and Doohan) [16] изолировали штаммы Pseudomonas fluorescens MKB 158 и MKB 249 и штамм P. frederiks-bergensis 202, которые снижали интенсивность заражения фузариозом через шипы, привитые F. culmorum, а так же минимизировали потерю веса из расчета на тысячу ядер и понижали концентрацию дезоксинваленола в ядрах озимой пшеницы. Проводя детальное исследование, упомянутые выше авторы выявили, что хитозан, произведенный промышленным способом, эффективнее чем штамм Pseudomonas fluorescens MKB 158 [17]. Занг (Zhang) и др. [18] выяснили что в тепличных условиях Cryptococcus flavescens так же имеет эффекты антагонизма патогенам заражающим пшеницу через шипы. Не смотря на все усилия, на рынке представлены всего несколько коммерческих продуктов на основе полезных микроорганизмов и почти все они предназначены для защиты фруктов во время хранения [19, 20]. Целью данного исследования был поиск изолятов дрожжей и бактерий, происходящих из разнообразных сред обитания, которые подавляют развитие патогенов Fusarium. Материалы и Методы Происхождение микробных изолятов антагонистов В эксперименте были использованы изоляты бактерий и дрожжей полученные из листьев и ризосферы озимой пшеницы сорта Tonacja (Табл.1). Изоляты Sphingomonas S11 были выделены из ризосферы, а бактерии Bacillus B1 были выделены из филосферы растения. Их таксонометрическое состояние было определено путем молекулярного анализа [21]. Фрагменты листьев длиной 1 см были помещены в 250 мл колбу (15 шт. на колбу), заполненные 15 мл стерильной воды [22]. Фрагменты корней озимой пшеницы были помещены вместе с 10 гр почвы из области ризосферы в 250 мл колбу, заполненную 90 мл стерильной воды. Колбы с листьями и корнями перемешивались 30 мин. на вибростенде, после чего 0,1 мл полученной суспензии был перенесен на чаши Петри и погружен в среду Мартина [23] для получения дрожжей, в среду Кинга В [24] для изоляции бактерий Sphingomanas и в питательную среду агар для изоляции бактерий Bacillus [20]. Колонии грибков хранились в трубках Эпендорфа при температуре 4°С. Изоляты дрожжевых культур Cryptococcus albidus штамм albidus (CBS 2991), Rhodotorula glutinis штамм glutinis (CBS 2367), и Saccharomyces cerevisiae штамм cerevisiae (CBS 2451), полученные из Утрехтского Генетического Банка (Utrecht GeneBank), использовались и в последующих тестах in vitro. Происхождение изолятов Fusarium Изоляты рода Fusarium были получены из зерна озимой пшеницы сорта Bogatka. Ядра поместили в среду картофельного агара с декстрозой (Potato Dextrose Agar - PDA), и растущие колонии микроорганизмов были так же пересеяны на среду картофельного агара с декстрозой. Изоляты были распознаны до уровня вида, основываясь на характеристиках спорообразования [24]. Их таксонометрическое состояние было определено путем молекулярного анализа [21]. Таблица 1. Происхождение изолятов в этом исследовании. Изолят Местонахо Происхожде ждение в ние Польше Год изоляции Ризосфера Sphingomona пшеницы 2007 s sp.(Sll) (cv. Tonacja) Tomaszkowo 20°41'E, Филосфера 53°72'N Bacillus пшеницы 2005 sp. (Bl) (cv. Tonacja) Эффекты антагонизма и конкуренции микроорганизмов в отношении патогена Fusarium Были оценены эффекты подавления изолятами Bacillus B1 и Sphingomonas S11, а так же изолятами 3-х типов дрожжевых культур (Cryptococcus albidus штамм albidus CBS 2991, Rhodotorula glutinis штамм glutinis CBS 2367, и Saccharomyces cerevisiae штамм cerevisiae CBS 2451) патогенов рода Fusarium (F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum, F. poae, F. sporotrichiodes, F. tricinctum). Агаровые диски диаметром 5 мм с разросшимся двухнедельным мицелием культуры