Материал и окраска препаратов при криптоспоридиозе
реклама
Р.П. Савченко Приготовление препаратов для цитологических, гематологических, бактериологических и паразитологических исследований Оглавление: ПРЕДИСЛОВИЕ ............................................................................................................ 4 БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ....... 4 ПОДГОТОВКА, МОКРОТЫ К ЦИТОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ ................ 7 ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖИМОГО БРОНХОВ ......................................................... 7 ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЛИЗИСТОЙ ПИЩЕВОДА ........................ 9 ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ СО СЛИЗИСТОЙ ЖЕЛУДКА ................................ 9 ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ СО СЛИЗИСТОЙ ПРЯМОЙ КИШКИ И НИЖНИХ ОТДЕЛОВ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ........................................................................ 10 ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫДЕЛЕНИЙ ЖЕНСКИХ ПОЛОВЫХ ОРГАНОВ ..................................................................................................................... 10 ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ИЗ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ................................... 12 ИССЛЕДОВАНИЕ ПУНКТАТА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ........................................ 13 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ .................................... 13 Подготовка предметных стекол .............................................................................. 13 Приготовление препаратов крови .......................................................................... 14 Очистка кожи............................................................................................................ 14 Приготовление тонкого мазка ................................................................................ 14 Определение реакции воды .................................................................................... 15 ОКРАСКА МАЗКОВ ..................................................................................................... 18 Фиксация мазков парами формалина (по П. Ф. Соткину) .................................... 19 Упрощенный метод окраски мазков гематоксилин - эозином (модифицирован в МНИОИ им. П.А. Герцена)....................................................................................... 20 Приготовление краски гематоксилин по Карачи ................................................... 20 Окраска по Романовскому-Гимзе .......................................................................... 20 Окраска по Паппенгейму ........................................................................................ 22 Окраска по Лейшману ............................................................................................. 23 Окраска по Райту ..................................................................................................... 23 Окраска по Н. Г. Алексееву (Экспресс-метод) ...................................................... 24 Окраска по Филипсону ............................................................................................ 24 Окраска по С.Л.Эpлиху ........................................................................................... 24 ВРЕМЯ ОКРАСКИ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ. ПРЕПАРАТОВ ПО ПАППЕНГЕИМУКРКЖОВУ И ЛЕЙШМАНУ........................................................................................ 25 Окраска по Цилю-Нильсену .................................................................................... 26 Окраска по Трапу ..................................................................................................... 27 Полихромный метод окраски влагалищных мазков (по М.Г. Арсеньевой) ......... 28 Окраска красным конго (конгорот) ......................................................................... 28 Окраска по Моури .................................................................................................... 29 Окраска ретикулоцитов и тромбоцитов ................................................................. 31 ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .................................................. 32 Диагностическое значение цитохимических окрасок ........................................... 32 Окраска на гликоген ................................................................................................ 33 Определение концентрации гликогена в лейкоцитах ........................................... 34 Определение липидов в лейкоцитах (по Г. Роскину, Д. Лесиной) ....................... 36 Определение пероксидазы в лейкоцитах (метод Грехема-Кнолля).................... 38 Определение активности пероксидазы ................................................................. 38 Определение неспецифической эстеразы ............................................................ 39 Определение кислой альфа-нафтилацетатэстеразы ........................................... 40 Определение активности кислой фостатазы ........................................................ 41 Определение активности щелочной фосфатазы. ................................................. 42 Метод выявления ядрышек в лимфоцитах ............................................................ 43 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕТАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА (HbF) В МАЗКАХ КРОВИ (метод Бетке и Клейхауэра в модификации Е.Г. Исаевой и А.Н. Королевой) .... 43 ОКРАСКА НА СИДЕРОБЛАСТЫ И СИДЕРОЦИТЫ по методу Грюйеберга. ..... 44 Проба на серповидность эритроцитов ................................................................... 46 Цитохимический метод определения нестабильного гемоглобина ..................... 46 ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛОВОГО ХРОМАТИНА........................................................... 47 Метод определения полового хроматина в соскобах слизистых оболочек (Ацетат-орсеиновый метод) .................................................................................... 50 Окраска полового хроматина по методу Докумова .............................................. 51 Выявление полового хроматина в мазках крови................................................... 52 МЕТОДЫ ОКРАСКИ ПРИ ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ .............................. 53 Техника окраски препаратов крови больного с малярией ................................... 53 Особенности окраски мазков при малярии ........................................................... 53 Приготовление толстой капли ................................................................................ 54 Способ Машковского ............................................................................................... 57 Способ Шуренковой ................................................................................................. 58 МАТЕРИАЛ И ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПРИ КРИПТОСПОРИДИО3Е .................. 58 Сбор материала ....................................................................................................... 58 Окрашивание карболовым фуксином по Цилю-Нильсену ................................... 59 Окрашивание сафранином по Кестеру .................................................................. 60 Окрашивание азур-эозином по Романовскому - Гимзе ........................................ 60 Метод флюоресцентного окрашивания ................................................................. 61 МАТЕРИАЛ И ВИДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ ПРИ ПНЕВМОЦИСТОЗЕ ...................... 61 Сбор материала ....................................................................................................... 61 Приготовление мазка .............................................................................................. 62 Общий вид окрашенных препаратов под микроскопом ....................................... 62 Основные методы окраски ...................................................................................... 63 Окрашивание азуром - эозином по Романовскому-Гимзе ................................... 63 Окрашивание кристаллическим фиолетовым ....................................................... 63 Окраска по Шиффу .................................................................................................. 64 Окрашивание акридином оранжевым .................................................................... 65 Окраска по Гомори-Грохотту .................................................................................. 66 МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ ВКЛЮЧЕНИЙ Chlamidia trachomatis В ПАТОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ ............................................................................ 67 ПРЕДИСЛОВИЕ Микроскопия - обязательный, метод всякого цитологического, бактериологического или паразитарного исследования. С помощью световой микроскопии выявляют в первичном материале форму, величину соматических, кроветворных или бактериальных клеток свойственное им расположение образовывать (соединение), капсулу, споры, способность жгутики, воспринимать формировать окраску, включения и зернистость. Цитохимическими методами можно установить изменения в жировом, углеводном и белковом обмене клеток. Иногда эти признаки весьма характерны и имеют важное, значение для идентификации клеток, бактерий, заболеваний. Поэтому важным является то, как правильно собран биологический материал для микроскопии, каким методом он фиксирован и окрашен на предметном стекле. Для специалистов клинической лабораторной диагностики в повседневной работе необходимо знать современные подходы к взятию биологического материала, методы окраски мазков, экспресс-методы для диагностики онкологических, гематологических, бактериальных и паразитологических болезней. В данном методическом пособии приводятся сведения, которые могут быть использованы в практической работе. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Эксфолиативная цитология Материалом для цитологического исследование может служить определяемое с инфильтрованной, воспаленной, гранулирующей, изъязвленной поверхности или макроскопически неизмененной слизистой оболочки, налеты, гной, кусочки ткани, тканевая жидкость, аспирированная из глубины ткани, а также смывы и отпечатки, с раневой поверхности во время операции. Для исследования могут, быть использованы свободное отторгнувшиеся ткани, так называемый эксфолиативный материал, или полученные в результате того или иного специального воздействия (пунктаты, соскобы). Участки, с которых берут материалы предварительно обрабатываются. Препараты для цитологического исследования можно получить указанными методами. Метод отпечатков. Изготовление цитологических препаратов заключается в непосредственном прикладывании к месту исследования, к слизистой оболочки, изъязвленным поверхностям предметного стекла или прозрачной пластмассовой пластинки. На стекле при этом остается отпечаток с соответствующего участка, содержащий то или иное количество клеточных элементов и слизистого отделяемого. Метод перепечатков. При этом методе материал берут из участков поражения с помощью ватного тампона, зонда или кисточки, которыми делаются отпечатки на предметном стекле, аналогичные методу отпечатков. Метод соскоба. Соскоб берут маленькими ложечками, типа ложки Фолькмана, диаметром 2-4 мм. с несколько затупленными краями. Соскоб производят с некоторым нажимом до получения легкого эрозирования поверхности. Интенсивность этого нажима должна варьировать в зависимости от консистенции ткани обследуемого участка: для получения соскоба с рыхлой или изъязвленной поверхности давления почти не требуется, и наоборот, при плотных; покрытых неизменной слизистой оболочкой, опухолях и инфильтратах нажим должен быть значительным. Критерием правильности производства соскоба является наличие достаточного количества материалов в углублении ложки при отсутствии, как правило, кровотечения в месте соскоба. Полученный материал переносят с ложки на предметное стекло с ее тыльной стороны и смывают каплей изотонического раствора поваренной соли. Следует иметь ввиду, что при использовании метода соскоба для проведения может быть получен материал только с поверхностных и близких к поверхности слоев ткани. Соскоб нужно производить осторожно. Метод пункции. Этот метод дает возможность получить материал из глубины слоев, нередко непосредственно из центра патологического очага. Если прокол производят через кожу, то ее предварительно протирают спиртом и йодом. Если в патологическом очаге имеется жидкое содержание, то оно поступает в шприц. Если же в очаге жидкого секрета нет, то в просвет иглы втягивают тканевые элементы. В этом случае в шприц ничего не попадает, он должен быть снят с иглы, которая остается в ткани. После этого поршень ставится в исходное положение, шприц снимают с иглы. Аспирация повторяется 3-4 раза и чередуется с ретацией иглы и продвижением ее вперед. При ретации острый скос иглы отделяет тканевые частицы; последующая аспирация засасывает их в просвет иглы. Продвижение иглы позволит получить ткань из различных участков очага опухоли, в которых морфология клеточных элементов может варьировать. При прекращении аспирации иглу после снятия шприца извлекают из ткани. При этом, во избежании потери материала следует прикрывать просвет канюли пальцем. Содержимое иглы выдувают (повторно) при помощи шприца на предметное стекло и тщательно просматривают. Обнаруженные мельчайшие беловатые частички переносят иглой на другое стекло. Эти препараты являются наиболее ценными, но исследованию должен подвергать весь полученный материал. Лучше доставлять шприц с иглой в лабораторию. Метод отпечатков кусочками ткани. Весьма ценный диагностический материал может быть получен посредством отпечатков, приготовленных кусочками ткани, удаленными для гистологического исследования или иссеченными при операции. Делая отпечатки с разных поверхностей удаленных кусочков, можно получать представление о клеточном составе как поверхностных, так и более глубоких отделов ткани. Перед тем как делать отпечатки, с кусочков ткани следует удалить кровь путем прикладывания их к чистой фильтровальной бумаги или марлевой салфетки. В тех случаях, когда плотная консистенция ткани (костная, хрящевая, фибринозная) не позволяет сделать отпечатки, следует производить соскоб с удаленного кусочка, он делается ложкой Фолькмана. Для цитологического анализа применяются обезжиренные стекла. На обезжиренных, а затем высушенных стеклах материал размазывается равномерно, что облегчает исследование. ПОДГОТОВКА, МОКРОТЫ К ЦИТОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ Мокроту собирают по мере выделения после тщательной обработки (полоскания полости рта). Мокрота должна быть откашлянута и сразу доставлена в лабораторию. В отдельных случаях врач должен заставить, больного покашлять и собрать мокроту. После специального анализа требуется материал направить на исследование повторно и так не менее 5 раз. С момента получения и до исследования мокрота должна стоять не более 4 часов или храниться в холодильнике. ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖИМОГО БРОНХОВ Исследуемым материалом служат кусочки ткани, слизистое отделяемое, слизь, оставшаяся на бронхоскопе. Смыв из бронхов можно получить при проведении больному бронхоскопии. Основные этапы введения бронхоскопа в трахею при помощи ларингоскопа. В начале с помощью ларингоскопа язык отклоняется кпереди. Затем кпереди оттесняется надгортанник и перед глазом исследователя появляются голосовые связки и голосовая щель. Под контролем зрения тубус бронхоскопа проводят через голосовую щель в трахею. Ларингоскоп удаляют. Следует помнить, что введение бронхоскопа и его продвижение в трахею, к бронхам необходимо осуществлять не при помощи бронхоскопа, используемого в качестве рычага, а приданием соответствующего положения головы и шеи больного. После того, как бронхоскоп будет установлен в нужной позиции, можно пользоваться оптическими приспособлениями. При осмотре всех участков бронхиального дерева необходимо пользоваться бронхоскопической лупой. При осмотре устьев долевых сегментарных и субсегментных бронхов работают оптическим бронхоскопом с прямой и боковой оптикой. Отечественный оптический бронхоскоп позволяет менять угол зрения во время осмотра. Следует помнить, что использовать оптический бронхоскоп без бронхоскопической, трубки нельзя. Бронхоскопической трубкой и бронхоскопом можно пользоваться только под контролем глаза. Содержимое бронхов может быть получено аспирацией с помощью отсасывающего приспособления при проведении больному бронхоскопии. Большее удобство для • цитологического исследования представляется при получении содержимого бронхов приемом смыва. Для удачного проведения смыва требуется придать больному соответствующее положение, которое диктуется местом располодения опухоли в бронхиальном дереве, установленным рентгенологическим исследованием. Смыв доставляется срочно или не позже, чем через 4 часа в лабораторию в пробирках. Удачно проведенный смыв содержимого бронхов представляет собой бесцветную или окрашенную кровью жидкость, на поверхности которой плавает смесь слизи или гноя, заполненная множеством пузырьков воздуха. Остальная жидкость водянистая и представляет физиологический раствор с примесью взвешенных в нем или осевших на дне хлопьев слизи или гноя. Если перед проведением смыва бронхиальный путь не был освобожден от содержащейся в ней мокроты путем откашливания или аспирации, то в смыв поступает мокрота ничем не отличающаяся от той, которая обычно отхаркивается больным. Если на поверхности смывной жидкости слизисто-пенистый слой отсутствует, следует предположить, что смыв произведен неудачно и его исследование не принесет желаемого результата. Наиболее богатым содержанием клеток опухоли является пенистый слой смыва. Отобранный, материал идет для изготовления цитологических препаратов. ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЛИЗИСТОЙ ПИЩЕВОДА Материалом служат кусочки ткани, слизь. Отсос из пищевода производится натощак при помощи резинового зонда, детям применяется зонд с малым диаметром и с двумя дополнительными отверстиями. Зонд осторожно вводят в пищевод до входа в желудок, затем наружный конец надевается на шприц Жане, медленно с остановками вынимают зонд и одновременно отсасывается слизь со стенок пищевода. Вынутый зонд помещают в белую кювету и при помощи шприца; заполненного физиологическим раствором, промывают снаружи и изнутри. Из смыва выбирают тканевые клочки, слизистые прожилки и помещают на предметное стекло. Затем готовят нативные и окрашенные препараты. Необходимо делать и окрашивать до 20 препаратов. Оставшуюся в кювете жидкость можно отцентрифугировать и часть препаратов приготовить из осадка. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ СО СЛИЗИСТОЙ ЖЕЛУДКА Материал получают при гастроскопии для гистологического исследования в виде отпечатков. Смывы со слизистой желудка получают следующим образом. Накануне перед сном больному делают тщательное промывание желудка для удаления остатков пищи. В день, исследования необходимо разъяснить больному, чтобы он не глотал слюну и мокроту до окончания взятия промывных вод. Утром натощак в желудок вводят толстый зонд, лучше вводить детский. За 15 минут до введения зонда рекомендуется ввести больному подкожно 1 мл 0,1% раствора сернокислого атропина, если нет противопоказаний, для подавления секреции в ответ на механическое раздражение. Наружный конец зонда соединяют со шприцем Жане и отсасывают все содержимое желудка. Весь отсос сливают в банку N1 с надписью "содержимое натощак". Затем через зонд тем же шприцем вводят 250 мл теплого физиологического раствора. Движением поршня несколько раз всасывают жидкость и возвращают ее обратно, а затем отсасывают все количество и помещают в банку N2 с надписью "первая порция промывных вод". После этого вновь вводят 259 мл физиологического раствора и повторяют процедуру. Отсосав жидкость помещают ее в третью банку с надписью "вторая порция промывных вод". Все три порции должны отстаиваться в течение 30-50 минут. Надосадочную жидкость сливают, осадок сливают в чашку Петри, вылавливают слизь и тканевые клочки и готовят нативные и окрашенные препараты. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ СО СЛИЗИСТОЙ ПРЯМОЙ КИШКИ И НИЖНИХ ОТДЕЛОВ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА Для цитологического исследования может быть использован материал, полученный при ректоскопии, а также слизь, оставшаяся на ректоскопе и на перчатке после пальцевого обследования кишки. Если опухоль расположена вблизи заднего прохода, то материал можно взять тампоном, непосредственно с места поражения; при отдаленном расположении опухоли (ободочная кишка, нисходящий отдел толстого кишечника) необходимо провести смыв и использовать его для соответствующего анализа. Смыв делается подогретым физиологическим раствором с применением сифонной клизмы. Необходимое количество жидкости - 500-800мл. Промывные воды собирают в банку и доставляют в лабораторию. Для приготовления препаратов служит осадок. Для сбора отделяемого прямой кишки могут служить различные ирригационныеаспирационные приборы. ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫДЕЛЕНИЙ ЖЕНСКИХ ПОЛОВЫХ ОРГАНОВ Перед взятием мазка гинекологическое исследование проводить не следует, а также не следует высушивать и промывать влагалище. Пациенты в течение 24 часов не должны иметь полового контакта и не проводить орошение влагалища, т.к. при этом нарушается его клеточный состав. Материал получают из полости матки, шейки матки и влагалища специальными инструментами. В зависимости от локализации процесса он может быть получен в виде отсоса, соскоба или отпечатка. Отделяемое заднебокового свода влагалища отсасывают пипеткой с резиновым баллончиком и выдувают на предметное стекло. Соскоб с поверхности влагалищного отдела шейки матки берется закругленным концом шпателя, которым делают легкое поскабливание пораженного участка. Отделяемое цервикального канала и полости матки получают путем отсасывания стеклянной пипеткой с баллоном или специальным шприцем Брауна. Из полученного материала, готовят мазки и красят. Для взятия материала применяется деревянная или металлическая палочка с накрученным на нее тампоном или штапелем с углублением на одном из концов. При массовых исследованиях можно пользоваться пипеткой. Диагностические мазки для цитологического исследования берутся: а) из наружного зева канала шейки матки, б) с влагалищной поверхности шейки матки, в) из заднебокового свода влагалища. Топографические мазки берутся: а) с наружного устья канала шейки матки, б) с влагалищной поверхности шейки матки соответствующими показаниями часовой стрелки, в) с периферических частей влагалищной поверхности шейки матки. Из каждого отдела материал берется отдельной палочкой и размазывается тонким слоем на обезжиренном и просушенном стекле. Необходимо помнить, что при взятии материала с влагалищной поверхности шейки матки материал сконцентрирован на верхушке ватного Тампона, из канала шейки матки - на боковых поверхностях тампона. Материал наносится на заранее приготовленные и подписанные предметные стекла. Предметные стекла с влажными мазками помещают в смесь Никифорова, являющуюся фиксатором. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ИЗ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ Для цитологического исследования можно использовать мочу, отсос и смыв из мочевого пузыря. Свежевыделенная моча, собранная в чистую сухую банку, отстаивается около часа и доставляется в лабораторию, где осадок собирают со дна пипеткой в центрифужную пробирку и центрифугируют. Сливают надосадочную жидкость, а на образовавшийся осадок наливают новую порцию мочи. Снова центрифугируют. Так повторяют 3-4 раза. Из полученного обогащенного осадка готовят препараты нативные и препараты для окраски. Можно после последнего центрифугирования к 3,-4 мл осадка прибавить 1 мл кровяной сыворотки, еще раз отцентрифугировать, после этого сделать нативные препараты. Отсос из мочевого пузыря получают следующим образом: больной должен опорожнить мочевой пузырь. После этого вводят стерильный резиновый катетор, в котором предварительно сделаны два дополнительных отверстия. Катетор смазывают перед введением, глицерином (вазелиновое масло недопустимо), наружный конец катетора соединяют с 20 г шприцем или шприцем Жане и сильным движением поршня производят отсасывание. Катетор вынимают, осматривают снаружи, снимают с него видимые частицы слизистой на предметное стекло. Затем конец катетора опускают в банку или чашку Петри, нажимают на поршень и выталкивают в сосуд все содержимое катетора. Полученный материал доставляют в лабораторию. Для получения слизи мочевого пузыря его сначала промывают от слизи и крови, затем в него вводят через катетор раствор спирта и 81 мл 1% раствора новокаина, раствор должен быть стерильный (для увеличения эксфолиации клеток). Больному предлагают, походить 10 мин, удерживая раствор. После этого больной выделяет мочу, Которую доставляют в лабораторию, где моча центрифугируется при 1500 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готовят нативные препараты для окрашивания. ИССЛЕДОВАНИЕ ПУНКТАТА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Для распознавания различных поражений щитовидной железы используется диагностическая пункция. Полученный пунктат может быть скудным или обильным. Готовятся мазки подобно мазкам крови на предметном стекле. При получении буроватой, буровато-кровянистой или желтоватой жидкости не следует применять цитрат. Если пункат содержит большое количество крови, то целесообразно добавить 2-3 капли лимоннокислого натрия на 1 мл. пунктата, отцентрифугировать 5-7 минут, из всего осадка приготовить мазки, окрашивать. Для цитологических препаратов пунктатов и соскобов используют любой метод окраски Паппенгейма, Романовского, Лейшмана. При выраженном распаде опухоли (очаг некроза) или когда возникает подозрение на наличие плоскоклеточного рака следует окрасить мазки гематоксилин-эозином. Если имеется один препарат, нужно первоначально окрасить его азур-эозиновой смесью, а затем перекрасить гематоксилин-эозином, предварительно удалив первую краску солянокислым спиртом. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Подготовка предметных стекол Предметные стекла, не бывшие в употреблении, моют в мыльном растворе, после чего помещают в сосуд с водопроводной водой, которую меняют 6-7 раз. Затем стекла прополаскивают дистиллированной водой, вытирают чистой хлопчатобумажной тканью и помещают в смесь Никифорова. Для приготовления смеси Никифорова берут равные количества этилового спирта-ректификата и эфира из расчета 1 мл спирта на одно стекло. В смеси Никифорова стекла могут оставаться, до употребления. Можно обезжиренные стекла извлечь из спирт-эфирной смеси через сутки, высушить хлопчатобумажной тканью и завернуть в чистую бумагу по 30-50 штук. Стекла, бывшие в употреблений, требуют более тщательной обработки: если на стеклах имеется иммерсионное масло, его следует удалить бензолом или другим растворителем жира (ксилол, толуол); после этого стекла заливают мыльным раствором и каждое стекло отмывают тряпочкой. Дальнейшая обработка сходна с обработкой стекол, не бывших в употреблении. Во время всех манипуляций с предметными стеклами их нужно брать так, чтобы не касаться пальцами поверхности стекол. Приготовление препаратов крови Приготовление препаратов крови складывается из следующих этапов: - очистка кожи; - прокол кожи; - распределение крови по стеклу; - высушивание препарата; - маркировка препарата. Очистка кожи Обычно кровь - берут из третьего или четвертого пальца левой руки. Можно брать из мочка уха, а у грудные детей из большого пальца ноги или пятки. Очень важно, чтобы кожа в месте прокола была чистой, т.