Генетика человека 2015 - Новгородский государственный
реклама
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого» В. М. Кондратьева Н. Н. Максимюк МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА Учебно-методическое пособие Великий Новгород 2015 2 ББК 28.04я72 решению М 18 Печатается по РИС НовГУ Рецензент кандидат медицинских наук …… Кондратьева В. М., Максимюк Н. Н. М 18 Методы изучения генетики человека: учебно-метод. пособие / В. М. Кондратьева, Н. Н. Максимюк: НовГУ имени Ярослава Мудрого. Великий Новгород, 2015. – 55 с. В пособии представлена характеристика основных методов генетики человека. Даны методические рекомендации, приведены задания для аудиторной работы и СРС и сформулированы вопросы для самоконтроля, которые помогут в эффективном изучении методов генетики человека. Предназначено для студентов первого курса медицинских специальностей, направления «Биология» и направления «Учитель биологии и химии». ББК 28.04я72 © Новгородский государственный университет, 2015 ©Кондратьева В.М., Максимюк Н.Н., составление 2015 3 ВВЕДЕНИЕ Человек, как вид, имеет ряд особенностей, требующих для изучения его генетики разработки и применения специальных методов. К таким особенностям относятся: биосоциальная сущность человека, не разрешающая применение классического гибридологического метода генетического анализа, низкая плодовитость, редкая смена поколений, происходящая в среднем через 25–30 лет, наличие в геноме большого числа групп сцепления (23 у женщин и 24 у мужчин), полигенный характер наследования и невозможность стандартизации условий среды, в которых осуществляется экспрессия этих генов. Человек, как объект генетических исследований, имеет и преимущества: - большое количество популяций с различной численностью; - социальный характер человека; - человек лучше других объектов изучен клинически; - высокая степень изученности его фенотипа методами морфологии, физиологии, биохимии, иммунологии, клиники. Для изучения генетики человека разработаны и успешно используются следующие методы: генеалогический (метод родословных), популяционно-статистический, близнецовый, дерматоглифики и пальмоскопии, цитогенетический, биохимический, молекулярногенетический и метод генетики соматических клеток. На основании совокупности методов генетики человека основаны пренатальная диагностика наследственных заболеваний и медико-генетическое консультирование. Для формулировки научно обоснованных выводов о наследственном и ненаследственном характере признаков, о характере модификационной изменчивости большое значение имеют и биометрические методы анализа качественных и количественных признаков. 4 1. ГЕНЕАЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Генеалогический метод был предложен в 1865 году Ф. Гальтоном. Метод основан на прослеживании интересующего нас признака (нормального или патологического) в семье, с указанием родственных связей между отдельными членами родословной этой семьи. С помощью этого метода преодолеваются барьеры невозможности скрещивания и малоплодности человека. В медицинской генетике, изучающей роль генетических составляющих в этиологии и патогенезе различных заболеваний человека, генеалогический метод называют клиникогенеалогическим. Генеалогический метод дает возможность: - выявлять наследственный характер признака; - определять тип наследования; - определять зиготность членов родословной; - определять особенности взаимодействия генов; - устанавливать сцепленное наследование при составлении родословных по разным признакам и проводить картирование хромосом; - определять пенетрантность, экспрессивность гена и норму реакции; - изучать закономерности мутирования отдельных генов; - устанавливать носительство мутантного гена тем или иным членом семьи; - определять вероятность генетически обусловленных событий и рассчитывать риск наследования патологического гена (признака) при медико-генетическом консультировании. Генеалогический метод часто осложняется невозможностью сбора достаточного количества информации из-за малодетности семей, либо изза прерывания связей между поколениями, отсутствия связей между родственниками, либо по морально-этическим причинам. Генеалогический метод лежит в основе медико-генетического консультирования и включает 3 этапа: 1 этап – клиническое обследование; 2 этап – составление родословной; 3 этап – генетический анализ родословной. Первый этап – клиническое обследование. При составлении родословной сбор сведений о семье начинается с человека, которого называют пробандом (обычно это больной с изучаемым заболеванием или признаком). В сведениях о пробанде указывается анамнез (от греч. anamnesis – воспоминание) заболевания, включающий начальные признаки и возраст их манифестации, последующее течение