Fusarium были помещены на раствор картофельного агара с декстрозой в центре чаши Петри. Изоляты дрожжей и бактерий антагонистов были нанесены тонким слоем на расстоянии 2 см от колонии патогена. Чаши хранились в темноте при температуре 24°C. Оценка эффектов конкуренции и подавления выбранных изолятов была проведена через 4 дня. Эффекты подавления бактерий и дрожжей были определены на основе коэффициентов эллиптичности тестируемого патогена, который рассчитывался путем деления длинны короткой (малой) оси на длину длинной (большей) оси эллипса описанного вокруг колонии патогена. Изоляты антагонисты, которым удалось изменить форму колонии фитопатогена с круга до сильно вытянутого эллипса, были классифицированы как активные. В подобных случаях коэффициент эллиптичности был ниже 0,69. Поверхность сформированная колониями грибка Fusarium выполнила роль шкалы для сравнения активности тестируемых антагонистов, оценка производилась при помощи программы ImageJ v. 3.0. Уровни выживаемости бактериальных и грибковых изолятов при температуре 35°C Суспензии изолятов были культивированы в среде картофельного агара с декстрозой на затвердевшем агаре. 0,1 мл бактериальной суспензии (106) нанесли тонким слоем на картофельный агар с декстрозой при температуре 35°C. Колонии появились через четверо суток. Использование бактерий Sphingomonas для защиты озимой пшеницы от заражения вызванного F. culmorum Ядра озимой пшеницы сорта Sumai были распределены по горшкам диаметром 12 см и наполнены почвой с гумусом и песком в соотношении 2:1. В каждом горшке 20 ядер озимой пшеницы, с продезинфицированной 1% раствором гипохлорита натрия поверхностью, были высажены на глубину 2 см. Через 2 недели листья всходов были обработаны распылением суспензии изолята Sphingomonas S11 (2х10 5 ед. на см 3 воды). Таблица 2 — Эффекты подавления видов Fusarium дрожжевыми и бактериальными культурами. Виды Fusarium Патогены Антагонисты Контроль Bacillus sp. (B 1) Sphingomonas sp. (S 11) Cryptococcus albidus штамм albidus (CBS 2991) Rhodotorula glutinis штамм glutinis (CBS 2367) Saccharomyces cerevisiae штамм cerevisiae (CBS 2451) F. avenaceum Fa 69 Fa 70 nt 0.9f-j nt 0.79d-j 0.92jkl 0.74b-j 0.83f-j 0.86f-j Fusarium Fusarium Fusarium Fusarium culmorum graminaeum poae sporotrichioid.es Fa 9 Fc36 Fg88 Fp24 Fs74 Коэффициент эллиптичности 0.97kl 0.94jkl 0.96kl nt 1.001 0.67a-i 0.67a-h 0.88f-j 0.77c-j 0.72b-j 0.63a-g 0.68a-k 0.66a-h nt 0.81f-j 0.79d-j 0.87f-j 0.89f-j 0.9f-j 0.58a-d Fusarium Состояние tricinctum антагониста Ft 65 1.041 0.48a-e 0.59a-d 0.58a-d 0.97D 0.73A 0.69A 0.80B 0.77c-j 0.88f-j 0.79d-j 0.91g-j nt 0.84e-j 0.55a-d 0.95j 0.78AB 0.8d-j 0.79c-j 0.93jkl 0.88f-j nt 0.74b-j 0.52ab 0.94ij 0.76AB Значения за которыми идут одинаковые буквы по тесту Ньюмана-Кела (Newman-Keuls) различаются незначительно (p=0.01). nt – не тестировались. Саженцы пшеницы были обработаны культурой F. culmorum Fc 38 2-х недельного развития, взятой с 10 мм агарового диска. Инфицирование саженцев производилось через: 24, 48, 72 и 96 часов с момента обработки бактериями антагонистами. Горшки находились в камере с возможностью контроля условий окружающей среды и содержались в ней с 12-ти часовым циклом освещения, при постоянной влажности 98% и температуре 22-23°C. Эксперимент проводился на 4-х аналогичных группах. В течение всего эксперимента саженцы поливались раствором Хогланда (Hoagland's solution) содержащим макро- и микроэлементы. Основным фактором эксперимента были временные интервалы между применением бактерий и патогеном. Через 2 недели фитосанитарное состояние саженцев оценивалось по 5 бальной шкале: 