к. попавшие в препарат микроорганизмы могут привести к диагностическим ошибкам. Грязные руки моют мылом. Кожу в месте укола тщательно протирают 70% этиловым спиртом. Первую каплю крови, выделившуюся после прокола, удаляют сухой ватой. При этом удаляют остатки алкоголя, который может денатурировать белки крови. Приготовление тонкого мазка Для приготовления тонкого мазка кроме предметных стекол необходимо иметь шлифовальное стекло, ширина которого должна быть меньше ширины предметного. Если предметное и шлифовальное стекла равны по ширине, то боковые края мазка окажутся на самом крае предметного стекла и будут плохо крипсированы. Уголок шлифовального стекла можно отломить ножницами или напильником под струей воды. На чистое предметное стекло с правой стороны, отступив от края на 11,5 см, наносят маленькую каплю крови. Стекло кладут на горизонтальную поверхность и фиксируют его левой рукой. В правую руку берут шлифовальное стекло, опускают его в каплю крови таким образом, чтобы кровь распределилась ровной полоской между краем шлифовального стекла и поверхностью предметного. Затем легким равномерным движением вдоль стекла распределяют кровь по предметному стеклу. При приготовлении мазка большое значение имеет угол наклона шлифовального стекла. Нормальной толщины мазок получается при наклоне стекла под углом 30-35. Если угол наклона больше 45, мазок будет коротким и толстым. Если шлифовальное стекло наклонить до 20- 25, то получится очень длинный мазок до самого края предметного стекла. Исследование таких мазков затруднено. Манипуляции должны совершаться быстро. Предметные стекла надо брать только за края во избежании загрязнения поверхности. Правильно сделанный мазок должен быть равномерно тонким с бахромкой на конце, через него можно прочитать печатный лист. Все его участки (начало, конец, боковые края) должны быть доступны микроскопическому исследованию. В правильно приготовленном мазке эритроциты должны иметь круглую форму, ровные контуры и лежать одни около другого. Тонкий мазок высыхает очень быстро. После высыхания его маркируют. С этой целью лучше использовать простой карандаш. После маркировки мазок фиксируют. После фиксации мазок высушивают и окрашивают: Определение реакции воды Результаты окрашивания препаратов в значительной степени определяются качеством краски и реакцией воды, применяемой для ее разведения. Вода, которую используют для приготовления водного рабочего раствора краски, должна иметь нейтральную реакцию рН 7,0-7,2. Свежеприготовленная дистиллированная вода имеет реакцию, близкую к нейтральной. Однако, при стоянии вода поглощает из воздуха углекислоту и становится кислой. Лучше пользоваться свежеприготовленной дистиллированной водой, но можно употреблять водопроводную, чистую дождевую или речную воду, предварительно профильтрованную. Существует несколько методов определения, реакции воды: 1. Ориентировочное представление о реакции воды можно получить после пробного окрашивания мазков и толстых капель крови. Мазки и толстые капли, окрашенные краской, разведенной водой, имеющей нейтральную или близкую к ней реакцию, примут светло-сиреневую окраску. Ядра малярийных паразитов, тромбоцитов, зернистость в эритроцитах в таких препаратах выявляется отчетливо. Если препараты после окрашивания имеют ярко-розовый цвет, значит вода, использованная для разведения краски, имела. рН ниже 7,9. В таком препарате форменные элементы крови окрашены плохо, ядра малярийных паразитов бледно-розовые или совсем не видны, зернистость в пораженных эритроцитах совсем не выявляется. Если вода имела рН выше 7,2, мазок будет иметь серовато-зеленый или голубой цвет. 2. Кроме пробной окраски препаратов крови можно воспользоваться пробой с гематоксилином. Для этого в химическую пробирку наливают испытуемую воду и в нее добавляют 3-4 капли 10% спиртового раствора гематоксилина или несколько кристалликов сухого гематоксилина. Вода, имеющая нейтральную или близкую к ней реакцию (рН 7,0 или 7,2), после прибавления гематоксилина примет слабо-фиолетовый цвет. Вода кислой реакции от прибавления гематоксилина лишь слегка пожелтеет, т.е. примет окраску гематокислина. Щелочная вода (рН выше 7,2) от гематоксилина сразу станет интенсивно красно-фиолетового цвета. 3. Более точное представление о реакции воды можно получить с помощью индикаторной бумажки, определением рН колориметрическим методом в приборе Михаэлиса или на рН-метре. Если установлено, что вода имеет неподходящую реакцию для окраски препаратов крови, ее можно изменить, добавляя по каплям к кислой воде 1% раствор щелочи или к щелочной воде 1% раствор кислоты. Следует отметить, что этот метод не всегда дает стандартные результаты. Устойчивые результаты окраски препаратов можно получить, используя для разведения краски, получения рабочего раствора, буферную воду. Для ее приготовления нужно иметь два основных раствора фосфатных солей: 1. Na2HPО4 безводный - 9,5 г на 1 л дистиллированной воды или Na2HP04 кристаллический - 23,7 г на 1 л дистиллированной воды. 2. КН2Р04 - 9,07 г на 1 л дистиллированной воды. Так как для приготовления буферной смеси кислого фосфата требуется меньше, чем основного, его нужно готовить в соответственно меньших количествах. Приготовленные растворы хранят отдельно. По мере надобности их используют для приготовления буферной воды с нужным значением рН. Чтобы получить 1 литр забуференной воды основные буферные растворы добавляют в следующих количествах: Необходимая рН 6,6 6,8 7,0 7,2 7,3 Na2HP04, мл 37 49 63 73 81 КН2Р04, мл 63 51 37 27 19 Дистиллированная вода, мл 900 900 900 900 900 Так как в этих растворах размножаются бактерии и грибки, то при приготовлении их надо соблюдать стерильность. Хранить растворы следует в хорошо закупоренных склянках, лучше на холоде, перед употреблением следует их фильтровать. Если, нет возможности хранить основные растворы (походная лаборатория) можно забуференнуй воду готовить сразу. К одному литру воды, прозрачной, без взвешенных частиц, добавляют заранее сделанные навески фосфатных солей, смешанных в следующих соотношениях: Na 2HP04 - 0,67, КН2Р04 - 0,27. Смеси фосфатных солей хранятся в хорошо закупоренных склянках и по мере необходимости используются. ОКРАСКА МАЗКОВ Для окраски мазков и приготовления цитологических препаратов и препаратов периферической крови, костного мозга, бактериологических используют анилиновые красители, которые по разному воспринимаются элементами клеток. Наиболее распространенными красителями являются азур, эозин, метиленовый синий, гематоксилин. Смеси этих красителей обеспечивают оптимальную окраску ядра и цитоплазмы- Все красители удобно разделить на основные и кислые. К основным относят азур и гематоксилин, к кислым - эозин. Различные сочетания красителей обеспечивают большое разнообразие методов. Принцип любого метода окраски мазков крови или цитологических препаратов заключает в себе несколько этапов: 1. Фиксацию элементов к стеклу. 2. Окраску элементов биологического материала. Фиксация мазков предусматривает остановку биологических процессов. Ее можно достигнуть, вызвав денатурацию белка химическим путем или тепловым. Очень часто для предварительной фиксации препаратов из биологического материала используют тепловую фиксацию над пламенем горелки. Из химических фиксаторов в лабораторной практике используют следующие препараты: 1. Метиловый-спирт 5 мин 2. Денатурированный спирт 30 мин 3. Этиловый спирт 30 мин 4. Смесь Никифорова (спирт/эфир) 30 мин 5. Ацетон 6 мин 6. Хлороформ 5-6 сек 7. 1% формалин 1 мин 8. Фенол Лучшим фиксатором является абсолютный метиловый спирт. Фиксация мазков парами формалина (по П. Ф. Соткину) В эксикатор помещают стеклянный мостик. На дно эксикатора наливают раствор фенола (90 частей фенола, 10 частей воды). Мазки помещают на мостик, мазком вниз. Закрывают крышку эксикатора и хорошо притирают. Мазки в эксикаторе выдерживают строго определенное время: при +16. - +18 С - 20 мин при +19 - +21 С - 10 мин при +22 - +24 С - 6 мин при +25 - +27 С - 3 мин при +28 г +30 С - 0,5-1 мин Термометр помещают рядом с эксикатором. После фиксации мазки выветривают при температуре лаборатории в течение времени фиксации. Очень хорошо фиксируются мазки следующим раствором: 5 г сернокислого цинка, 5 г поваренной соли и воды до 100 мл. Время фиксации этим раствором 2-3 мин. После фиксации мазки сушат на воздухе, затем окрашивают любым принятым в лаборатории методом. Для окраски мазков используют азур-эозиновые смеси, гематоксилиэозиновые, азур-метиленовые смеси. Все предложенные методы окраски мазков основаны на химическом сродстве различных частей клетки (ядра, цитоплазмы, нуклеолы, зернистости) к определенным анилиновым красителям. Так, ядра клеток, богатые нуклепротеидами, воспринимают основные красители: азур 1, азур 2, метиленовый синий, а цитоплазма клеток - эозин. Упрощенный метод окраски мазков гематоксилин - эозином (модифицирован в МНИОИ им. П.А. Герцена) Схема окраски: 1. Фиксация в смеси равных объемных частей- эфира и 96% этилового спирта в течение 7-10 мин. 2. Окраска в гематоксилине Карачи в течение 5 мин. 3. Промывка проточной водопроводной водой 1-2 мин. 4. Окраска 0,3% спиртовым раствором желтоватого эозина в течение 1 мин. 5. Промывка проточной водой 1-2 мин. 6. Высушивание. Приготовление краски гематоксилин по Карачи Схема окраски: Растворить 50 г алюмокалиевых квасцов KAI(04)2*2(Н20) в 500 мл дистиллированной воды, довести до кипения и всыпать в горячий раствор 1 г гематоксилина, затем добавить 500 мл дистиллированной воды и довести до кипения. Не кипятить. Остудить раствор до комнатной температуры, прибавить 250 мл безводного глицерина и 0,2 г йодноватистого калия (KI03). Завязать сосуд с краской марлей и оставить созревать на свету 5 недель. Затем сосуд с краской закупорить и убрать в темное место. Перед употреблением краску профильтровать, 1-2 раза в неделю, а при необходимости - чаще. Врач-цитолбг микроскопирует отобранные лаборантом мазки из расчета 100-150 мазков за рабочий день. В лабораторий регистрируются только анализы с диагнозами: рак, подозрение на рак, тяжелая дисплазия. Окраска по Романовскому-Гимзе Первый способ окраски из готовой краски Романовского-Гимза. Готовая краска Романовского-Гимза состоит из азура II, эозина, желтого, метилового спирта и глицерина. Каждую вновь полученную краску методом подбора соотношений краски и воды готовят к употреблению: Пример: 1 мл. Н20 + 6 капель краски. Мазки заливает на 20-30-50 мин. 1 мл Н20 + 4 капли краски. Мазки заливают на 20, 30, 40, 60 мин. 1 мл Н20 + 3 капли краски. Мазки заливают, на 20, 30, 40, 50, 60 мин и т.д. Таким образом, подбирают оптимальное время и объем краски, которая будет использоваться. Найденные величины указывают на бутылке реактива. Ход окраски: Краску наливают на нефиксированный мазок на 1-3 мин, затем на мазок по каплям наливают воду с рН 7,0. Воду наливают таким образом, чтобы вода не смешалась с краской и не сливалась с мазка. Эта смесь краски с водой остается на 15-30 мин. Затем мазок смывается водопроводной водой. Мазки высушиваются. Окраска азур-эозином В одну бутылку всыпают 1 г сухой краски азур II (смесь равных частей азур I и метиленовой синьки) и добавляют 1 л дистиллированной воды, в другой бутылке растворяют 1 г эозина водного в 1 л дистиллированной воды. Оба эти раствора красок очень устойчивы при хранении, в темном месте. Для повседневной работы наливают в небольшие бутылочки эти растворы. Для окрашивания мазков крови готовят смесь 0,5 мл азура, 0,5 мл эозина и 3 мл дистиллированной воды; наливают на фиксированный и высушенный мазок на 20-30 мин, после чего смывают и высушивают. Второй способ окраски мазков краской Романовского-Гимза без предварительной фиксации. Окраска проводится в два этапа: 1 этап. Приготовление спиртового раствора красителя, выполняющего роль фиксатора. 3,8 г сухой краски Романовского-Гимза растворить в 250 мл абсолютного спирта этилового или метилового. Раствор поместить в термостат при 37 С на 24 часа, периодически взбалтывая. Затем в краску добавить 250 мл глицерина и поместить в термостат на 3-4 дня. Краску фильтровать и хранить в склянке из темного стекла. Перед окраской мазков приготовленную краску разводят метиловым спиртом в соотношении 1:3 (2 мл краски +6 мл метилового спирта). Можно в Качестве спиртового раствора использовать готовую краску РомановскогоГимза после предварительного титрования. 2 этап. Приготовление водного раствора краски Романовского-Гимза. Этап краски состоит их 2-х растворов: 1 часть: 0,1% раствор азура II (1 г азура II в 1 л воды рН 7,0). Краску после приготовления отфильтровать. 2 часть: 0,1% раствор желтого водорастворимого эозина (1 г эозина растворить в 1 л воды рН 7,0). Краску отфильтровать. Перед употреблением, т.е. в день окраски мазков, готовят смесь этих красок в следующих соотношениях: 9 мл азура II + 8 мл эозина + 17 мл Н20. Иногда соотношения азура и эозина берут иные. Проверка краски: Если ядра лейкоцитов окрашены бледно, добавить больше азура. Если эритроциты имеют синеватый оттенок, то берут больше эозина. Ход окраски: Нефиксированный мазок залить спиртовым раствором краски Ремановского-Гимза на 5 мин, не сливая его на мазок, наносят водный раствор раски на 15 мин. Смывают краску водопроводной водой и сушат мазки. Окраска по Паппенгейму Метод не требует предварительной фиксации, т.к. используется краситель-фиксатор Мэй-Грюнвальда. 1. Приготовление красителя Май-Грюнвальда: 3 г сухой крави МайГрюнвальда (эозин-метйленовый синий) растворить в 1 л метилового спирта. Подогреть до +60,+70 С (не кипятить!). Краску охладить и отфильтровать. 2. Приготовление водного раствора красителя азур-эозина. К 50 мл Н20 рН прибавить 15 мл азура II 0,1% раствор и 10 мл 0,1% раствора эозина. Водный раствор краски можно приготовить из готовой краски Романовского (6 капель краски + 10 мл Н20). Ход окраски: Высушенный, нефиксированный мазок залить на 3 мин красителемфиксатором Май-Грюнвальда. Не сливая краски, на мазок налить равный объем воды на 1 мин. Смыть водой и залить мазок водным раствором азурэозиновой смеси на 15 мин. Так окрашивают мазки ПК и КМ, отпечатки лимфоузлов, опухоли, на 5-7 мин выделения из молочной железы, на 3-5 мин - препараты из выпотных жидкостей. Экспресс - метод по Паппенгейму Мазок нефиксированный залить на 2 мин красителем-фиксатором МайГрюнвальда, смыть водой и на 3 мин залить водным раствором азур-эозина. Окраска по Лейшману Приготовление краски-фиксатора (смесь Лейшмана): 2,5 г краски Лейшмана (эозин-метиленовый синий, сухой) растворить в 1 л метанола. Смесь, стоит 3 дня при периодическом взбалтывании. Водный раствор Романовского готовится из водного азура II и эозина. Окраска препарата: Нефиксированные мазки залить на 4-5 мин 0,25% раствором краски Лейшмана, смыть водопроводной водой и залить водным раствором краски Романовского на 15-20 мин. Высушить. Смотреть с иммерсией. Окраска по Райту Состав: растворяют в 100 мл метилового спирта - метиловый голубой 0,135 г, тионин - 0,025 г, эозин - 0,09 г. Свойства: тёмно-синяя жидкость. Огнеопасная. Токсичная. Хранят в плотно закупоренной склянке из оранжевого стекла. Этикетка с надписью "Огнеопасно" и "Яд". Гарантийный срок - 6 месяцев. Методика: На сухой нефиксированный препарат наливают несколько капель краски, спустя 1 мин, прибавляют столько же капель дистиллированной воды. Через 2-3 мин препарат промывают в воде в течение 0,5 мин, пока он в тонком слое не приобретет розовый оттенок. Окраска по Н. Г. Алексееву (Экспресс-метод) Метод основан на использовании азур-эозиновой смеси. Окраска препарата: Нефиксированные мазки залить краской спиртовой Романовского-Гимза на 30 мин, затем добавить Н20, рН 7,0 подогретой до 5060 С. Перемешать краску. Смыть водопроводной водой через 5-6 мин. Мазки просушить фильтровальной бумагой. Окраска по Филипсону Берут смесь из одной части краски Романовского и 3 частей спирта (ректификата). На нефиксированный мазок наливают 0,5-1 мл смеси на 1,5 мин, затем добавляют такое же количество дистиллированной воды, тщательно перемешивают покачиванием препарата и оставляют на 20-30 мин. Смывают водой и высушивают мазки. Окраска по С.