болезни; если пробанд – ребенок, то указываются сведения о раннем психомоторном и 5 последующим умственном и физическом развитии. Чем больше поколений удается проследить и чем более полно охватить членов родословной при сборе сведений, тем больше вероятность получения достоверной информации о характере наследования изучаемого признака. Сбор информации проводится путем опроса, анкетирования, личного собеседования. Опрос начинается обычно с родственников по материнской линии. В родословную вносят сведения о выкидышах, абортах, мертворожденных, бесплодных браках, внебрачных детях и др. При сборе информации о проявлении изучаемого признака ведется краткая запись данных о каждом члене рода с указанием его родства по отношению к пробанду. Обычно указывается фамилия (для женщин девичья фамилия), имя, отчество, дата рождения и смерти. Полученные данные записываются в медико-генетическую карту. При сборе информации необходимо внимательно анализировать сообщения об инфекциях и травмах, следует учитывать гетерогенность и варьирующую экспрессивность наследственных заболеваний. Необходимо выяснять акушерский анамнез, учитывать наличие и характер профессиональных вредностей, возраст, национальность, место жительства семьи, профессию, наличие хронических заболеваний в семье, причину смерти умерших и др. На основании изученных данных составляется анамнез, включающий совокупность медицинских сведений, получаемых путем опроса обследуемого, знающих его лиц. Второй этап – составление родословной. После сбора сведений составляется графическое изображение родословной, для этого используется система символов, предложенная в 1931 году Г. Юстом, (рис. 1). При составлении графического изображения родословной важно соблюдать следующие правила: Составление родословной начинают с пробанда. Братья и сестры (сибсы) располагаются в порядке рождения, слева направо, начиная со старшего, то есть время в родословных течет слева направо. 1. Все члены родословной располагаются строго по поколениям, в один ряд. 2. Поколения обозначаются римскими цифрами слева, сверху вниз. 3. Арабскими цифрами нумеруется потомство одного поколения (одного ряда) слева направо. Благодаря такой нумерации каждый член семьи имеет свой шифр, например: I-1, I-2, II-2, II-4 и др.. 4. Указывается возраст членов семьи (родословной), в связи с тем, что некоторые болезни проявляются в разные периоды жизни. 5. Отмечаются лично обследованные члены родословной. Графическое изображение родословной может быть вертикальногоризонтальным или расположенным по кругу (в случае многочисленных 6 данных). Схема родословной сопровождается описанием обозначений под рисунком (легендой). Третий этап – генетический анализ родословной. Генетический анализ родословной требует хороших знаний критериев установленных типов наследования. Задача генетического анализа – установление наследственного характера заболевания и типа наследования, выявление гетерозиготных носителей мутантного гена, установление генотипа пробанда и прогнозирование потомства. Анализ родословной рекомендуется проводить в следующей последовательности: 1. Установление, является ли данный признак (заболевание) наследственным. Если признак встречается несколько раз в разных поколениях (имеет семейный характер), то можно предполагать, что признак имеет наследственную природу. 2. Определение типа наследования признака. Для этого учитывают: – во всех ли поколениях и как часто в родословной встречается признак; – одинакова ли частота признака у обоих полов, у какого пола встречается чаще; – детям какого пола передается признак от больного отца и от больной матери; – есть ли семьи, в которых от больных родителей рождаются здоровые дети, или от здоровых родителей рождаются больные дети; – какая часть потомства имеет наследуемый признак в семьях, где болен один из родителей. У человека установлены типы наследования, подчиняющиеся закономерностям наследования, установленным Г. Менделем, их называют болезни с традиционным типом наследования, и болезни с нетрадициоными типами наследования. К традиционному типу наследования относятся аутосомно-рецессивное наследование (АР) и аутосомно-доминантное наследование (АД). К болезням с нетрадиционными типами наследования относятся доминантное, сцепленное с Х хромосомой наследование (ХД), рецессивное, сцепленное с Х хромосомой наследование (ХР), сцепленное с Y хромосомой наследование (YН), митохондриальные болезни, болезни геномного импритинга, болезни экспансии тринуклеотидных повторов с явлением антиципации и др. 7 Рис. 1. Символы, используемые при составлении родословных. (Из: В.