0 — здоровое растение 1 — патологические изменения длинной до 3 см на поверхности колеоптиля 2 — патологические изменения длинной 3-5 см поверхности колеоптиля 3 — патологические изменения по всей длине колеоптиля 4 — отмирание семян Статистический анализ Результаты эксперимента были подвергнуты статистическому анализу при помощи программы Statistica 8.0. Величина отличий между способами обработки растений определялась на основе теста Ньюмана-Кела (p=0.01, p=0.05). Результаты Микроорганизмы антагонисты и конкуренты грибкам рода Fusarium На основе результатов эксперимента, представленных в Таблице 2, видно, что изучаемые микроорганизмы антагонисты успешно подавляют развитие колоний Fusarium в лабораторных условиях. Изоляты, которые изменили форму развития колоний патогена на эллиптическую, с коэффициентом эллиптичности менее 0,69, были классифицированы как биологически активные. В подобных случаях эффект подавления патогена антагонистами равнялся 31%, а зона подавления между антагонистом и патогеном была не менее 10 мм в диаметре. На F. sporotrichioides Fs74 все примененные дрожжевые изоляты демонстрировали положительный подавляющий эффект (Таблица 2). В целом, дрожжи значительно ограничивали рост большинства изучаемых фитопатогенов (Таблица 3). Изолят F. avenaceum Fa69 проявил себя наиболее устойчивым к воздействию изучаемых конкурирующих микроорганизмов и ни один из исследуемых антагонистов не сумел ограничить его рост до удовлетворительного уровня. Изолят Bacillus В1 эффективно угнетал развитие изолятов F. avenaceum Fa9, F. culmorum Fc36, and F. tricinctum Ft65 (Таблицы 2 и 3). Изолят Sphingomonas S11 наиболее сильно продемонстрировал эффект антагонизма против F. avenaceum Fa9, F. culmorum Fc36, F. tricinctum Ft65, и Fusarium gramin-earum Fg88 (Таблица 2). В сравнении с контролем, указанный выше изолят, имел сильный подавляющий эффект на рост колоний патогена, но в сравнении с другими микроорганизмами бактерии Sphingomonas S11 оказывали самое слабое угнетающее воздействие (Таблица 3). Изолят Sphingomonas S11 был в использован в последующем анализе целью которого стало определение его потенциальной защитной активности против F. culmorum. Уровни выживаемости бактериальных и грибковых изолятов при температуре 35°C После четырехдневного инкубационного периода при температуре 35°C, изоляты Rhodotorula glutinis штамм glutinis (CBS 2367) и Saccharomyces cerevisiae штамм cerevisiae (CBS 2451) сформировали множественные колонии (Рисунок 1), не смотря на то, что при этом колоний Bacillus B1, Sphingomonas S11 и колоний грибкового изолята Cryptococcus albidus штамм albidus (CBS 2991) замечено не было. Таблица 3 — Эффекты антагонизма и конкуренции микроорганизмов в отношении патогена Fusarium (поверхность колонии) Виды Fusarium F. avenaceum Fusarium Fusarium Fusarium Fusarium culmorum graminaeum poae sporotrichioides Fa 69 Fa 70 Fa 9 Fc36 Fg88 Fp24 Fs74 Размер области колонии патогена в мм2 nt 83.25cde 153.8f 108.7e 149f nt 99.67de 7.01a 73.32c-d 64.17c-d 44.9abc 54.26c-d 16.3ab 77.6b-d 7.01a 10.57ab 18.84ab 20.62ab 12.04ab nt 14.97ab 7.12a 13.92ab 13.82ab 19.89f-j 15.28ab nt 13.35ab Патогены Антагонисты Контроль Sphingomonas (S 11) Bacillus sp. (B 1) Cryptococcus albidus штамм albidus (CBS 2991) Rhodotorula glutinis 7.54a 14.03ab 17.69ab 22.29ab штамм glutinis (CBS 2367) Saccharomyces cerevisiae 7.54a 14.13ab 16.54ab 21.14ab штамм cerevisiae (CBS 2451) Fusarium Состояние tricinctum антагониста Ft 65 183.4f 65.99c-d 26.17abc 26.69abc 123.8C 60.73B 15.82A 15.44A nt 17.8e-j 26.43abc 16.85ab 18.63 A nt 17.9b-j 26.69abc 19.05ab 18.71A Значения за которыми