Л.Эpлиху Первая окраска. В сукой стерильной бутылке в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г. химически чистого углекислого натрия и 1 г метиленовой синьки. Воду предварительно нагревают до кипения и в остывшей воде растворяют соду и краску. Бутылку с раствором ставят в термостат на двое суток при температуре 39 С, часто взбалтывают, затем бутылку вынимают из термостата и оставляют в темном месте на 5-6 суток. Получается основной раствор краски, который применяют в разведении 1:10. Для этого берут 1 мл хорошо взболтанного раствора и 9 мл дистиллированной воды. Вторая краска В бутылке в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,1 г желтого эозина. Для окрашивания мазков вливают в мерную пробирку или маленький цилиндрик 5 капель разведенного 1:10 основного раствора (краска N1), заливают дистиллированной водой почти до метки 3 мл., приливают 5-6 капель раствора эозина (краска N2) и полученные 3 мл краски наливают на 20-30 мин на мазок, который затем смывают водой и высушивают. Для окрашивания нескольких препаратов количество краски и воды соответственно увеличиваются, но точно соблюдается процесс Смешивания растворов. При необходимости получения более щелочной краски увеличивают количество капель краски N1 и уменьшают количество краски N2. Разведение и смешивание красок производят непосредственно перед окрашиванием. ВРЕМЯ ОКРАСКИ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ. ПРЕПАРАТОВ ПО ПАППЕНГЕИМУ-КРКЖОВУ И ЛЕЙШМАНУ Материал Характеристика фиксация, (в мин) окраска, (в мин) от Лимфатические отпечатки, мазки, 8 узлы пунктаты 10 Экссудат осадок жидкости, 1 тканевые пленки, 3 клочки Транссудат осадок жидкости, 3 растянутые 4 пленки клочки Костный мозг отпечатки, мазки, 3 растянутые 5 клочки сгустки Периферическая мазки 3 кровь Простатический мазки 2 сок Мокрота мазки 8 до 10 12 3 5 М 9 11 2 4 от 8 10 2 8 до 10 12 4 10 М 9 11 3 9 5 6 4 5 3 8 5 12 4 10 4 8 3 7 6 10 8 12 7 11 3 3 10 10 10 4 3 2 3 2,5 10 9 10 12 11 Отделяемое гениталий отпечатки, аспирационный материал трихомонады Молочная железа отделяемое пунктат Прямая кишка отделяемое Пунктаты мягких мазки тканей Жидкость осадок водянки яичка Жидкость осадок (белок) кистозных полостей Кисты эпидермоидные Моча Отделяемое мазки желудка Пунктаты желез мазки 8 12 10 12 9 12 10 16 12 16 11 16 4 4 6 8 6 8 10 10 5 6 9 9 5 6 10 8 7 10 13 11 6 8 12 10 5 7 6 4 4 4 6 8 7 6 8 7 5 5 5 5 5 5 2 8 3 10 2 9 2 10 4 12 3 11 8 10 9 8 10 9 Источники ошибок: 1. Различные фабричные образцы красителей имеют различную силу окраски, поэтому необходимо устанавливать оптимальную концентрацию и время окраски. 2. Вода должна быть нейтральной реакции. 3. Все краски для окраски должны храниться в темном месте и не взбалтываться. 4. В шкафу с красками для крови нельзя хранить щелочи и кислоты. Окраска по Цилю-Нильсену Окраска для выявления кислотоустойчивых бактерий. Реактивы: 1. Карболовый фуксин: 1 г основного фуксина растворяют в 10 мл этилового спирта, раствор выливают в 100 мл 5% раствора карболовой кислоты. 2. 3% спиртовой раствор НСI: 3 мл НСI и 97 мл этилового спирта. 3. Водный 0,5% раствор метиленового синего. Ход окраски: На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового, фуксина, затем препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают и так 3 раза. После остывания препарата сбрасывают фильтровальную бумагу и опускают его в соляно-кислый спирт для обесцвечивания. Обесцвечивают до полного удаления краски, промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2030 с. Снова промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. Туберкулезные микобактерии окрашиваются в красный цвет, все . остальные элементы мокроты и бактерии - в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах и посередине, располагаются группами и поодиночке. При окраске по Цилю-Нильсену в красный цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Окраска по Трапу Применяется для определений вида, бактерий, так как они по отношению к краске делятся на две группы Грам-положительные и Грамотрицательные. Реактивы: 1. Карболовый раствор генцианового фиолетового: 1 г генцианового фиолетового растворяют в 10 мл 96% спирта, раствор выливают в 100 мл 1-2% карболовой кислоты, взбалтывают. 2. Раствор Люголя: 1г йода, 2г йодида калия и 300 мл дистиллированной воды; йод и йодид калия растворяют сначала в 5-8 мл воды, а затем приливают остальную воду. 3. 96% спирт. 4. 10% раствор карболового фуксина: 10 мл карболового фуксина и 90 мл дистиллированной воды. Ход исследования: На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианового фиолетового. Красят 1-2 мин. Бумажку сбрасывают и заливают препарат раствором Люголя на 2 мин, а потом прополаскивают препарат в спирту, до сероватого цвета. Промывают водой и окрашивают 10% раствором карболового фуксина 10-15 с. После этого препарат опять промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионным объективом. Полихромный метод окраски влагалищных мазков (по М.Г. Арсеньевой) Красители: 1) Раствор гематоксилина: гематоксилин - 1,0 г, квасцы алюмо-калиевые - 200 г, желтая окись ртути - 0,5 г, сернокислый цинк - 1,0 г, йодистый калий - 1,0 г, ледяная уксусная кислота - 4 мл, глицерин - 50 мл, спирт 96% .- 10 мл, вода дистиллированная - до 200 мл. 2) Раствор фуксина: приготовить 100 мл 1% раствора фуксина и добавить 5 капель ледяной уксусной кислоты. 3) Раствор лихтгрюна: 0,75 г лихтгрюна развести в слегка подогретой воде (50 мл), затем добавить 0,25 г фосфорномолибденовой кислоты. Ход окраски: Высушенный мазок фиксируют 15 минут в смеси Никифорова. Затем окрашивают спиртовым раствором гематоксилина 1-2 минуты. Промывают водой. Окрашивают водным раствором кислого фуксина в течение 5 минут. Окрашивают 10 минут водным раствором лихтгрюна. Смывают водой, высушивают. Цитоплазма клеток, обладающих базофилией окрасится в синие, голубые тона. Цитоплазма ацидофилифных клеток окрасится в розовые тона. Окраска красным конго (конгорот) Метод предназначен для выявления амилоида. 1. Мазки фиксируют метиловым спиртом или другим фиксатором в течение 5 минут. 2. Переносят в 1% водный раствор красного конго на 1-2 минуты. Конго красный готовят на дистиллированной воде. 3. Промывают водопроводной в.одой 1-2 минуты. 4. Дифференцируют в 70-80%. спирте, в стаканчике или на стекле 0,5-1 мин, а иногда и больше, до тех пор, пока препарат не станет из яркокрасного бледно-розовым. дифференцировать до 3-5 При резком минут. перекрашивании Дифференцировку следует вести под контролем микроскопа. 5. Промывают под проточной водой 1-2 минуты. 6. Подкрашивают квасцовым гематоксилином по Карачи 0,5 мин и снова промывают водой. 7. Просветляют в карбоксилоле. 8. Прополаскивают в ксилоле. 9. Мазки можно заключить в бальзам, в котором они хорошо сохраняются. Результат: Амилоид окрашивается в оранжево-красный цвет, а коллоид остается почти бесцветным. Окраска по Моури Метод для выявления коллоида. 1. Мазки, фиксированные в равной смеси спирта с эфиром, промывают в спиртовом растворе с понижающей концентрацией (96%, 70%, 50%, 30%). 2. Погружают на 30 минут в 0,1% раствор арцинового синего, приготовленного на 3% растворе уксусной кислоты. 3. Промывают проточной водой в течение 2 минут и ополаскивают дистиллированной водой. 4. Переносят в 0,5% водный раствор йодной кислоты на 10 минут. 5. Промывают проточной водой 5 минут дистиллированной водой. 6. Окрашивают реактивом Шиффа 10 минут. 7. Промывают в 3-х смесях сернистой воды. 8. Окрашивают гематоксилином Гарриса 1 сек. и ополаскивают 9. Промывают водой и последовательно в спиртовом растворе с повышающей концентрацией (30%, 50%, 70%, 96%), а затем просветляют в ксилоле. Коллоид окрашивается в красный или красно-бордовый цвет, так как представлен нейтральными мукополисахаридами, если будут и кислыми, то участки коллоида будут ярко-синего цвета. Реактивы: 1) 0,1% арциновый синий. 0,1 г арцинового синего растворяется в 100 мл 3% водного раствора уксусной кислоты, раствор фильтруется и к нему добавляется 1 кристаллик тимола (рН раствора - 2,53,0). 2) Реактив Шиффа: 1,0 г основного фуксина растворить в 200 мл кипящей дистиллированной воды, охладить до 50 С, затем к нему добавить 1,0 г метабисульфита натрия или калия, 20 мл Нормальной соляной кислоты. Раствор переливается в темную склянку и хранится в течение 24 часов в холодильнике. После того как раствор сделается прозрачным и окрашенным в соломенный цвет, следует добавить в него 0,5 г активированного угля и трясти в течение 1 минуты, затем профильтровать через грубый фильтр. Процесс надо повторить в том случае, если краска не обесцветилась. Хранится реактив в холодильнике. 3) Сернистая вода: к 200 мл дистиллированной воды добавляется 5,0 натрия или калия метабисульфита и 6,0 мл концентрированной соляной кислоты. 4) Йодная кислота - 0,5% водный раствор. 5) Гематоксилин Гарриса: 1,0 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта, 20,0 г калийных квасцов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды. Через 24 часа оба раствора соединяют и прибавляют 0,5 г красной или желтой окиси ртути. После этого раствор нагревают до кипения, остужают и через 24 часа фильтруют. Темно-красная жидкость сразу же годна к употреблению. Окраска ретикулоцитов и тромбоцитов Окраска ретикулоцитов и тромбоцитов по Н.Г. Алексееву считается унифицированной. Реактивы: 1) Цитрат натрия (трехзамещенный). 2) Азур II краска. 3) Хлорид натрия. В колбу на 100 мл помещают 1 г Азур II и заливают раствором, состоящим из 5 г цитрата натрия, 0,4 г хлорида натрия и 45 мл дистиллированной воды. Колбу ставят в термостат на 2 дня при 37 С, периодически перемешивая жидкость; для ускорения растворения краски, ее можно нагреть на электроплитке с асбестовой сеткой 10-15 мин. (но не кипятить), охладить до комнатной температуры, профильтровать. Фильтрат используют как рабочий раствор, сохраняя в темном месте. Краска может созревать при комнатной температуре в течение 7 дней, при ежедневном помешивании ее. Методика окраски: В меланжер для лейкоцитов набирают раствор краски до метки 1 и кровь до 4-5 объема ампулы сместителя жидкость из капиллярной части выдувают на ватный тампон, а оставшуюся в ампульной части смесь крови с краской трижды выдувают на часовое стекло и вновь набирают в сместитель. Все манипуляции проделывают с предельной быстротой. Смесь крови с краской оставляют в сместителе на 30 мин (можно оставлять на 1-6 часов), который кладут в горизонтальном положении. Затем сместитель встряхивают 2 мин, 2 капли из капилляра сливают, а из оставшейся смеси делают тонкие мазки. Эритроциты окрашиваются в желтовато-зеленоватый цвет, зернистосетчатая субстанция - в синий цвет, а кровяные пластинки - в синеватый цвет. После суправительной окраски мазки можно докрасить одним из обычных способов окраски (по Романовскому). Эритроциты окрасятся в бледно-розовый цвет, ретикулоциты будут содержать фиолетово-красную субстанцию, а тромбоциты - в фиолетовый цвет. Существуют 4 степени созревания ретикулоцитов: 1 степень - зернисто-сетчатая субстанция в виде клубка или глыбки. 2 степень - зернистость в виде густой сети. 3 степень - отдельные нити. 4 степень - отдельные зернышки. В норме 80% ретикулоцитов 3-4 степени. Вместо меланжеров можно пользоваться пробирками. В капилляр от аппарата Панченкова набирают до метки "50" краску и помещают ее в пробирку, тем же капилляром дважды набирают кровь до метки "0". Смесь крови с краской тщательно перемешивают и оставляют на указанное выше время, затем делают мазки. ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Диагностическое значение цитохимических окрасок Цитохимические окраски проводятся с целые выделения различных вариантов острого миелобластного лейкоза. лейкоза миелопероксидазу, Цитохимическими являются липиды и маркерами положительные гликоген, который острого реакции имеет на диффузное распределение. Процент положительных клеток в этих реакциях может колебаться от 57 до- 100%. Наибольшей активностью пероксидазы, концентрации липидов и гликогена характеризуются властные клетки с выраженной азурофильной цитоплазматической зернистостью, так называемые промиелоцитарные элементы. Для острого положительная гранулярное миеломонобластного реакция на расположение лейкоза миелопероксидазу, гликогена и характерны липиды, положительная слабо диффузнореакция на неспецифическую эстеразу, частично ингибируемую фторидом натрия. Для острого лимфобластного лейкоза реакция на миелопероксидазу и липиды отрицательная, а гликоген располагается в виде гранул в цитоплазме клеток. Для лимфобластов характерна гранулярная реакция на кислую фосфатазу в виде 1-2 гранул при Т-ОЛЛ, либо в виде мелких гранул при ВОЛЛ и О-ОЛЛ. При лечении острого лейкоза цитохимическая характеристика бластов может измениться, наибольшей стабильностью обладает миелопероксидаза. При остром эритромиелозе увеличивается процент сидеробластов в костном мозге, а также эритронормобластов, содержащих гранулы гликогена. При воспалительных процессах и инфекционных заболеваниях увеличивается активность щелочной фосфатазы в нейтрофилах. Может наблюдаться увеличение ее активности в нейтрофилах при гипопластических анемиях и гюлицитемии, лейкемоидных реакциях и остеомиелофиброзе. Резкое понижение активности щелочной фосфатазы отмечается при хроническом миелолейкозе, поэтому исследование данного фермента может быть использовано для дифференциальной диагностики указанных состояний. Определение динамики активности щелочной фосфатазы в гранулоцитах периферической крови применяется для диагностики послеоперационных осложнений в хирургической практике. Изменение содержания гликогена наблюдается при различных состояниях. Увеличение полисахарида в нейтрофилах отмечено при воспалительных процессах, полицитемии, уменьшение при хроническом миелолейкозе. Значительное нарастание концентрации гликогена в лимфоцитах отмечается при хроническом лимфолейкозе. Окраска на гликоген 1. Мазки фиксируются в парах формалина 1 мин. 2. Заливаются насыщенным раствором перйодата натрия или калия на 40 мин (в темноте). 3. Смываются дистиллированной водой, сушатся. 4. Заливаются реактивом Шиффа на 2 часа в темноте. 5. Отмываются дистиллированной водой. 