А. Иванов, 2006). В зависимости от типа наследования родословные выглядят поразному. Аутосомно-доминантный тип наследования (АД). При аутосомнодоминантном типе наследования мутантный ген локализован в аутосоме и проявляется в генотипах АА и Аа. Для этого типа наследования характерны: равная вероятность встречаемости данного признака, как у мужчин, так и у женщин. Признак прослеживается в каждом поколении по вертикали, признак передается одинаково от больных родителей (как матери, так и отца) к детям; у здоровых родителей рождается здоровое потомство; у больных родителей может рождаться здоровое потомство. 8 При доминантном наследовании патологического признака гомозиготы, как правило, нежизнеспособны, а гетерозиготы являются носителями этого признака. Пенетрантность доминантной аллели может быть полной и неполной (рис. 2). По АД типу наследуются: полидактилия (шестипалость), брахидактилия (короткопалость), ахондроплазия (карликовость), синдром Марфана (паучьи пальцы), ангиоматоз сетчатой оболочки, метгемоглобинемия (гемоглобины Бостон, Чикаго), аниридия, глаукома, синдром Ван дер Хеве, врожденный вывих бедра, гиперхолестеринемия, глухонемота (некоторые формы), нейрофиброматоз, подагра, анемия серповидно-клеточная (АД тип с неполным доминированием), ахондроплазия и др. Рис. 2. Родословная семьи с наследованием серповидноклеточности и серповидноклеточной анемии. (Из: В.А. Накаряков, О.Б. Гигани, О.О. Гигани, 2004). Аутосомно-рецессивный тип наследования (АР). При АР типе наследования мутантный ген проявляет свое действие только в 9 гомозиготном состоянии (аа). Заболевание (признак) встречается в родословных редко и не во всех поколениях, при этом вероятность заболевания у мальчиков и девочек одинакова (рис. 3). Рис. 3. Родословная при АР типе наследования (псевдогипертрофическая прогрессирующая миопатия). (Из: В.Н. Ярыгин, 2007) Признак может появиться у детей, родители которых здоровы и являлись гетерозиготными носителями мутантного гена. Рецессивный признак от родителей, как от отца, так и от матери, передается одинаково. Вероятность появления рецессивного потомства возрастает в близкородственных браках, где оба родителя могут быть носителями одного и того же рецессивной аллели, полученного от общего предка. По АР типу наследуются: многие болезни обмена веществ, среди которых фенилкетонурия (ФКУ), галактоземия, альбинизм, муковисцидоз, акаталазия, алькаптонурия, гидроцефалия, болезнь Вильсона (гепатоцеребральная дистрофия), цистинурия, болезнь Тея-Сакс и др. Х - сцепленное рецессивное наследование (ХР). ХР тип наследования характеризуется следующими особенностями: мутантный ген локализован в Х хромосоме и проявляется в генотипе ХаХа у женщин и ХаY у мужчин. - От здоровых родителей, если мать гетерозиготный носитель, могут родиться больные дети – мальчики; больные мужчины не передают заболевание своим сыновьям, но их дочери становятся гетерозиготными носителями болезни; 10 - Больные девочки могут родиться только в семьях, где отец болен, а мать гетерозиготна по мутантному гену (рис. 4). Рис. 4. Родословная семьи с наследованием гемофилии. (Из: В.А. Накаряков, О.Б. Гигани, О.О. Гигани, 2004). Характерной особенностью родословных при ХР наследовании является преимущественное проявление признака у гемизиготных (ХаY) мужчин, которые наследуют его от матерей-носителей рецессивной аллели. Как правило, признак наследуется мужчинами через поколение от деда по материнской линии к внуку. У женщин ХР признак проявляется лишь в гомозиготном состоянии, вероятность чего возрастает в близкородственных браках. По ХР типу наследуются: гемофилия А и В, дальтонизм, альбинизм, ангидрозная эктодермальная дисплазия, ангиокератома, ихтиоз врожденный (большинство форм ихтиоза летальны), пигментный ретинит (ХР форма), прогрессирующая мышечная дистрофия ДюшенаБеккера, синдром тестикулярной феминизации и др. Х- сцепленное доминантное наследование (ХД). ХД тип наследования характеризуется следующими признаками: - доминантная мутантная аллель локализована в Х хромосоме и может проявляться как в гомозиготном (ХАХА), в гетерозиготном (ХАХа), так и в гемизиготном (ХАY) состоянии; - лица с генотипом ХАХА, ХАХа, ХАY – больны, с генотипом ХаХа, ХаY – здоровы; - болеют как мужчины, так и женщины, однако больных женщин вдвое больше, чем мужчин; - заболевание проявляется в каждом поколении; - если болен отец, то все его дочери будут больны, а сыновья здоровы; 11 - если мать больна, то вероятность рождения больного ребенка 50%, независимо от пола. - больными будут дети только тогда, когда болен один из родителей; - у здоровых родителей все дети будут здоровы (рис. 5). Рис. 5. Родословная семьи с наследованием дефекта зубной эмали. (Из: В.А. Накаряков, О.Б. Гигани, О.