идут одинаковые буквы по тесту Ньюмана-Кела (Newman-Keuls) различаются незначительно (p=0.01). nt – не тестировались. Заражение озимой пшеницы, защищенной изолятом Sphingomonas S11 Через 96 часов, всходы озимой пшеницы сорта Sumai, обработанные клеточной суспензией Sphingomonas S11, а после нее F. culmorum, имели значительно меньшую степень поражения нежели всходы обработанные лишь анализируемым патогеном (Рисунок 2). В этом опыте эффективность биологического контроля со стороны изолята Sphingomonas S11 достигла 67% относительно контрольного образца. Бактерии рода Sphingomonas не смогли защитить всходы зараженные F. culmorum через 24, 48 и 72 часа с момента обработки их изолятом антагонистом. Обсуждение Микроорганизмам использованным в данном эксперименте in vitro удалось значительно подавить рост патогена Fusarium. В эксперименте, проведенном доктором Зангом и др. [18] применение изолята дрожжевой культуры Cryptococcus flavescens, OH 182.9, позволило значительно снизить тяжесть симптомов поражения фузариозом колоса пшеницы. Упомянутые выше авторы установили, что существует заметная разница между механизмом защитной реакции, вызванной в растении исследуемым изолятом, и механизмом реакции при защите шипов от инфкции F. graminearum [18]. Их результаты были подтверждены нашим исследованием изолятов Cryptococcus albidus штамм albidus (CBS 2991), Rhodotorula glutinis штамм glutinis (CBS 2367), и Saccharomyces cerevisiae штамм cerevisiae (CBS 2451) по результатам которого был четко виден эффект подавления развития грибков F. sporotrichioides. Выше указанные изоляты не демонстрировали свойства агентов эффективного биологического контроля против остальных видов Fusarium. Изоляты Rhodotorula glutinis штамм glutinis (CBS 2367) и Saccharomyces cerevisiae штамм cerevisiae (CBS 2451) смогли активно развиваться только при температуре 35°C, как следствие они не рекомендованы к полевому применению по причине потенциального риска [26]. Рис.1. Выживаемость микрорганизмов при 35°C. Значения за которыми идут одинаковые буквы по тесту Ньюмана-Кела (Newman-Keuls) различаются незначительно (p<0.01). nt – не тестировались. Применение бактерий Bacillus в качестве агента биологического контроля патогенных микроорганизмов на озимой пшенице было широко задокументировано [22,27,28]. Некоторые авторы продемонстрировали, что отдельные изоляты Bacillus могут подавлять развитие F. graminearum на шипах колосьев пшеницы и ограничивать выработку микотоксинов, а в частности дезоксинваленола [28]. В данном исследовании изолят бактерий Bacillus sp. В1 продемонстрировал яркий эффект антагонизма по отношению к трем видам Fusarium. В работах Наурозян (Nourozian) и др. [20], изоляты Bacillus subtilis были сильными антагонистами F. graminearum. Их метаболиты имели гораздо более сильный фунгицидный эффект, а метаболиты изолята B. subtilis 71 подавляли рост колоний F. graminearum на 97% в сравнении с контрольными группами [20]. В нашем исследовании изолят В1 Bacillus sp. в основном был для патогенов антагонистом. Колонии Fusarium растущие в присутствии этих изолятов имели форму сильно вытянутых эллипсов. Результаты их исследований показывают, что бактерии рода Bacillus могут производить липопептиды, потенциально со свойствами фунгистатиков [27]. Рис. 2. Степень заражения озимой пшеницы сорта Sumai, обработанного суспензией спор Sphingomonas S11, и инфицированного F. culmorum. Контроль - саженцы инфицированы F. culmorum но не обрабатывались Sphingomonas S11. 