6. Докрашиваются гематоксинином или зеленой краской (лихтрюн или бриллиатгрюн 1% - спиртовой). Приготовление реактива Шиффа: 1 г основного фуксина (или специального фуксина для фуксинсернистой кислоты) растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 20 мл 1 н раствора соляной кислоты и 1 г метабисульфата натрия. Оставляют на сутки, для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте, но лучше в холодильнике в плотно закупоренной посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев. Покраснение реактива свидетельствует о его непригодности. Определение концентрации гликогена в лейкоцитах Принцип метода основан на реакции альдегидов с реактивом Шиффа. Длинная цепь молекул глюкозы, из которых состоит гликоген, соединена кислородными мостиками. В конце цепи имеются свободные ОН-группы (гликоген). Под влиянием йодной кислоты гликольные группы окисляются до альдегидов. В местах, где имеются альдегиды, происходит их взаимодействие с реактивом Шиффа, в состав которого входит красящее вещество - фуксин. В результате реакции образуется пурпурно окрашенное соединение, которое свидетельствует о присутствии полисахарида (гликогена). Реактивы: 1. Фиксатор: 9 частей метиленового спирта и 1 часть 40% раствора формалина. 2. 1% водный раствор (перйодной кислоты (HI04). 3. 1 н раствор HCI. 4. Реактив Шиффа - 1 г основного фуксина для фукинсернистой кислоты растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. Раствор охлаждают до 50 С и прибавляют 20 мл 1 н раствора соляной кислоты, а когда температура достигнет 32 С, добавляют 1 г сухого бисульфата натрия или метабисульфата натрия или калия (последний лучше растворяется). Смесь переносят в склянку, темного стекла с хорошо притертой пробкой и помещают раствор в темное прохладное место. Через несколько часов жидкость обесцвечивается, а через 24 часа она пригодна к работе. Приготовленный реактив должен быть светложелтого цвета, прозрачным. Порозовение реактива является первым признаком непригодности. Чтобы, раствор был более устойчив, через 4 часа можно добавить 1-2 таблетки карболена, растертых в порошок. Хранят реактив в холодильнике. 5. Раствор гематоксилина Корацци: 25 г алюмокалиевых квасцов растворить в 400 мл дистиллированной воды, вскипятить, отфильтровать и остудить. Добавить 1 г гематоксилина и несколько кристаллов йодной кислоты. Смешать и поставить в термостат при +37 С на 1-2 суток для "созревания" краски. Чем дольше производится промывка мазков в проточной воде после докраски гематоксилином, тем более синими и контрастными становятся клеточные ядра и рельефнее выделяются в цитоплазме красные гранулы гликогена. Можно добавить в сосуд с водой, в которую помещены мазки, несколько капель нашатырного спирта, что ведет к болеё интенсивному окрашиванию ядер. Ход определения: 1. Сухие мазки крови или костного мозга фиксируют в течение 10-12 мин (можно брать окрашенные мазки). 2. Промывают в проточной воде в течение 2 мин. Слегка просушивают. 3. Помещают мазки в 1% раствор йодной кислоты на 10 мин. 4. После промывки Просушивают или осторожно промывают фильтровальной бумагой, чтобы предохранить реактив Шиффа от загрязнения. 5. Помещают в реактив Шиффа на 30 мин. 6. Промывают в проточной воде в течение 5 мин. 7. Докрашивают раствором гематоксилина в течение 1-2 мин. 8. Промывают мазки в проточкой воде 20-30 мин. Розовая окраска цитоплазмы оценивается как слабо положительная реакция, более интенсивный цвет свидетельствует о положительной, а яркомалиновая окраска о резко положительной реакции. Отсутствие окрашивания цитоплазмы наблюдается при отрицательной ШИК-реакции. Подсчет ведут на 100 нейтрофилов. В норме нейтрофилы содержат в среднем 170-180 ед. гликогена. Гликоген содержится во всех кроветворных элементах. В клетках граиулопоэза гликоген располагается в диффузной или диффузно-гранулярной форме. Для элементов лимфоидной ткани характерна гранулярная форма отложения гликогена. Гранулы могут быть очень мелкие, вишневого цвета. Кроме гликогена, положительную ШИК-реакцию дают моносахариды, полисахариды, мукопротеиды и гликопротеиды. Для определения собственно гликогена необходимо предварительно обработать мазки амилазой в термостате в течение 30 мин при температуре 37 С (1 мл профильтрованной амилазы растворяют в 40 мл физиологического раствора). Можно контрольные мазки обрабатывать слюной. Мазок фиксируют, а затем помещают в стакан со слюной на 1,5-2 ч, после чего в мазках определяется гликоген. Отсутствие ШИК-реакции после обработки ферментом свидетельствует о присутствии в цитоплазме клеток гликогена, а не других мукополисахаридов. Определение липидов в лейкоцитах (по Г. Роскину, Д. Лесиной) Принцип: Метод основан на применении красителей, хорошо растворяющихся в Жирах и дающих интенсивную окраску. При выявлении липидов жирорастворимыми красителями наилучшие результаты получаются при использовании азокрасителя судана-черного В, растворенного в 70% спирте. Реактивы: Краситель-фиксатор: 50 мл 70% спирта, 20 мл дистиллированной воды и 20 мг а-нафтола смешивают в колбе и добавляют судан-черный В до насыщенного раствора сине-черного цвета (приблизительно 1/3 часть химической пробирки). Раствор нагревают (можно довести до кипения). Раствор сразу же готов к употреблению, стоек. Приготовление 70% спирта: к 100 мл 96% спирта добавляют 39,1 мл дистиллированной воды. Краска Романовского (или гематоксилин) приготавливается обычным способом. Ход определения: Нефиксированный мазок помещают в теплый раствор краски-фиксатора и ставят в термостат на 30 мин, при температуре 37 С. Тщательно в течение 2-3 мин отмывают в 70% спирте. Докрашивают краской Романовского в течение 15 мин или гематоксилином 20 мин. Липиды окрашиваются в черный цвет или коричневый. Ответ дают в единицах, подсчет ведут на 100 неитрофилах. Клетки, цитоплазма которых содержит большое количество гранул, оценивают в 3 креста - резко положительная реакция. Клетки, цитоплазма которых содержит небольшое количество гранул-черных, оценивается одним крестом - реакция отрицательная. Каждый (+) приравнивается к 1 единице. Подсчитываемое количество клеток умножается на количество единиц и вычисляется общее количество. Нормальное содержание липидов в нейтрофилах - 180-200 ед. Клиническое значение: в мазках периферической крови содержатся липиды в цитоплазме нейтрофилов в виде крупной зернистости. Большинство нейтрофилов (69-80%) у здоровых людей красятся интенсивно (++) и 10% слабо окрашены (-). Средний цитохимический показатель 2,682,78. Небольшое количество липидов обнаруживают в моноцитах и тромбоцитах. Определение пероксидазы в лейкоцитах (метод ГрехемаКнолля) Принцип: Определение пероксидазы основано на использовании бензидина, который в присутствии перекиси водорода и пероксидазы переходит в коричневый оксибензидин. Реактивы: 1. Формалиново-спиртовой раствор (20 мл этилового спирта прибавить 5 мл 40% формалина). 2. Пероксидазный реактив: для этого в пробирку отмеривают 6 мл 96% раствора спирта и добавляют (на кончике ножа или стеклянной палочки) бензидин. Содержимое пробирки смешивают и добавляют 4 мл Н20 и 0,1 мл 3% перекиси водорода (Н202). Ход определения: Свежий, нефиксированный (фиксируют формалиново-спиртовым раствором 1 мин) мазок крови, не сливая, на 5 мин заливают приготовленной смесью N2, после чего хорошо промывают водопроводной водой и заливают краской Романовского или гематоксилином на 20 мин для докрашивания ядер клеток. Цитоплазма клеток, содержащих пероксидазу, окрашивается в золотистый или коричневый цвет. Ответ дают по степени интенсивности окраски (0,1,2,3). Клиническое значение: В кровяных элементах пероксидаза содержится преимущественно в цитоплазме гранулоцитов. Среди нейтрофилов 3-16% окрашены резко положительно (++++), 60-90% положительно (++++) и остальные слабо положительно (-). Средний цитохимический показатель 1,79-2,06. Определение активности пероксидазы Принцип метода основан на реакции окисления бензидина системой перекись-пероксидаза в коричневый цвет. Реактивы: 1. 4% раствор формалина: 10 частей 40% раствора формалина и 90 частей 96% спирта. 2. Инкубационный раствор: небольшое количество основного бензидина (на кончике ножа) растворяют в 5 мл 70% спирта, помещают в термостат при 37 С на 5 мин и добавляют 0,02 мл 3% раствора Н202. Раствор готовят ex tempore. 3. Краска Романовского. Ход определения: 1. Мазки фиксируют, заливая на 1 мин 4% формалиново-спиртовым раствором. 2. Промывают проточной водой. 3. Заливают на 30 мин инкубационным раствором. 4. Промывают проточной водой, высушивают и докрашивают краской Романовского - 15 мин. При наличии в клетках пероксидазы цитоплазма окрашивается в желтый, оранжевый или коричневый цвет в зависимости от активности фермента. Ядра миелобластах и лейкоцитов окрашиваются промиелоцитах в отмечается фиолетовый небольшая цвет. В активность оксидоредукта. Высокая концентрация пероксидазы выявлена в эозинофилах, низкая - в моноцитах. Определение неспецифической эстеразы Принцип определения: в присутствии неспецифической эстеразы, используемой в качестве субстрата, 1-нафтилацетат гидролизуется с последующим окрашиванием продуктов гидролиза. Реактивы: 1. Фиксатор - 40% раствор формалина. 2. Инкубационная смесь - 0,5 мл 1% раствора 1-нафтилацетата добавляют к 2,5 мл 0,15 М фосфатного буфера рН 8,0 и 25 мл дистиллированной воды. В этой смеси растворяют 12,5 мг синего прочного ВВ. 3. 1% раствор 1-нафтилацетата - 50 мг реактива, растворяют в равных количествах ацетона и дистиллированной воды (по 2,5 мл). 4. 0,15 М фосфатный буфер - 1,69 Na2HPО4*2H2О и 0,07 г КН2РО4 растворяют в 100 мл дистиллированной воды. 5. Раствор гематоксилина. Ход определения: Свежие сухие мазки фиксируют в парах формалина в течение 10 мин, промывают дистиллированной, водой. Затем один мазок помещают в инкубационную среду и выдерживают в течение 2 ч при 0 С. Другой помещают в инкубационную среду с добавлением 42 мг фторида натрия. Промывают 2-3 мин в проточной воде и докрашивают раствором гематоксилина 10-12 мин. Подавление активности неспецифической эстеразы характерно для клеток моноцитарного ряда. Неспецифические эстеразы выявляются в цитоплазме нейтрофилов и монолитов в виде множественной темной зернистости и единичных гранул в цитоплазме небольшого числа лимфоцитов. Определение кислой альфа-нафтилацетатэстеразы Принцип метода: такой же как при определении неспецифической эстеразы, но реакция проходит при кислых значениях рН. Реактивы: 1. Фиксатор 40% раствор формалина. 2. Инкубационная смесь - 1 мл 4% раствора азотистого, натрия смешивают с 1 мл 40 парароэанилина в течение 1 мин. К смеси добавляют 0,2 мл 0,25% раствора альфа-нафтилацетата и 20 мл 0,7 М раствора фосфатного буфера рН 5,0; рН раствора доводится до 5,8. 3. 0,25% раствор 1-нафтйлацетата: 5 мг субстрата растворить в 0,2 мл ацетона. 4. 0,7 М раствор, фосфатного буфера : Растворить 0,593 г Na2HPО4 в 50 мл дистиллированной воды, 2,269 г КН2РО4 растворяют в 250 мл воды. Смешать 2,7 мл первого раствора и 47,3 второго. рН 5,0. Ход определения: 1. Мазки фиксируют в парах-формалина в течение 10 мин. 2. Промывают дистиллированной водой. 3. Инкубируют мазки при температуре +37 С в течение 1,5 часов. 4. Промывают мазки проточной водой в течение 5 мин. 5. Докраска ядер проводится раствором гематоксилина 10-15 мин. Активность кислой алъфа-нафтилацетатэстеразы выявляется в виде малиновых гранул. Моноциты обнаруживают высокую активность фермента в диффузной форме, гранулоциты - слабую. В Т-лимфоцитах кислая альфанафтилацетатэстераза выявляется в виде единичных крупных гранул, Влимфоциты дают либо отрицательную, либо слабую мелкограяулярную реакцию. Определение активности кислой фостатазы Принцип: нафтол-AS-фосфат гидролизируется кислой фосфатазой в соответствующем интервале рН, образуя с парарозанилином в месте локализации фермента. Реактивы: 1. Фиксатор - смесь 40% раствора формалина и 90% этанола в соотношений 1:4. 2. Инкубационная смесь: нафтол - AS-фосфат - 20 мг растворяют в 0,5 мл диметилформамида, добавляют отдельно приготовленную смесь 40 мл 0,1 н раствора ацетат натрия + (8 капель 4% раствора парарозанилина + 8 капель 4% раствора азотистого натрия). Доводят рН до 5,2-5,4 0,1 н раствором НСI. 3. 0,1 н раствор ацетата натрия - 6,5 г реактива растворяют в 500 мл дистиллированной воды. 4. 4% раствор парарозанилина: 8 г основного фуксина для фуксинсернистой кислоты растворяют в 200 мл 2 н НСI. 5. 4% раствор азотистого натрия: 4 г реактива растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Ход определения: 1. Сухие свежие мазки фиксируют в течение 30 сек. 2. Споласкивают мазки проточной водой, высушивают. 3. Помещают мазки в инкубационную смесь на 2 часа при температуре +37 С. 4. Промывают мазки проточной водой в течение 5-10 мин. 5. Докрашивают раствором гематоксилина в течение 10-15мин. Активность кислой фосфатазы проявляются В виде гранул яркокрасного цвета в цитоплазме лимфоцитов и диффузно-гранулярного окрашивания в моноцитах, гранулоцитах. Определение активности щелочной фосфатазы. Принцип метода и ход определения аналогичны определению кислой фосфатазы. Примечание: 1. Заменить буфер на 0,1 М трис (оксиметил)-аминометан: 300 мг реактива растворяют в 25 мл дистиллированной воды; рН инкубационной смеси доводят до 9,4 30% раствором NaOH. 2. В ходе реакции проводят инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре. Щелочная фосфатаза в виде красных гранул выявляется преимущественно в цитоплазме нейтрофилов. Реакция оценивается как резко положительная, если клетки содержат большое количество гранул и стирается четкая грань между ядром и цитоплазмой. Если красные гранулы не интенсивно заполняют цитоплазму и отчетливо просматриваются контуры ядра, то реакция оценивается как положительная. Если цитоплазма окрашивается в светло-розовый цвет или имеет скудную зернистость - как слабо положительная. При отсутствии в цитоплазме клетки зернистости реакция, считается отрицательной. Подсчет ведут на 100 нейтрофилов, ответ дают в единицах. Нормальная величина для щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови у практически здоровых людей равна 27+1,5 ед. Метод выявления ядрышек в лимфоцитах Высушенные мазки фиксируются в течение 10 мин метанолом, затем на 30 мин в 0,257 раствором метиленового синего, разведенного 1:1 фосфатным буфером при рН 5,0. Мазки ополаскиваются трижды в сменяемом буферном растворе с рН 5,0. Растворы:- буфер Мак-Илвайн с рН 5,0. Для приготовления 1 л буферного раствора смешивают 515 мл 0,2М раствора Na2HPО4 (дифосфат натрия) и 485 мл 0,1 М раствора С6Н8О6*Н2О (лимонной кислоты). Чтобы приготовить 0,2 М раствора Na2HPО4, на 1 л раствора берут 28,4 г сухого реактива. Для получения 0,1 М раствора С6Н8О6*Н2О (лимонной кислоты) берут 21 г на 1 л рН 5,0. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕТАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА (HbF) В МАЗКАХ КРОВИ (метод Бетке и Клейхауэра в модификации Е.Г. Исаевой и А.