О. Гигани, 2004). При анализе родословных в ряде случаев очень трудно отличить Хсцепленный доминантный тип от аутосомно-доминантного типа наследования. Наиболее информативны те семьи, в которых передача заболевания происходит через больных отцов. В этом случае наблюдается избирательное поражение потомков женского пола – все дочери таких больных отцов заболевают, т.к. получат от отца Х-хромосому, несущую патологический ген, а все сыновья будут здоровы, т.к. унаследуют от отца Y-хромосому. Х-сцепленный доминантный тип наследования встречается крайне редко. При некоторых заболеваниях наблюдается гибель гемизиготных мужчин (ХАУ) на ранних стадиях развития; в родословных при этом типе заболевания пораженными должны быть только женщины. По ХД типу наследуются: фолликулярный кератоз, фосфатемия, коричневая окраска эмали зубов, маторно-сенсорная нейропатия 1 Х-типа (ОМIМ: 302800). Y- сцепленный (галандрический) тип наследования (YН). Данный тип наследования характеризуется только прямой передачей признака от отца к сыну. В настоящее время идентифицировано около 100 генов, локализованных в Y-хромосоме. Большинство из них обусловливают развитие организма по мужскому типу, участвуют в сперматогенезе, в 12 контроле роста тела и зубов. Мутации в некоторых генах приводят к развитию рака яичек, простаты и другим гонадопластомам. Все гены Y-хромосомы делятся на 3 группы: 1. Гены псевдоаутосомных областей, идентичные в Х и Y-хромосомах. Мутации в генах этой группы нарушают конъюгацию половых хромосом в мейозе у мужчин, приводят к бесплодию. 2. Группа включает 10 Х и Y гомологичных генов, локализованных в некомбинирующих областях Yp иYq. Эти гены экспрессируются во многих тканях и органах, включая яички и простату. 3. Группа включает 11 Y-специфичных генов, располагающихся в некомбинирующих областях Yp и Yq. Продукты этих генов могут играть роль транскрипционных факторов и цитокининовых рецепторов, выполнять функции протеинкиназ и фосфатаз. Некоторые из этих генов формируют AZF-регион, микроделеции в котором часто приводят к мужскому бесплодию: азоспермии и олигоспермии. Y-сцепленные заболевания, как правило, возникают вследствие мутаций de novo. Мальчики, которые получили от своего отца мутацию, нарушающую развитие и функционирование мужских гонад, оказываются стерильными и не могут передать ее своему потомству, поэтому родословные с этим признаком являются неинформативными. В целом, Y хромосома характеризуется высокой нестабильностью, вследствие наличия большого числа различных повторов, мобильных генетических элементов, аберрантной рекомбинации между гомологичными областями Х и Y хромосом или несбалансированного обмена между сестринскими хроматидами Y хромосомы. По УН наследуются гипертрихоз, синдиктилия. У человека все более изученными становятся заболевания митохондриальные, болезни геномного импринтинга и болезни экспансии тринуклеотидных повторов с явлением антиципации и др. Митохондриальные болезни – это группа наследственных заболеваний, обусловленных мутациями митохондриальной ДНК (мтДНК), либо мутациями ядерных генов, которые контролируют синтез белков, участвующих в процессе окислительного фосфорилирования. При мутациях в ядерных генах отклонения от менделеевских типов наследования не происходит, а при мутациях в митохондриальном геноме отклонение от Менделевских законов является типичным. Митохондриальные болезни обусловлены нарушением: β-окисления жирных кислот, включая карнитиновый цикл; метаболизма пирувата и цикла трикарбоновых кислот; процессов окислительного фосфорилирования и др. Все митохондрии человека имеют материнское происхождение и получены человеком с яйцеклеткой. При наличии мутации в том или ином количестве митохондрий яйцеклетка может передать их своим детям обоего пола. Скорость мутаций в мтДНК в 17 13 раз выше, что обусловливает высокую частоту спорадических случаев митохондриальных заболеваний. Клинические проявления митохондриальных заболеваний характеризуются задержкой физического развития, дисфункцией щитовидной железы, печеночной недостаточностью, миопатиями и кардиомиопатиями др. Под генетическим импринтингом понимают эпигенетический процесс, приводящий к стойким функциональным различиям экспрессии гомологичных генов, полученных от одного из родителей. Так, например, в настоящее время хорошо известно влияние ряда отцовских и материнских генов на вес плода, степень развития плаценты и другие особенности внутриутробного развития. Наличие генов, подверженных импринтингу, четко установлено для хромосом 7, 11, 15. Предполагают, что такие гены присутствуют и в хромосомах 2, 3, 6, 14 и 20. В настоящее время идентифицировано не менее 30 импринтированных генов, часто группирующихся в кластеры, по некоторым данным, таких генов в геноме человека насчитывается не менее 100. Болезни тринуклеотидных повторов с явлением антиципации. Феномен тринуклеотидных повторов объясняется наличие