24h, 48h, 72h, 96h - саженцы обработанные Sphingomonas S11 и зараженные F. culmorum соответственно спустя 24, 48, 72 и 96 часов. Значения за которыми идут одинаковые буквы по тесту Ньюмана-Кела (NewmanKeuls) различаются незначительно (p<0.01). В данном эксперименте изолят Sphingomonas sp. S 1 продемонстрировал сильный эффект антагонизма против 4-х патогенов вида Fusarium. Иннербнер (Innerebner) и др. [29] сообщал, что изоляты рода Sphingomonas успешно защищали растения Arabidopsis thaliana от патогена Pseudomonas syringae. Упомянутые авторы демонстрировали наличие эффекта антагонизма и конкуренции исследуемых изолятов в отношении патогенов, заражающих растение через поверхность листьев [29]. В ходе исследований выяснилось, что доминирующую роль в подавлении роста патогенов играют вещества с бактерицидными свойствами. Бактерии рода Pseudomonas ssp. производят несколько подобных веществ, в частности феназин и 2,4диацетилфлороглюцинол [20]. Эффекты антагонизма и конкуренции изолята Sphingomonas S 11 используемого против патогенов Fusarium в нашем исследовании были продемонстрированы in vitro. Согласно результатам экспериментов, которые получены в контролируемой среде, можно предположить, что изолят Sphingomonas S 11 мог вызвать защитную реакцию растений. В данных экспериментах всходы озимой пшеницы сорта Sumai, которые имеют высокую сопротивляемость патогенным инфекциям, были обработаны Sphingomonas S 11 и заражены F. culmorum, будучи разделены как в пространстве, так и по времени заражения. Антагонист применялся к листьям, а патоген к клеоптилю растения. Отсюда можно заключить, что антагонист вызвал индуцированную системную устойчивость растения (induced systemic resistance (ISR)). Как показано более ранними исследованиями, ростстимулирующая ризобактерия (plant-growth promoting rhizobacteria (PGPR)) рода Pseudomonas spp. вызывает у своего носителя индуцированную системную устойчивость [30-35] с секрецией липополисахаридов (lipopolysaccharides (LPS)), флагеллина или секрецией соединений подобных Fe3+-хелатной сидерофоре [23-37]. Индуцированная системная устойчивость в основном полагается на механизмы «прайминга» [30-36]. Клетки растения демонстрируют усиленную защитную реакцию благодаря накоплению либо посттрансляционной модификации одного и\или более сигнальных протеинов, которые проходят экспрессию и\или изменение вследствие чего становятся неактивными. Растение может активировать более быструю и сильную защитную реакцию только когда сигнал от патогена получен [38]. Петти и другие [39] установили, что бактерии Pseudomonas fluorescens значительно повлияли на увеличение числа транскрипций до 1,203, а так же запустили 74 позитивных и 14 негативных реакций на присутствие патогена (P = 0.05). В настоящем исследовании растения обработанные F. culmorum только через 96 часов продемонстрировали самую низкую чувствительность к заражению патогеном после применения изолята Sphingomonas S 11. У растений, зараженных патогеном через 24, 48 и 72 часов с момента применения антагониста к листьям, симптомы заражения F. culmorum были настолько сильны, что фактическая неэффективность исследуемого агента биологического контроля стала очевидной. Симптомы заражения F. culmorum были эффективно подавлены только после 96 часов. Вероятно изолят Sphingomonas спровоцировал изменения на уровне экспрессии генов в жасмоновой кислоте или этилен-зависимых защитных сигнальных путях. Было подтверждено, что вышеприведенные изменения происходят благодаря бактериям Pseumodomonas, которые позволяют растению включать более эффективные механизмы защиты от патогенных инфекций, не проходя значительных метаболических изменений [30,31,36-38]. Защитная реакция растения так же может быть использована для увеличения скорости роста и урожайности озимой пшеницы в полевых условиях. Список использованной литературы 1.KULIK T. Development of a duplex PCR assay for the simultaneous detection of Fusarium poae and Fusarium sporotrichioides from wheat. J. Plant Pathol. 