Н. Королевой) Цитологический мётод определения HbF является полуколичественным методом и позволяет быстро и сравнительно легко выявить значительное повышение гемоглобина новорожденных. Принцип метода заключается в том, что HbF является более кислоустойчивым, чем гемоглобин взрослых. Реактивы: 1. Лимоннокислофосфатный буфер составляют из двух растворов: а) 0,2 М раствор Na2НPО4: берут 8,9 г Na2НPО4 и доливают дистиллированной воды до 250 мл; б) 0,1 М раствор лимонной кислоты: берут 5,25 г лимонной кислоты, доливает дистиллированной воды до 250 мл. Смешивают 26,6 части раствора а) и 73,4 части раствора б) Буфер должен иметь рН 3,3+0,1. Готовят его передупотреблением. 2. 80% раствор этилового спирта: к 100 мл 90% этилового спирта добавляют 13,79 мл дистиллированной воды. 3. Красящий раствор: 1% водный раствор метилвиолета: берут 1,0 краски и доводят до 100 мл дистиллированной водой. Краситель должен простоять 1-2 суток, после чего его фильтруют. Можно использовать 1% раствор эозина: растворяют 1,0 эозина в 10 мл этанола и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой. Ход определения: Из капиллярной крови, взятой из пальца, делают тонкий мазок, мазок фиксируют в 80% растворе этанола в течений 5 мин. Для приготовления мазка можно использовать кровь, смешанную с антикоагулянтом. Сразу после фиксации мазок смывают дистиллированной, водой, после чего высушивают на воздухе. Затем, мазок элюируют в течение 5 мин в предварительно прогретом (при +37 С) в течение 30 мин) лимонцокислофосфатном буфере. Во время элюции буфер необходимо раза два перемешать стеклянной палочкой для удаления пузырьков воздуха с поверхности мазка. Элюированный мазок ополаскивают дистиллированной водой, просушивают с помощью фильтровальной бумаги или на воздухе и опускают в краску эозина на 3 мин. В случае применения красителя метилвиолета его наливают на мазок на 2 мин. По истечению времени препараты вновь смывают водой (можно водопроводной) и после просушивания просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Оценка результатов: Эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин, окрашены в ярко розовый цвет при использовании раствора эозина или ярколиловый цвет при применении метилвиолета. Эритроциты, в которых содержится гемоглобин взрослых А, видны в виде теней, т.к. у них прокрашивается только строма, а гемоглобин А элюирован. Подсчет ведется на 100 эритроцитов, содержащих HbF, и ответ выражают в процентах. ОКРАСКА НА СИДЕРОБЛАСТЫ И СИДЕРОЦИТЫ по методу Грюйеберга. Принцип: железо, присутствующее в клетках, реагирует феррицианидом калия с образованием осадка берлинской лазури. с Реактивы: 1. Фиксатор - метиловый спирт. 2. Раствор кислого ферроцианида калия: К 50 мл 0,25% раствора соляной кислоты добавляют 0,5 г желтой кровяной соли. Готовят ex tempore. 3. 0,1% водный раствор эозина. Ход определения: Мазок фиксируют в метиловом спирте в течение 5 мин. Затем заливают раствором кислого феррацианида калия на 4 мин. Промывают дистиллированной водой и докрашивают раствором эозина в течение 2-5 мин. Цитоплазма эритроцитов и эритробластов и их ядра окрашиваются в розовый цвет, сидерофильные гранулы - в синий. Количество сидеробластов в костном мозге не превышает 20%. Регистрация результатов цитохимического исследования может проводиться в виде качественного определения вещества в клетке и его локализации, а также полуколичественной оценки результатов, основанной на степени интенсивности специфической окраски с подсчетом условных единиц по методике Kaplow=а.0+в.2+г.3 или коэффициента, высчитанного по формуле Astaldi и Verga. К = (a.0+б.1+в.2+г.3):100, где цифры 1,2,3 обозначают степень интенсивности окраски, а 0 отрицательную реакцию. Буквами обозначаются количество клеток с одинаковой интенсивностью окраски. Цифра 100 в знаменателе соответствует числу подсчитанных клеток. Для определения относительного количества вещества или активности фермента подсчитывают 100 клеточных элементов одного вида. Степень интенсивности окраски в них выражают в цифрах от 0 до 3-4 и умножают на число элементов, имеющих одинаковую реакцию. Сумма всех произведений является показателем активности реакции. Проба на серповидность эритроцитов Выработка в организме аномального гемоглобина S может привести к развитию тяжелой гемолитической анемии, называемой серповидно- клеточной. Этот вид гемолитической анемии относится к гемоглобицопатиям. Принцип метода: Основан на том, что гемоглобин S при понижении парциального кислорода кристаллизуется и придает эритроцитам форму серпа (дрепаноцита). Для этого к крови прибавляют вещества, снижающие в препаратах содержание кислорода. Реактивы: 1) 2% водный раствор матабисульфита натрия (Na2S2О5): берут 100 мл Na2S2О5 и приливают 5,0 мл дистиллированной воды. Реактив рекомендуется употреблять свежеприготовленным. Вместо Na2S2О5 можно употреблять Na2S2О4 (натриевый дивионит). 2) Вазелин. Ход определения: Из прокола кожи пальца, лучше предварительно перетянутого в течение 3-5 мин резинкой, наносят небольшую каплю крови на предметное стекло и сразу жё добавляют более крупную каплю раствора метабисульфита натрия, закрывают покровным стеклом и обводят вазелином для предотвращения доступа кислорода. Чтение результата: Препарат просматривают в микроскопе при увеличении в 400-600 раз в течение первых 10 - 15 мин. Если результат не ясен, смотрят через 24 и 48 часов. В случае положительного результата пробы эритроциты принимают серповидную форму или напоминают бананы. Цитохимический метод определения нестабильного гемоглобина При гемоглобинопатиях могут встречаться нестабильные по своим физико-химическим свойствам гемоглобины. Из них наиболее часто встречается гемоглобин Н, относящийся к быстроподвижним электрофорезе гемоглобинам и присутствующий в крови при талассемии. при Принцип метода: Гемоглобин Н является лабильным хромопротеидом, легко коагулирующим, образующим тельца Гейнца, при изменении условий внешней среды, например при добавлении красителя бриллианткрезилблау. Реактив: 1% воднорастворимый; бриллианткрезилблау в цитратном растворе. Приготовление цитратного раствора: а) 3% лимоннокислый натрий: берут 3 г лимоннокислого натрия и доливают дистиллированной водой до 100 мл, б) 0,85% физиологический раствор: берут 85 мг поваренной соли NaCl и доливают дистиллированной водой 100 мл. Растворы А и Б сливают в соотношении: 1 ;часть раствора А и 4 части раствора Б. Затем, берут 1 г воднорастворимого бриллианткрезилблау и доливает цитратным раствором до 100 мл. Ход определения. Смешивают равные объемы крови и 1% раствора бриллианткрезилблау, например, по 0,25 мл. Оставляют при комнатной температуре в течение нескольких часов или в термостате при температуре +3.7 С на 30-40 мин. После этого делают мазки и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Оценка результатов. При наличии нестабильного гемоглобина в эритроцитах появляется большое количество телец Гейнца, в норме не более 5. Среди эритроцитов встречаются, ретикулоциты, у которых хорошо прокрашивается сетчатая субстанция. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛОВОГО ХРОМАТИНА Хромосомный набор клеток человека (кариотип) состоит из 46 хромосом, образующих 23 пары (диплоидное число). 44 хромосомы являются аутосомами и 2 - половыми хромосомами. Последние получили свое назначение потому, что среди локализованных в них генов находятся такие гены, которые контролируют формирование того или иного пола. За развитие женского пола ответственна Х-хромосома, а формирование мужского пола связано с У-хромосомой. Соматические клетки женского организма содержат, помимо 44 аутосом, две Х-хромососы, мужского - одну Х и одну У-хромомосому. В женских половых клетках (гаметах), образующихся из соматических клеток в мейозе в процессе редукционного деления, содержится, помимо 22 неполовых хромосом, Х-хромосома. В мужских половых клетках (сперматозоидах) содержится либо Х-, либо У-хромосома, причем количество, образующих в мейозе сперматозоидов с Х- и У-хромосомами одинаково. При оплодотворении в зависимости от того, в каком варианте произойдет слияние яйцеклетки и сперматозоида, зиготы имеют наборы хромосом XX или ХУ. В настоящее время можно идентифицировать хромосомы при помощи микроскопической техники. С целью ориентировочной экспресс-диагностики некоторых хромосомных нарушений используется метод определения так называемого полового хроматина. Половой хроматин (тельце Барра) был обнаружен Барром и Бертраном в 1949 году. Это тельце в осматических клетках является половым признаком женских особей и представляет собой инактивированную Х-хромосому. Число телец в клетке равно числу Ххромосом без единицы. Половой хроматин обнаруживается не во всех женских клетках. Повидимому, это объяснятся тем, что клетки находятся в различных фазах, предшествующих делению. Тельца Барра обнаруживаются только в интерфазе, т.е. фазе абсолютного покоя клетки. Диагностическая заключается в том, ценность что с определения помощью этого полового хроматина исследования можно ориентировочно установить изменение количества Х-хромосом в ядре. Подобные нарушения могут заключаться как в недостатке Х-хромосом, так и в избыточном их количестве. Аномалии количества Х-хромосом возникают в результате непрохождения Х-хромосом в мейозе. Так при нерасхождении Х-хромосом одна из образующихся клеток имеет набор XX, другая вообще лишёна Х-хромосом. В дальнейшем при оплодотворении возникают аномальные клетки, отличающиеся либо лишними хромосомами, либо их отсутствием. Соответственно этому в хроматин-положительных ядрах обнаруживается различное количество телец Барра (от 1 до 4). Нарушения в системе Х-хромосом выражаются определенным синдромами. Характеристика некоторых из их представлена в табл. 1 Таблица 1 Половой хроматин при анеуплоидиях Наименование синдрома Синдром Клайнфельтера Синдром ШерешевскогоТернера Синдром Трипло X Набор половых хромосом ХХУ Фенотипический пол Мужской Половой хроматин Есть Х0 Женский Нет XXX Женский Два тельца Помимо указанных синдромов, существуют и другие, связанные с разнообразными структурными дефектами Х-хромосомы. Для диагностики таких нарушений метода определения полового хроматина недостаточно. Определение полового хроматина нашло применение в различных областях медицины. Эти исследования используются для диагностики в психиатрической клинике у психически, больных и умственно отсталых, в гинекологической практике - у больных с различными формами первичного бесплодия, с первичной аменореей у женщин, которые имели мертворожденных, а также у новорожденных с аномалиями развития. Аналогичное применение данный метод нашел и в судебно-медицинской практике, онкологии (для гистологической дифференциации отдельных форм опухолей и при гормональной терапии). При некоторых наследственных заболеваниях (гемофилия, цветовая слепота, мышечная дистрофия Дюшега) и у больных с различными эндокринными нарушениями (гипогонадизм, гинекомастия, эффективно. агенезия гонад) применение данного метода также Метод определения полового хроматина в соскобах слизистых оболочек (Ацетат-орсеиновый метод) Принцип: Ядерный хроматин и спирализованная хромосома в интерфазе окрашиваются орсеином. Реактивы: 1) Фиксатор: 3 части метилового спирта, 1 часть ледяной уксусной кислоты. 2) Раствор краски ацет-орсеина готовится следующим - образом: 1 способ: 60% раствор уксусной кислоты (разводят ледяную уксусную кислоту водой) кипятят в течение 5 мин. В. кипящую уксусную кислоту добавляют краску орсеин (орцеин) из расчета 2 г на 100 мл кислоты. Раствор охлаждают под холодной водой и фильтруют через бумажный фильтр. Краска: стойкая, хранится долго. 2 способ: 1 г синтетического орсеина растворяют в 45 мл ледяной уксусной кислоты, подогревают до кипения, остужают и фильтруют. К полученным 45 мл основного раствора добавляют 55 мл., дистиллированной воды и снова фильтруют. После этого раствор готов к употреблению. Ход определения: Предметные стекла готовят обычным образом, как и для приготовления других препаратов и хранят в смеси Никифорова. Перед работой стекла тщательно протирают. Перед взятием материала со слизистой оболочки полости рта пациент должен тщательно прополоскать рот. Описанную, методику окраски и микросокпирования можно применять не только для анализа клеток букального эпителия, но и для изучения других тканей. Слегка обточенным металлическим или деревянным шпателем делают соскоб, нажимая достаточно энергично, чтобы получить клетки среднего слоя слизистой оболочки: Из полученного соскоба (беловатый налет) готовят мазок на предметном стекле. Приготовленный мазок, не подсушенный, фиксируют, помещая на 15-20 мин в метиловый, спирт. Затем мазок окрашивают, для чего каплю краски ацетат-орсеина наносят на фиксированный мазок и накрывают покровным стеклом. Излишек краски отсасывают фильтровальной бумагой. Примечания: 1) При отсутствии метилового спирта фиксацию можно проводить и в этиловом спирте, однако пользоваться метиловым спиртом предпочтительнее. 2) Мазки можно не фиксировать. Краска наносится на свежий мазок, закрывается покровным стеклом и слегка придавливается. На покровное стекло прикладывают 2-3 слоя фильтровальной бумаги и слегка надавливая на покровное стекло (препарат не сдвигать!), удаляют избыток краски. 3) В качестве красителя можно использовать 0,1% водный раствор метиленовой сини. Окраска полового хроматина по методу Докумова Принцип метода аналогичен ацетат-орсеиновому методу. Реактивы: 1) Фиксатор; метиловый спирт или смесь Никифорова. 2) 70% спирт. 3) 50% спирт. 4) 5 Н раствор соляной кислоты. 5) Хроматиновый краситель: 9,71-4 г уксуснокислого натрия и 14,714 г диэтилбарбитурата натрия (растворимый веронал) растворяют в 500 мл дистиллированной воды. 28 мл буферного раствора смешивают с 32 мл 0,1 н раствора соляной кислоты и доливают 40 мл 50% спирта. Затем добавляют 1 г толуидинового синего и фильтруют. рН красителя должен быть 5,7+0,2. Ход определения: Приготовление препаратов производится аналогично ацетат-орсеиновому методу. Мазки фиксируют в метиловом спирте в течение 10 - 15 мин или в смеси Никифорова в течение 24 часов. Препарат выдерживают в 70% спирте (1 мин), а затем в 50% спирте (1 мин). Промывают дистиллированной водой и помещают на 20 мин в 5% раствор соляной кислоты. Затем мазки заливают хроматиновым красителем на 1 мин, после чего промывают в проточной воде и высушивают. Приготовление постоянного препарата: Для приготовления постоянного препарата окрашенный мазок промывают сначала 15%, затем 30% раствором уксусной кислоты, высушивают на воздухе и заключают в канадский бальзам. Возможные ошибки: Длительная фиксация может привести к чрезмерному обезвоживанию и деформации, т.