большего числа, по сравнению с нормой, определенных тринуклеотидов. Так, в гене, локализованном в области хромосомы 4р16.3, тринуклеотидный повтор CAG в норме составляет 11–34, а при Хорее Гентингтона тринуклеотидных повторов CAG насчитывается более 42; при синдроме ломкой Х-хромосомы (F RAXA) в гене Хр27.3 число тринуклеотидных поторов CGG более 200, при норме 5–50; при миотонической дистрофии в гене 19q13.3 тринуклеотидный повтор CTG представлен 50–1600 копиями, а в нормальном гене 5–27. Генетическая антиципация это более раннее проявление и возрастание тяжести симптомов наследственного заболевания в последующих поколениях родословной. Так, при синдроме ломкой Х хромосомы наблюдается четкая связь между числом тринуклеотидных повторов и тяжестью клинических проявлений заболевания с цитологической экспрессией ломкости Х хромосомы. Феномен антиципации выражается и в более тяжелом проявлении заболевания в последующих поколениях. Пенетрантность и экспрессивность. Термины предложены В.Н. Тимофеевым-Рессовским. В процессе онтогенеза не все гены реализуются в признак. Некоторые из них оказываются блокированными другими неаллельными генами, проявлению некоторых признаков не способствуют внешние условия. Пробиваемость гена в признак называется пенетрантностью. Пенетрантность отражает частоту фенотипического проявления имеющейся в генотипе генетической информации. Пенетрантность выражается в процентах особей, у которых анализируемая аллель фенотипически проявляется. Пенетрантность может быть полной (100%) и неполной ( 100%), иметь различные значения в разных семьях. 14 При анализе родословной и составлении генетического прогноза необходимо учитывать значение пенетрантности, установленное для данного признака. Например: 1.Арахнодактилия наследуется как АД признак с пенетрантностью 30%. Это значит, что среди лиц с генотипами АА и Аа 70% будут здоровы, а 30% – больны. 2.Среди некоторых форм шизофрении АД типа у гомозигот (АА) пенетрантность полная (100%), а у гетерозигот (Аа) – 20%. 3.Падагра наследуется по АД типу. Пенетрантность гена у мужчин составляет 20%, а у женщин 0%. Фенотипическое проявление наследственной информации характеризуется показателем, который называется экспрессивность. Экспрессивность характеризует степень выраженности признака и зависит как от дозы соответствующей аллели гена, так и от факторов среды. ЗАДАНИЕ 1. Изучите конспекты лекций и литературу по данной теме, выпишите в тетрадь новые для Вас термины и понятия. 2. Зарисуйте в тетради систему символов по Г. Юсту. 3. Изучите особенности родословных с различными типами наследования АД, АР, ХД, ХР, YН. Зарисуйте в тетради родословные с разными типами наследования и проведите их анализ (рис. 2–5). 4.Решите следующие задания: 4.1.Как можно объяснить появление детей с I (0) группой крови в семье, где у отца I (0) группа крови, а у матери IV (АВ) группа. Напишите схему решения задачи. Как называется данный феномен, в чем его сущность? 4.2.У человека доминантный ген обладает плейотропным действием и вызывает развитие голубой склеры (пенетрантность 100%), хрупкость костей (пенетрантность 63%) и глухоту (пенетрантность 60%). Какое потомство можно ожидать в семье гетерозиготных кареглазых родителей с нормальной склерой, хрупкими костями и с нормальным слухом? Какое потомство можно ожидать от мужчины с нормальными признаками и глухой женщины? Рассмотрите все возможные варианты генотипов. 4.3.Как можно объяснить появление различного числа и длины пальцев при полидактилии? 5. Запишите в тетрадь и выучите примеры заболеваний с разными типами наследования и их клиническое проявление. 6. Постройте родословную своей семьи. Оформите работу в соответствии с планом: 15 6.1. Название: Родословная моей семьи. Изучение наследования _______ (назовите изучаемый признак). 6.2. Анамнез (составьте анамнез). 6.3. Условные обозначения по Г. Юсту (приведите все условные обозначения, которые используются в данном методе, рис. 6). 6.4. Схема родословной (с общепринятой нумерацией поколений и каждого члена родословной). Под схемой родословной не забудьте привести использованные Вами символы (легенду). 6.5. Анализ родословной, обоснование установленного типа наследования. 6.6. Генетический прогноз. Для этого установите возможные генотипы родственников пробанда и самого пробанда. Постройте генетический прогноз для потомства пробанда. 6.7. Примеры болезней с таким же типом наследования. 6.8. Список использованной литературы. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Что изучает генеалогический метод. 2. Каковы возможности и недостатки генеалогического метода. 3. Как построить родословную. 4. Как провести генетический анализ родословной. 5. К каким типам наследования относятся наследственные болезни и признаки человека. 