90, (3), 441, 2008. 2.LUKANOWSKI A., LENC L., SADOWSKIC. First report on the occurrence of Fusarium langsethiae isolated from wheat kernels in Poland. Plant Dis. 92, (3), 488, 2008. 3.STENGLEIN S. A. Fusarium poae: a pathogen that needs more attention. J. Plant Pathol. 91, (1), 25, 2009. 4.STETIEN L., CHELKOWSKI J. Fusarium Head Blight of wheat - pathogenic species and their mycotoxins. World Mycotoxin Journal 3, (2), 107, 2010. 5.MANKEVICIENE A., BUTKUTE B., GAURILCIKIENE I., DABKEVTCIUS Z. Risk assessment of Fusarium mycotoxins in Lithuanian small cereal grains. Food Control 22, 970, 2011. 6.BALIUKONIENE V, BAKUTIS B., JANUSKEVICIENE G., MISEIKINE R. Fungal contamination and Fusarium mycotoxins in cereals grown in different tillage system. J. Anim. Feed Sci. 20, 637, 2011. 7.PATERSON R.R.M., LIMA N. Further mycotoxin effects from climate change. Food Res. Int. 44, 2555, 2011. 8.SKRIBIC B., MALACHOVA A., ZIVANCEV J., VEPRIKOVA Z., HAJSLOVA J. Fusarium mycotoxins in wheat samples harvested in Serbia: A preliminary survey. Food Control 22,1261, 2011. 9.SCHLUTER K., KROPF U., KARLOVSKY P. An examination of systemic infections of Fusarium culmorum in Schleswig-Holstein. Gesunde Pflanzen 58, 107, 2006. 10.EDWARDS S. G. Influence of agricultural practices on fusarium infection of cereals and subsequent contamination of grain by trichothecene mycotoxins. Toxicol. Lett. 153,29, 2004. 11.MAGAN N., HOPE R., ALDRED D. Ecophysiology of Fusarium culmorum and mycotoxin production. Advances in Food Mycology. 571, (3), 123, 2006. 12.WEGULO S.N., BOCKUS W.W., NOPSA J.H., WOLF E.D., ESKRIDGE K.M., PEIRIS K. H.S., DOWELL F.E. Effects of integrating cultivar resistance and fungicide application on Fusarium head blight and deoxynivalenol in winter wheat. Plant Dis. 95, (5), 554, 2011. 13.PIRGOZLIEV S. R., EDWARDS S.G., HARE M.C., JENKINSON P. Effect of dose rate of azoxystrobin and metconazole on the development of Fusarium head blight and the accumulation of deoxynivalenol (DON) in wheat grain. Eur. J. Plant Pathol. 108, 469, 2002. 14.DRUVEFORS U.A., PASSOTH V., SCHNURER J. Nutrient Effects on Biocontrol of Penicillium roqueforti by Pichia anomala J121 during airtight storage of wheat. Appl. Environ. Microb. 71, (4), 1865, 2005. 15.WISNIEWSKA H., BASINSKI T., CHELKOWSKI J., PERKOWSKI J. Fusarium sporotrichioides Sherb. Toxins evaluated in cereal grain with Trichoderma harzianum. J. Plant Prot Res. 51, (2), 134, 2011. 16.KHAN M. R., DOOHAN F. Bacterium-mediated control of Fusarium head blight disease of wheat and barley and associated mycotoxin contamination of grain. Biol. Control 48, 42, 2009. 17.KHAN M. R., DOOHAN F. Comparison of the efficacy of chitosan with that of a fluorescent pseudomonad for the control Fusarium head blight disease of cereals and associated mycotoxin contamination of grain. Biol. Control 48, 48, 2009. 18.ZHANG S. D., SCHISLER A., BOEHM M. J., SLININGER P. J. Utilization of chemical inducers of resistance and Cryptococcus flavescens OH 182.9 to reduce Fusarium head blight under greenhouse conditions. Biol. Control 42, 308, 2007. 19.SUNDH I., MELIN P. Safety and regulation of yeasts used for biocontrol or biopreservation in food or feed chain.Antonie van Leeuwenhock 99, 113, 2011. 20.NOUROZIAN J., ETEBARIAN H. R., KHODAKARAMIAN G. Biological control of Fusarium graminearum on wheat by antagonistic bacteria. J. Sci. Technol. 