е. сморщиванию ядер эпителия. Ядерная мембрана становится неровной, и анализ телец полового хроматина, особенно имеющих форму утолщения ядерной мембраны, будет затруднен. Свежеприготовленным ацетат-орсеином необходимо окрашивать мазок в течение 20-60 мин в зависимости от "возраста" ацето-орсеин. Незрелый краситель окрашивает лишь часть клеток с половым хроматином, поэтому следует контролировать под микроскопом степень окрашенности, чтобы не допустить ошибку при подсчете. Окрашивание мазка зрелым красителем в течение часа и более может привести к чрезмерному окрашиванию хроматиновых скоплений в ядре, в результате чего трудно дифференцировать интерфазные ядра от ядер, находящихся в других фазах. Перекрашенный мазок отмыть в уксусной кислоте. Выявление полового хроматина в мазках крови Впервые метод применен в 1954 году Девидсоном и Смитом. При микроскопическом исследовании мазков крови, обычно окрашенных, в хорошо сегментированных нейтрофилах видны отростки различной формы, которые можно разделить на 4 типа: А - в виде барабанной-палочки; В - в виде капельки или узелка; С - в виде столбика; Д - в виде теннисной ракетки или кольцевидной формы. В норме у женщин на 500 сегментоядерных клеток встречается 6 или более лейкоцитов с хроматиновым придатком. В лейкоцитах мужчин ядерные придатки отсутствуют. Некоторые авторы рекомендуют считать клетки, дойдя до 6 ядерных отростков. Обычно это происходит при подсчете 227 клеток (по одному на 38 клеток в среднем). 500 клеток подсчитывают только тогда, когда необходимо доказать отрицательные случаи. МЕТОДЫ ОКРАСКИ ПРИ ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Техника окраски препаратов крови больного с малярией Лучше всего окраску препаратов крови с возбудителями малярии производить, в специальных кюветах, в которых стёкла помещаются вертикально. Толстые капли окрашивают без фиксации. Рабочий раствор краски наливают в кювету таким образом, чтобы были покрыты все стекла. Продолжительность окраски фиксированных мазков 45-50 мин. Толстые капли окрашивают 15-30 мин в зависимости от качества краски и температуры воздуха в лаборатории. При низких температурах в лабораторий (ниже 14 С) время окраски должно быть удлинено, при очень высоких температурах (около 30 С) время окрашивания капель, но не мазков, может быть сокращено на 15 мин. По окончании окраски препараты промывают той же водой, на которой был приготовлен красящий раствор. Вода тонкой струйкой должна поступать в кювету с препаратами, вытесняя краску. Промывание продолжают до тех пор, пока вытекающая из кюветы вода не станет прозрачной. Воду сливают, а стекла помещают на подставки для сушки, таким образом, чтобы капля располагалась на нижней поверхности стекла. Особенности окраски мазков при малярии По сравнению с тонким мазком капля представляет собой метод обогащения, так как при этом объем исследуемой крови в 30-40 раз больше, чем в мазке и, соответственно, повышаются шансы на обнаружение паразитов. Чувствительность толстой капли такова, что при обычном просмотре препарата в течение 5 мин, что примерно соответствует 100 полям зрения, можно обнаружить паразитов при их числе в крови около 5 экземпляров в 1 мм3, Приготовление толстой капли отличается от приготовления тонкого мазка, следующим: - берется больший объем крови; - кровь, взятую на стекло, распределяют не тонким равномерным слоем, как это необходимо при приготовлении тонкого мазка, а толстым слоем на ограниченной поверхности; - окрашивают толстую каплю без предварительной фиксации. Толстая капля окрашивается нефиксированной и эритроциты в ней разрушаются. Поэтому форма паразитов в большинстве случаев нарушается. С морфологией разных видов паразитов и изучением строения отдельных стадий лаборант знакомится при просмотре тонких мазков, зафиксированных спиртом. Форма паразитов в таких препаратах сохраняется, как правило, хорошо. Тонкий мазок исследуется для более точного определения вида паразита, а также для диагноза смешанных инфекции. Рекомендуется приготовить серию препаратов из 8 толстых капель и 2 мазка, т.к. при малом числе паразитов в крови их легче обнаружить, исследуя несколько препаратов. Результаты исследования крови зависит не только от квалификации лаборанта, но и от соблюдения правил взятия крови и окраски. Приготовление толстой капли Метод толстой капли основан на том, что благодаря извлечению гемоглобина в результате гемолиза эритроцитов во время окрашивания нефиксированных препаратов, становится возможным исследовать кровь, лежащую в несколько слоев. Поэтому, при приготовлении толстой капли во избежании фиксации эритроцитов, нужно особенное тщательно удалить с поверхности пальца следы спирта. Исследуемая, капля должна иметь, определенную величину. Она должна быть не слишком толстой, но и не слишком тонкой. Диаметр толстой капли должен, быть около 20 мм, размеры прямоугольной капли - примерно 15-20 мм. Рекомендуется делать две капли на одном стекле на случай, если одна из них окажется испорченной. Существует несколько способов приготовления толстой капли: 1. К выступившей из прокола капле крови диаметром 3-4 мм прикасаются предметным стеклом, избегая касания поверхности кожи; и распределяют кровь по стеклу в кружок одним движением. 2. Капельку крови диаметром 3-4 мм переносят на предметное стекло, прикоснувшись к нему, затем углом другого стекла или скарификатором распределяют кровь в кружок. 3. Капельку крови размером 3-4 мм переносят на предметное стекло, затем погружают в него кончик иглы, держа его под небольшим углом к поверхности стекла, дают крови немного растечься и двумя движениями перпендикулярно длинной оси стекла распределяют кровь в прямоугольник. 4. На предметном стекле сначала готовится мазок немного толще обычного, затем, пока он еще не высох, на него наносят две капли крови, которые по влажному мазку растекаются правильными дисками. При этом, чем крупнее взята капля, тем больше площадь по которой она распределяется. Поэтому высота капли остается примерно одинаковой независимо от объема взятой крови. Паразиты и форменные элементы распределяются по площади толстой капли, приготовленный этим способом, более равномерно, чем в каплях, приготовленных обычным способом. Существует методика комбинированного препарата по Мокшанскому: На предметное стекло наносится мазок равной величины так, чтобы толстый непосредственно переходил в тонкий, что достигается изменением наклона шлифовального стекла и нажима. На Толстый участок мазка, пока он влажен, наносится капля крови. После ее высыхания на границе толстого и тонкого участков мазка проводится линия куском парафина или восковым карандашом во избежании попадания спирта на каплю. Тонкий, мазок фиксируется спиртом, а затем весь препарат окрашивается обычным способом. Необходимо высыхать, они соблюдать должны правила постепенно, высушивания их нужно нагревательных приборов или прямых солнечных лучей. толстых держать капель: вдали от Недопустимо делать надписи на поверхности толстой капли. Для маркировки нужно провести дополнительную полоску кровью, расположив ее между толстыми каплями или ближе к концу стекла. Капли, приготовленные на мазке, маркируют, используя свободную поверхность мазка. Маркировку: делают простым, карандашом после высушивания препарата. Неокрашенные препараты крови необходимо предохранять от повреждения насекомыми. Неокрашенные толстые капли не подлежат длительному хранению, т.к. длительное хранение приводит к фиксации крови и при окраске такие капли плохо гемолизируются. Способы проверки наличия азура в краске 1. Наиболее простой способ проверки качества краски - это пробная окраска мазков и толстых капель. В хорошо, окрашенных препаратах отчетливо окрашиваются в вишнево-красный цвет такие азурофильные субстанции, как тромбоциты, ядра лейкоцитов, ядра малярийных паразитов, зернистость в пораженных эритроцитах. 2. Проверка наличия азура с помощью хлороформа или эфира. В химическую пробирку наливаем 7-9 мл 3-5% рабочего раствора испытуемой краски. В эту пробирку добавляем 2-3 мл хлороформа (он опустится на дне пробирки) или эфира (он останется на поверхности раствора краски). Пробирку встряхиваем, чтобы хлороформ или эфир, пришли в достаточное соприкосновение с раствором краски. Эфир или хлороформ экстрагируют азур и окрашиваются им в вишнево-красный цвет. По интенсивности окраски судят о наличии азура в красителе, и приблизительном его количестве в испытуемом растворе. Краска с малым количеством азура окрасит хлороформ или эфир в бледный фиолетово-розовый цвет, если азур в краске отсутствует; цвет эфира или хлороформа не изменится. Пользоваться такой краской для окрашивания препаратов крови с малярийными паразитами нельзя. Краску с недостаточным содержанием количества азура можно использовать только после добавления краски Мэнсона. Пропись краски Мэнсона: Метиленовая синь - 1,5 г, бура - 2,5 г, дистиллированная вода - 100 мл. Приготовленный краситель должен созреть 12-14 дней при температуре 18-20 С или 3 дня в термостате при температуре 37 С. В водяной бане при 60 С краска созревает в течение 1 часа. Хранить ее следует в шкафу, при комнатной температуре в сосуде с притёртой пробкой до полного использования. К водному рабочему раствору краски Романовского-Гимза нужно добавить краски Мэнсона из расчёта 1-2 капли на 10 мл. Способ Машковского Берут метиленового синего 1 г, буры 2,5 г, дистиллированной воды 100 мл. Краситель и буру растирают в ступке и затем растворяют в воде, раствор кипятят в течение 30 мин, фильтруют. Для окраски препаратов из основного раствора готовят рабочий раствор 1:10 на дистиллированной воде (раствор N1). Раствор N2 представляет собой 5% раствор. Чтобы раствор не плесневел к нему добавляют небольшое количество тимола. Тонкие мазки фиксированные, высушенные на воздухе, погружают в раствор N1 на 30 с. – 1 мин. Затем их ополаскивают в дистиллированной воде, снова ополаскивают в воде, высушивают на воздухе и исследуют. При этом способе окраски эритроциты окрашиваются, в розовый цвет, ядра лейкоцитов - в фиолетовый, цитоплазма паразитов - в голубой, ядра паразитов у молодых стадий - в красный, у более взрослых - в бледнорозовый цвет. Толстая капля: Хорошо размазанную, высушенную на воздухе толстую каплю (она не должна быть слишком толстой), погружают в раствор N1 на 10 мин, препарат промывают в дистиллированной воде, погружают в раствор N2 на В-10 с, снова промывают в воде. Высушивают на воздухе и исследуют. В окрашенных этим способом толстых каплях ядра лейкоцитов фиолетовосиние, цитоплазма паразитов - синяя, ядра у молодых стадий паразитов - темно-красные, у более взрослых - бледно-розовые. Если препарат не окрасился, то на 3-5 мин снова погружают в раствор N1, промывают в дистиллированной воде, погружают в раствор N2 на 8-10 с. Промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Если приходится окрашивать старую каплю или очень толстую, то на высохшую каплю наливают каплю дистиллированной воды, от которой гемоглобин растворяется. Окрашенную воду сливают с препарата, смывают его осторожно водой, после чего препарат становится синевато-белый. Окрашивают затем обычным раствором краски 40-60 мин. Рабочий раствор краски Романовского: 1-2 капли основного товарного раствора Романовского на 1 мл воды. Способ Шуренковой Растворяют отдельно 1 г метиленового синего в 15 мл кипяченой воды и 1,5 г марганцевого кислого натрия в 75 мл кипяченой воды и обе жидкости сливают в колбу, при этом получается осадок. Колбу помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в ней 20 мин, считая от повторного закипания воды, охладившейся от погружения в нее колбы. После остывания раствор фильтруют. Окрашивание толстых капель и мазков производится последовательно в двух рабочих растворах - 1 и 2. МАТЕРИАЛ И ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПРИ КРИПТОСПОРИДИО3Е Сбор материала Материал от больных (фекалии) собирают в сухую, чистую, хорошо укупоренную тару (стерильность не нужна) и доставляют в лабораторию. Ооцисты долго сохраняются в кале, поэтому промежуток времени между забором материала и его исследованием определяется скорее сроками протухания фекалии и неэстетичностыо дальнейшей работы с ним. Если предполагается длительное хранение материала, в частности фекалий, то используют консерванты (10% формалин; жидкость Барбагалло; 2,5% раствор, бихромата калия и др.). Консервант и фекалии берут в соотношении 2:1 и хорошо перемешивают. Хранят при температуре +4 С. Следует помнить, что ооцисты в 2,5% бихромата калия сохраняют жизнеспособность в течение одного года. Окрашивание карболовым фуксином по Цилю-Нильсену Состав раствора: фуксин основной - 2 г, 96% этиловый спирт - 12 мл, фенол - 5 мл, дистиллированная вода - до 100 мл (фуксин растворить в спирте, фенол - в воде, затем слить вместе). Фиксированный мазок быстро провести 3-5 раз над пламенем горелки. Окрашивать раствором карбол-фуксина 5-20 минут. Промыть мазок водопроводной водой, обесцветить 7% (5-10%) раствором серной кислоты 20-60 с, промыть в воде и подкрасить 5 минут 5% раствором малахитового зеленого в 10% этиловом спирте, или 0,2% водным раствором метиленового синего. Промыть в воде, тщательно высушить на воздухе. Результаты: Ооцисты криптосперидии окрашиваются в разные оттенки ярко-красного цвета и имеют вид округлых образований диаметром до 5 мкм. Внутри некоторых ооцист удается рассмотреть удлиненные спорозойды. Сопутствующая микрофлора окрашивается в зеленые тона. Примечания: В красный цвет могут окрашиваться капли жироподобных веществ и гранулы детрита. Даже при случайном сходстве по размерам эти образования легко отличить от ооцист криптоспоридий по отсутствию у них отчетливой оболочки и какого-либо структурированного содержимого внутри. В сомнительных случаях серийные мазки следует окрасить иным методом. При необходимости можно уменьшить концентрацию малахитового зеленого. Это подбирается опытным путем. Окрашивание по Цилю-Нильсену можно производить и без предварительной фиксации мазков. Данный метод считается одним из наиболее информативных и надежных для выявления ооцист криптоспоридий. Краска не выцветает много месяцев. Окрашивание сафранином по Кестеру Мазок, высушенный на воздухе, фиксировать в смеси Никифорова, снова высушить при комнатной температуре. Фиксировать над пламенем горелки. Окрашивать в растворе сафранина 5 мин (водный насыщенный раствор сафранина - 2 части, 5,6% раствор КОН - 5 частей). После ополаскивания водой дифференцировать 10 с в 0,1% растворе серной кислоты, промыть в воде и окрашивать в 5% растворе малахитового зеленого 10-15 с. Промыть в воде, тщательно высушить на воздухе и исследовать под микроскопом с иммерсией. Результаты: Ооцисты криптоспоридии окрашиваются в бледнорозовый цвет и хорошо выделяются на зеленом фоне. Другие микроорганизмы не окрашиваются сафранином. Примечания: Этот метод считается одним из наиболее точных при выявлении ооцист криптрспоридий. Он позволяя наиболее отчетливо видеть внутреннее содержимое ооцист (спорозоиты). Краска нестабильна, препараты быстро выцветают. Окрашивание азур-эозином по Романовскому - Гимзе Этот широкораспространенный метод окрашивания