6. Как характеризуются родословные с разными типами наследования. 7. Объясните понятия пенетрантность и экспрессивность. 8.Чем вызваны митохондриальные заболевания, дайте развернутый ответ. 9.Объясните явление генетического импритинга. 10.Охарактеризуйте болезни тринуклеотидных повторов с явлением антиципации, приведите примеры. Форма отчета 1. Представление на проверку тетради. 2. Представление на проверку родословной своей семьи и устная защита работы. 2. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Цитогенетический метод основан на микроскопическом изучении хромосом в клетках человека и широко применяется с 1956 г., когда Дж. Тио и Л. Леван установили число хромосом в кариотипе человека. 16 В 1960 году на научной конференции в Денвере была принята классификация хромосом, в соответствии с которой им были даны номера, увеличивающиеся по мере уменьшения размеров хромосом. Эта классификация была уточнена на конференции в Лондоне, 1963г. и в Чикаго, 1966 г. В 1969 г. Т. Касперсоном был разработан метод дифференциального окрашивания хромосом (Q-окрашивание), применяя который, возможно точно идентифицировать хромосомы по характеру распределения в них окрашиваемых сегментов. Цитогенетическим методом изучают нормальную морфологию хромосом и кариотип в целом, определяют генетический пол организма, и, главное, диагностируют хромосомные болезни, которые связаны с изменением числа или с нарушением структуры хромосом и процессы мутагенеза на уровне хромосом и кариотипа. Метод применяется в медико-генетическом консультировании для пренатальной диагностики хромосомных болезней, а также для идентификации хромосом при гибридизации соматических клеток. В соматических клетках человека диплоидный набор хромосом, 2n = 46, а в половых – гаплоидный n = 23. При оплодотворении диплоидный набор хромосом восстанавливается. В хромосоме выделяют короткое (р) и длинное (q) плечи. Концы обоих плеч хромосомы называют теломерами. В метафазе митоза хромосомы представлены двумя сестринскими хроматидами, соединенными центромерой. В центромере содержится вещество – кинетохор, участвующее в формировании нитей веретена при клеточном делении. При изучении кариотипа определяют следующие морфометрические характеристики хромосом: Lа – абсолютная длина хромосомы, мкм; Lр – длина короткого плеча, мкм; Lq – длина длинного плеча, мкм; Iв – плечевой индекс; Iс – центромерный индекс; Lr – относительная длина хромосомы, %; Ih – процент гетерохроматиновой зоны, %; I s – индекс спирализации. По значению плечевого индекса определяется форма хромосом. При значении Iв 1–1,9 хромосома называется равноплечей (метацентрической), 2–4,9 – слабонеравноплечей (субметацентрической), 5 и более – акроцентрической или резко неравноплечей, ≥ 8 – телоцентрической или резконеравноплечей. В кариотипе человека хромосомы имеют форму метацентрических, субметацентрических и акроцентрических. Отнесение хромосом к той или иной группе производится на основе расчета центромерного индекса. На основании размеров, комбинации плечевого и центромерного индексов хромосомы человека в соответствии с Международной Денверской классификацией, 1960 г., сгруппированы в 7 групп, обозначаемых буквами английского алфавита: A, B, C, D, E, F, G (табл.1) 17 Таблица 1 Международная Денверская классификация хромосом человека, 1960 г. Группа A B C Номер пары хромосом Центромерный индекс Размеры и форма хромосом 1 0,48–0,49 Самые большие, метацентрики 2 0,38–0,40 Самые большие, субметацентрики 3 0,45–0,46 Самые крупные, метацентрики 4, 5 0,24–0,30 Крупные, субметацентрики 0,28–0,43 Среднего размера, метацентрики и субметацентрики. Группа включает 7 аутосом и Х-хромосому 6–12, Х-хромосома D 13, 14, 15 до 0,15 Среднего размера, акроцентрики, характерна межиндивидуальная вариабельность и наличие спутников на коротких плечах E 16–18 0,26–0,40 Относительно короткие метацентрики и субметацентрики F 19, 20 0,36–0,46 Небольшие метацентрики 0,13–0,33 Небольшие акроцентрики. Для аутосом характерно наличие спутников на коротких плечах G 21, 22 Y-хромосома В настоящее время для идентификации хромосом в соответствии с номенклатурой ISCN-1995 (Парижская номенклатура) все чаще используется дифференциальное окрашивание, которое на хромосомах дает полосы поперечной исчерченности, благодаря которым можно более точно идентифицировать пары гомологов (рис. 6) Анализ кариотипа проводят в культуре делящихся соматических и половых клеток. Наиболее часто используют культуру клеток периферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов. Для анализа кариотипа плода используют различные клеточные культуры; их выбор определяется сроком беременности (до 12 недель – используют клетки ворсин хориона, в более поздние сроки – клетки плода, выделенные из амниотической жидкости, пуповинной крови и плаценты). 