28, (Suppl.l),29,2006. 21.WACHOWSKA U., IRZYKOWSKIW, JE_DRYCZKA M. STASIULEWICZ-PALUCH A. D., GLOWACKA K., Biological control of winter wheat pathogens with the use of antagonistic Sphingomonas bacteria under greenhouse conditions. Biocontrol Sci. Techn. 2013 [In Press]. 22.WACHOWSKA U. Activity of fungicides against epiphytic yeast-like fungi of winter wheat. Pol. J. Environ. Stud. 18, (6), 1169,2009. 23.MARTIN J.P. Use of acid, rose Bengal and streptomycin in the plate method for estimating soil fungi. Soil Sci. 38, 215, 1950. 24.KING E., WARD M. K., RANEY D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein. J. Lab. Clin. Med. 44,301,1954. 25.LESLIE J.F., SUMMERRELL B. A. The Fusarium laboratory manual. Blackwell Publishing, Oxford, 388, 2006. 26.VERO S., P. MONDINO, J. BURGUENT), M. SOUBES, WISNIEWSKIM. Characterization of biocontrol activity of two yeast strains from Uruguay against blue mold of apple. Postharvest Biol. Tec. 26, 91, 2002. 27.DUNLAP C. A., SCHISLER D. A., PRICE N. P., VAUGHN F. Cyclic lipopeptide profile of three Bacillus subtilis strains; antagonists of Fusarium head blight. J. Microbiol. 49, (4), 603,2011. 28.PALAZZINI J.M., RAMIREZ M.L., TORRES A.M., CHULZE S.N. Potential biocontrol agents for Fusarium Head Blight and deoxynivalenol production in wheat. Crop Prot. 26, 1702, 2011. 29.INNEREBNER G., KNIEF C, VORHOLT J.A. Sphingomonas strains protect Arabidopsis thaliana against leaf-pathogenic Pseudomonas syringae in a controlled model system. Appl. Environ. Microb. 77, (10), 3202, 2011. 30.VAN DER ENT S., VAN WEES S. C. M., PIETERSE C. M. J. Jasmonate signaling in plant interactions with resistance inducing beneficial microbes. Phytochemistry 70, 1581, 2009. 31.VAN DER ENT S., VERHAGEN B. W M., VANDOORN R., BARKER D., VERLAAN M. G., PEL M. J. C, JOOSTEN R. G., PROVEBIERS M. C. G., VAN LOON L. C, TON J., PIETERSE C. M. J. MY B72 is required in early signaling steps of rhizobacteria-induced systemic tesisance in Arabidopsis. Plant Physiol. 146, 1293, 2008. 32.VAN WEES S. C. M., DE SWART E. A. M., VAN PELT J. A., VAN LOON L. C, PIETERSE C. M. J. Enhancement of induced disease resistance by simultaneous activation of salicylate- and jasmonate- dependent defense pathways in Arabidopsis thaliana. P. Natl. Acad. Sci. 97, 8711,2000. 33.VERHAGEN B.W.M., GLAZEBROOK J., ZHU T., CHANG H-S., VAN LOON L.C., PIETERSE C.M.J. The transcriptome of rhizobacteriainduced systemic resistance in Arabidopsis. Mol. Plant. Microbe In. 17, 895, 2004. 34.BALIUKONIENE V., BAKUTIS Â., JANUSKEVICIENE G., MISEIKINE R. Fungal contamination and Fusarium mycotoxins in cereals grown in different tillage system. J. Anim. Feed Sci. 20, 637, 2011. 35.PIETERSE Ñ M. J., VAN LOON L. Ñ NPR1: the spider in the web of induced resistance signaling pathways. Curr. Opin. Plant. Biol. 7, 456, 2004. 36.PIETERSE Ñ M. J., VAN DER ENT S., VAN WEES S.C.M. Plant immune responses triggered by beneficial microbes. Curr. Opin. Plant. Biol. 11, 443, 2008. 37.GOMEZ- GOMEZ L., BOLLER T. FLS2: A LRR receptor-like kinase involved in recognition of the flagellin elicitor in Arabidopsis. Mol. Cell 5,1,2000. 38.LI J., BRADER G., PALVA E. T. TheWRKY70 transcription factor: a node of convergence for jasmonatemediated and salicylate-mediated signals in plant defense. Plant Cell 16, 319, 2004. 39.PETTI C, KHAN M., DOOHAN F. Lipid transfer proteins and protease inhibitors as key factors in the priming of barley responses to Fusarium head blight disease by a biocontrol strain of Pseudomonas fluorescens. Funct Integr GenomicslO, 619, 2010.