мазков крови может быть успешно применен и при выявлении ооцист криптоспоридий. В ряде случаев он весьма информативен, поскольку при адекватной предварительной подготовке мазка краситель проникает внутрь ооцисты и окрашивает спорозоиты. Мазок, фиксированный смесью Никифорова и тщательно высушенный на воздухе, быстро провести над пламенем горелки (3-5 быстрых движений). Окрашивать 10% раствором красителя, от 10 до 35-40 мин. Тщательно промыть в воде (лучше в проточной водопроводной), высушить на воздухе (можно в струе холодного воздуха под феном) и исследовать под микроскопом с иммерсионной системой. Результаты: Ооцисты криптоспоридий имеют вид неокрашенных или слабоокрашенных округлых образований диаметром до 5 мкм. Внутри некоторых ооцист удается рассмотреть бледно-голубые удлиненные и слегка изогнутые тельца (спорозоиты) с красноватыми гранулами внутри. Спорозоиты располагаются по периферии ооцисты, оставляя ее центральную часть пустой. Примечание: Идентификация ооцйст затруднена в связи с тем, что другие микроорганизмы кишечника также окрашиваются азур-эозином, причем значительно интенсивнее ооцист. В связи с этим необходимо делать тонкие мазки, в которых наложение микрофлоры "экранировало" бы последние от наблюдателя. Окрашенные препараты не выцветают в течение многих месяцев. Метод флюоресцентного окрашивания Толстые мазки свежих фекалий высушить на воздухе, провести через раствор азурамива с фенолом, промыть водой и быстро окрасить (5-10 мин) в растворе карболового фуксина. После промывания водой, высушить на воздухе и исследовать с помощью люминесцентного микроскопа, лучше с иммерсионной системой. Результаты: Ооцисты криптоспоридий имеют вид ярко флуоресцирующих дисков, отчетливо заметных на темно-красном фоне. МАТЕРИАЛ И ВИДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ ПРИ ПНЕВМОЦИСТОЗЕ Сбор материала Существует несколько методов забора материала. У детей основными являются 4 метода: прямая ларингоскопия (большой процент выявляемости пневмоцист); после кашля, вызванного нажатием шпателем на корень языка; при откашливании после паровой ингаляции с 2-3% солевым раствором (наибольший процент положительных находок); обычный мазок из зева. У взрослых - сбор мокроты в течение суток; при откашливании после паровой ингаляции; аспирация слизи из бронхов при бронхоскопии; получение лаважной жидкости при проведении бронхоальвеолярного лаважа (этот метод наиболее эффективен). Материал от больных отбирают в сухую, хорошо закупоренную посуду и доставляют в лабораторию, где его разводят физиологическим раствором в 3-10 раз. Материал рекомендуется исследовать сразу же, а при невозможности исследуют после хранения в холодильнике в течение нескольких часов. Приготовление мазка Доставленную мокроту или лаважную жидкость центрифугируют в течение 15-20 мин при скорости 2000 об/мин. Пастеровской пипеткой аспирируют надосадочную жидкость, а седимент переносят в чистую центрифужную пробирку, перемешивают и используют для приготовления мазка. Каплю седимента наносят на предметное стекло, отступив от правого края и быстрым равномерном движением распределяют материал по предметному стеклу. Правильно сделанный мазок должен быть тонким и не занимать все предметное стекло. От одного больного следует изготовить 5-7 препаратов для проведения окраски различными методами. Мазки высушивают на воздухе, а затем фиксируют так, как предусмотрено методом окраски. Чаще всего используется "горячая фиксация" - в пламени горелки 3-5 движений или в метаноле - 5-10 мин. Общий вид окрашенных препаратов под микроскопом Выделяют 3 морфологические формы возбудителя, которые идентифицируют в световом микроскопе. Цисты - приближаются к размерам эритроцита (6-7 мкм) и имеют сферическую или серповидную форму с нечетко различаемой клеточной стенкой. Внутрицистные образования, называемые спорозоитами, имеют меньшие размеры (1-2 мкм). В одной цисте можно увидеть до 8 спорозоитов, располагающихся по кругу как цветок. 3-я форма - трофозоиты, которые имеют эксцентрично расположенное ядро, диаметром 2-5 мкм, их часто находят сдвоенными в исследуемом материале. Основные методы окраски Существует 2 основные группы красителей, используемых в лабораторной диагностике пневмоцистоза - окрашивающие клеточную стенку без четкой дифференцировки клеточных элементов и окрашивающие клеточные структуры с нечеткой диффёренцировкой клеточной стенки. К первой группе относится метенамин серебра (окраска по Гомори-Грохотту) и толуидиновый синий. Ко второй группе относятся - азур-эозин, реактив Шиффа, кристаллический фиолетовый, акридин оранжевый. Окраска акридином оранжевым является селективной для трофозоитов, так как прокрашивает лишь эту форму без окраски цист. Можно использовать сочетание окрасок по Романовскому-Гимза и акридином оранжевым для идентификации всей форм возбудителя пневмоцистоза. Окрашивание азуром - эозином по Романовскому-Гимзе Мазок, высушенный на воздухе, быстро проводят над пламенем горелки. Использует следующий состав краски: на 1 мл буферной воды рН 7,2 1-2 капли краски Романовского. Мазок следует окрашивать не менее 45 50 мин. Промыть в проточной водопроводной воде, высушить на воздухе, или можно в струе холодного воздуха под феном, и исследовать под микроскопом с иммерсионной системой. Результат: Трофозоиты приобретают голубоватую цитоплазму с розовым ядром, спорозоиты фиолетовое ядро. Клеточная стенка не визуализируется. Окрашивание кристаллическим фиолетовым Мазок высушивается на воздухе, фиксируется в пламени горелки, окрашивается в течение 1-2 мин 1% водным раствором кристаллического фиолетового. Смыть краску 20% водным раствором медного купороса. Высушить в вертикальном положении и исследовать под иммерсией. Результат: Определяется слабо-голубое свечение цитоплазмы в отличие от темно-фиолетово-черных ядер. Сравните между собой препараты, окрашенные по этим двум методам. Окраска по Шиффу Она основана на выявлении содержащихся в клетке углеводов, в частности гликогена. Клеточная стенка пневмоцист имеет в своём составе гликопротеиды. Окраска по Шиффу проводится следующим образом: Мазки, высушенные на воздухе, фиксируется 10 мин в фиксаторе формалин и спирт (9:1). Затем препараты окисляют в 1% растворе йодной кислоты 4-5 мин при комнатной температуре. Промывают мазки водопроводной водой в дважды сменяемой воде по 5 мин. Споласкивают дистиллированной водой. Обрабатывают мазок реактивом Шиффа в темноте 30-40 мин. Мазки из реактива Шиффа непосредственно переносят в сернистую воду, при этом никогда не споласкивая водой. Ополаскивание сернистой водой проводится троекратно по 2 мин. Затем мазки промывают водопроводной водой в течение 10 мин, и также споласкивают дистиллированной водой. Для лучшего контрастирования ядер и цитоплазмы, содержащей гранулы гликогена, мазки следует докрашивать одним из ядерных красителей, в частности, гематоксилином. Результат: Цитоплазма цист слабо или интенсивно розовая, ядро синевато-фиолетовое. Приготовление сернистой воды: 10 мл 10% раствора метабисульфита калия или натрия прибавить 200 мл дистиллированной воды и 10 мл раствора соляной кислоты. 10% раствор метабисульфита можно применять в течение недели, но сернистая вода может быть использована только в день приготовления. Приготовление реактива Шиффа: В 20 мл кипящей дистиллированной воде растворяют 1 г основного фуксина. Раствор кипятят в течение 5 мин, затем остужают до 50 С, после чего фильтруют и к фильтрату добавляют 20 мл 1 Н соляной кислоты. Затем охлаждают раствор до 25 С и прибавляют 1 г метабисульфита калия или натрия. Раствор оставляют в темноте в течение 1 суток, после чего взбалтывают, добавляют 1г растолченного активированного угля, фильтруют и хранят в холодильнике. Приготовленный реактив можно иногда использовать в течение полугода. Если цвет реактива от светло-коричневого сменяется на розовый, то он не пригоден к дальнейшему использованию. Приготовление раствора гематоксилина: 1) 8г железоаммиачных квасцов растворяют в 100 мл дистиллированной воды;. 2) 1 г гематокислина растворяют в 100 мл теплой дистиллированной воды и охлаждают. Затем первый раствор, постоянно взбалтывая, приливают ко второму. Смесь кипятят одну минуту, охлаждают и прибавляют 1% раствор ледяной уксусной кислоты. Время окрашивания – 1 мин, затем промывка водопроводной водой. Окрашивание акридином оранжевым Акридин оранжевый - флюорохром, который окрашивает нуклеиновые кислоты, поэтому может быть использован для окраски кровяных паразитов, включая малярийного плазмодия. Предложено использование красителя в диагностике пневмоцистоза. Приготовление реактива: 100 мг акридина оранжевого растворяют, в 100 мл дистиллированной воды. Приготовленный раствор может храниться при комнатной температуре, в темноте в течение года. Рабочий раствор готовится, при разведении основного раствора в 10-100 раз. Мазки высушиваются на воздухе, затем фиксируются в абсолютном метаноле в течение 2 мин (абсолютный метанол получают обезвоживанием с помощью окиси кальция и последующей дистилляцией). Стекла окрашивают в течение 10 мин. Краситель смывается дистиллированной водой, препараты высушиваются и исследуются с иммерсией В течение 20 мин. В случае негативного результата мазок исследуется с помощью флюоресцентного микроскопа. Результат: Трофозоиты окрашиваются в желтый или оранжевый цвет, цисты не окрашиваются. Окраска по Гомори-Грохотту Этот метод является наиболее чувствительным. При нем окрашивается клеточная стенка, четко контрастирующая с окружающим фоном. Внутри цист определяются спорозойты, известные как «кавычки», которые характерны для возбудителя пневмоцистоза. С помощью краски Гомори можно окрашивать дрожжевые грибы, которые иногда с трудом отличимы от пневмоцист, но наличие двойной капсулы почек и отсутствиё "кавычек" у дрожжевых грибов помогают в дифференцировке. Препараты фиксируются в 10% формалине в течение 5 мин, смываются дистиллированной водой. Затем в подогретый до 65 С в лабораторном стакане 5% раствор хромовой кислоты быстро погружают стекла на 1 мин и смывают дистиллированной водой, после чего опускают стекла в 1% раствор метабисульфита калия или натрия на 1 мин. Наливают раствор серебра в 100 мл лабораторный стакан и подогревают до 90-95 С до тех пор, пока образцы не станут светло-коричневыми, а раствор - темно- или светло-сёрым (обычно 2-3 мин). После этого прополаскивают препараты в трех сменах дистиллированной воды, опускают мазки в 0,2% раствор хлорного золота на 1 мин, смывают дистиллированной водой. Погружают стекла в 2% водный раствор тиосульфата натрия на 1 мин, вновь смывают дистиллированной водой. Окрашивают препарат раствором лихтгрюна зеленого (0,02 г лихтгрюна зеленого, 100 мл дистиллированной воды и 5 капель ледяной уксусной кислоты) в течение 5 мин, смывают дистиллированной водой. Приготовляется рабочий раствор серебра: 25 мл раствора метенамина серебра (100 мл 3% водного раствора уротропина или метенамина и 5 мл 5% водного раствора нитрата серебра), 25 мл дистиллированной воды, 2 мл 5% водного раствора тетрабората натрия и 15 мл диметилсульфоксида. Следует, помнить, что все реактивы и красители могут работать несколько месяцев, а рабочий раствор серебра готовится непосредственно перед применением. Результаты: Цисты коричневые, часто с серой цитоплазмой, внутри них структуры, напоминающие "запятую" или "кавычки". Все тканевые элементы окрашиваются в зеленый или зелено-желтый цвет. МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ ВКЛЮЧЕНИЙ Chlamidia trachomatis В ПАТОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Включения выявляются с Chlamidia trachomatis помощью в патологическом культуральных, материале иммунофлюоресцентных, цитоморфологических методов диагностики. Первые две группы методов не имеют широкого клинического применения ввиду их сложности; высокой стоимости, необходимости специального оснащения, наличия культуральных сред и диагностикумов, промышленный выпуск которых еще не налажен. Среди цитоморфологичёских методов диагностики хламидийной инфекции распространение получил только классический метод окраски по Романовскому-Гимза. Информативность его при обнаружении специфических включений хламидий не превышает 26-30%. Окрашенные в розовато-фиолетовый цвет включения возбудителя сложно дифференцировать на общем сине-голубом фоне ядер, и цитоплазмы эпителиальных клеток, что затрудняет их обнаружение и учет. В 1982 году Woodland предложил способ окраски цитологических препаратов смесью красителей метилового зеленого и нейтрального красного. В лаборатории микробиологии и вирусологии Киевского НИИ урологии и нефрологии опробовал этот метод при изучении соскобных препаратов 60 больных с различной урогенитальной патологией. Специфические включения хламидий обнаружены у 10 (17%) больных, а по методу Романовского-Гимза информативности двух - только способов у окраски 7 все (12%). Для больные сравнения параллельно обследованы с помощью высокоспецифичного иммунофлюоресцентного метода (ПИФ). Специфическая флюоресценция наблюдалась в препаратах 12 (20%) больных. Таким образом, метод окраски по Woodland лишь немногим уступает по информативности ПИФ-методу. Присутствие значительных количеств слизи в соскобных препаратах затрудняет проникновение красителей в клетки и не позволяет добиться четкого дифференциального прокрашивания составных частей клетки и специфических включений Chlamidia. Для устранения недостатков метода предлагаем модификаций метода Wooldland, заключающуюся в дополнительном всечений в окрашиваемую смесь диметилсульфоксида (ДМСО), который, являясь универсальным проводником, способствует проникновению через биологические мембраны различных соединений, в том числе и красителей. Качество окраски также значительно, улучшается при инкубировании препаратов не при комнатной температуре, как общепринято, а в термостате при 37 С. Вариант окраски препаратов. Соскобы слизистых оболочек (уретры, цервикального канала и т.п.), полученные с помощью ложки Фолькмана, распределяют на поверхности хорошо обезжиренных предметных стекол, высушивают споласкивают на воздухе фиксируют дистиллированной водой метанолом в в течение течение 10 мин 10 мин, и снова высушивают. Окрашивающую смесь - 9 частей 1% раствора метилового зеленого, предварительно отмытого хлороформом, 1 часть нейтрального красного готовят ex temporae. Добавляют на каждый 1 мл готовой смеси красителей по 0,1 мл 0,5% раствора ДМСО. Затем препараты с нанесенной окрашивающей смесью инкубируют 10-15 мин в термостате при 37 С. Ополаскивают дистиллированной водой. Высушивают и микроскопируют под масляной иммерсией. Включения Chlamidia, окрашенные в ярко-розовый цвет, отчетливо видны на фоне зеленых ядер и серо-розовой цитоплазмы эпителиальных клеток. Это облегчает их выявление и учет.