18 Рис. 6. Рисунок сегментации в соответствии с Парижской номенклатурой (G-, Q- и Rсегменты). Позитивные G- и Q-сегменты и негативные R-сегменты – черные, вариабельные районы заштрихованы (Paris Conference, 1971, [468].) Цитогенетический анализ включает три основных этапа: 1. Культивирование клеток. 2. Окраска препарата. 3. Микроскопический анализ препарата. Культивирование клеток. Образец помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений – фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток. Кариотип изучают в метафазных клетках, где хромосомы достигают наибольшей спирализации и наиболее четко проявляется их форма. Для увеличения числа метафазных клеток за 1,5 часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин (C22H25NO6) или его химический аналог колцемид, которые разрушают 19 клеточное веретено, приостанавливают деление клеток на стадии метафазы и увеличивают конденсацию хромосом. Обычно культивирование составляет 72 часа. После этого клетки отделяют центрифугированием и помещают в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия, в котором происходит разрыв ядерной оболочки и межхромосомных связей и хромосомы свободно перемещаются в цитоплазму. Затем клетки фиксируют в фиксаторе измененный Карнуа 3:1, (3 части 96% этиловый спирта ректификата и 1 часть ледяной уксусной кислоты). После фиксации клеточную суспензию раскладывают на обезжиренные, охлажденные влажные предметные стекла и высушивают на воздухе. Окраска препарата. Наиболее простой метод окраски хромосом, его называют рутинным – это сплошная, по Гимза. Метод применяется для определения количества хромосом, выявления геномных мутаций и анеуплоидии. Для выявления хромосомных мутаций используют дифференциальную окраску, в результате которой хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и длина темных и светлых полос строго индивидуальна для каждой хромосомы, благодаря этому можно провести более точную идентификацию гомологичных пар и выявить перестройки хромосом. Для дифокраски используют G-метод, C-метод, R-метод, T-метод и Q-метод. Для окраски хромосом можно использовать флуорохромы: акрихин, акрихин-иприт, квинакрин и др. В результате дифференциальной флуоресцентной окраски идентифицируют каждую пару гомологичных хромосом и определяют наличие Y-хромосомы в интерфазном ядре по свечению Y-хроматина. Наиболее эффективен Gметод с использованием красителя Гимза после предварительной обработки хромосом раствором трипсина, при котором количество полос на хромосомах в метафазных пластинках достигает 400. После окраски объект заключают в Канадский бальзам, препарат становится постоянным и может храниться десятки лет. Микроскопический анализ метафазных хромосом. Световое микроскопирование фиксированных и окрашенных препаратов позволяет визуально наблюдать хромосомы. Наиболее подходящие метафазные пластинки фотографируют, получают фотографии и обрабатывают их: составляют кариограммы, в которых хромосомы выстроены парами и распределены по группам, устанавливают общее число хромосом и выявляют изменение их количества и структуры в отдельных парах. Для кариотипирования подбирают метафазные пластинки в количестве не менее 30, с одинаковым индексом спирализации. В случае мозаицизма по хромосомным аномалиям количество изучаемых хромосом увеличивают, вычисляя количество клеток, необходимых для анализа по формуле Р = (1 – р)n , где р – заданный 20 уровень мозаицизма, Р – вероятность обнаружения мозаицизма. Для выявления мозаицизма анализируют несколько тканей, например, клеток крови, фибробласов и половых желез. Принципы описания кариотипа человека. Для описания кариотипа человека используется универсальная схема и специальные символы. Например, запись 46,ХХ – обозначает нормальный кариотип женщины, а 46,XY – нормальный кариотип мужчины. При изучении хромосом обнаруживают полиморфизм, который наиболее характерен для акроцентрических хромосом и, как правило, отражает вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов, наличие спутников, спутничных нитей в области коротких плеч и их величину, в табл. 2 приведены некоторые из них. Установлено, что наличие нормального полиморфизма хромосом увеличивает риск рождения ребенка с хромосомными аномалиями. Таблица 2 Обозначение полиморфизма хромосом человека. (Из: В.И.Иванов, 2006) Символы кариотипа Тип хромосомной перестройки 46,ХХ,9qh+ Увеличение размера гетерохроматинового участка в длинном плече хромосомы 9 женщины 46,XY,Yqh- Уменьшение размера гетерохроматинового района на длинном плече Y хромосомы у мужчины 46,XX,22ps+ Увеличение размера спутников на коротком плече хромосомы 22 у женщины 46,XY,21pstk Увеличение длины спутничных нитей на коротком плече хромосомы 21 у мужчины 46,XX,fra(16)(q21.3) Ломкий сайт в сегменте 21 длинного плеча хромосомы 16 46,XX,15pss Появление двойных спутников на коротком плече хромосомы 15 у женщины 46,XX,21ps+ Увеличение размера спутников на коротком плече хромосомы 21 у женщины Среди супружеских пар, у которых наблюдалось рождение детей с пороками развития, а также страдающих бесплодием и привычным невынашиванием беременности, чаще выявляется носительство хромосом с крупными гетерохроматиновыми блоками. Преобладание лиц с увеличенными гетерохроматиновыми сегментами в акроцентрических 21 хромосомах, а также в хромосомах 1, 9 и 16 отмечено в группе детей с множественными врожденными пороками развития. Следуя рекомендациям IV Международного конгресса по генетике человека в Париже (1971), при описании добавочных хромосом их номер помещают после общего числа аутосом и половых хромосом со знаком «плюс» или «минус» перед номером вовлеченной аутосомы. Например, запись (формула) 47,ХХ+21 обозначает кариотип женщины с трисомией по 21 паре хромосом. Напротив, кариотип мужчины с экстрахромосомой Х изображают как 47,ХХY. При указании удлинения или укорочения плеча хромосомы после её символа ставят знак «плюс» или «минус». Напоминаем, что буква q символизирует длинное плечо, а p – короткое. Например, запись 46,XY,1q+ указывает на увеличение длинного плеча хромосомы 1. Формула 47,ХY+14р+ обозначает кариотип мужчины с 47 хромосомами, включая и дополнительную хромосому 14 с удлинением ее короткого плеча. Сокращение – def (дефишенс), dup (дупликация), r (кольцо, возникающее после воссоединения двух разрывов в хромосоме), inv (инверсия) и t (транслокация) – обозначают аберрации хромосом. Номера хромосомы или хромосом помещают после сокращений в скобках. Например, запись 46,ХХ,r(18) означает кариотип женщины с 46 хромосомами, включая r-хромосому 18. Формула 46,Х,inv(Хq) – кариотип женщины с 46 хромосомами, включая одну нормальную Х хромосому и изохромосому Х (с двумя генетически идентичными длинными плечами). Бэнды помечаются числами по мере удаления от центромеры вдоль короткого (р) и длинного (q) плечей хромосомы. На записи кариотипа указывается и родитель, от которого унаследован полиморфизм хромосом, например: запись 46,ХХ,15ps+pat означает. Что женщиной от отца унаследованы увеличенные спутники по хромосоме 15. Материнское наследование обозначается записью mat. С помощью цитогенетического метода выявлены хромосомные мутации типа реципрокных транслокаций, робертсоновских транслокаций и делеций. Так, транслокация 21-й хромосомы на другую 21, 22, 13, 14 или 15 вызывает синдром Дауна. Делеция короткого плеча Х хромосомы трактуется как моносомия по Х хромосоме, укорочение короткого плеча 21-й хромосомы называется филадельфийская хромосома, делеция короткого плеча хромосомы 5-й пары (синдром «кошачьего крика»), делеция длинного и короткого плеча 18-й хромосомы (нарушение строения лица, скелета, умственная отсталость, гипотрофия, гипотония и многие другие аномалии). В результате двух концевых нехваток образуются кольцевые хромосомы. При кольцевой 5-й хромосоме развивается синдром «кошачьего крика», в Х-хромосоме – клиническая картина близка синдрому Шерешевского-Тернера. Среди геномных мутаций наиболее часто встречается синдром Дауна (трисомия по 21 паре). Трисомия по 13 22 хромосоме вызывает синдром Патау, по 18 хромосоме – синдром Эдвардса. Среди анеуплоидных синдромов по половым хромосомам (ХО) – синдром Шерешевского-Тернера. У женщин описано три вида полисомий по Х-хромосоме: 47,ХХХ, 48,ХХХХ, 49,ХХХХХ. В кариотипе женщин с полисомией по Х-хромосоме увеличивается количество телец Барра. Полисомия по Х-хромосоме у мужчин называется синдром Клайнфельтера (47,ХХY), встречаются отклонения по числу Х хромосом 48,ХХХY и 48,ХХУУ. У мужчин часто встречается полисомия по У хромосоме (47,ХУУ, 48.ХУУУ). Метод определения полового хроматина. Это экспресс метод, который выявляет изменения числа половых хромосом в неделящихся клетках слизистой оболочки щеки. Половой хроматин, или тельце Барра, образуется одной из хромосом женского организма. Оно выглядит как интенсивно окрашенная глыбка, расположенная вблизи ядерной оболочки. При увеличении количества Х-хромосом в кариотипе организма образуются тельца Барра в количестве на единицу меньше числа Ххромосом. При моносомии по Х-хромосоме тельце Барра отсутствует. Y хромосома в мужском кариотипе обнаруживается по более интенсивной люминесценции при обработке акрихинипритом и излучении в ультрафиолетовом свете. Число телец полового хроматина соответствует формуле ВХ Р , 2 где В – число телец Барра, Х – число Х-хромосом, Р – плоидность. 1. 2. 3. 4. 5. ЗАДАНИЕ Изучите конспект лекции и материал учебников. Запишите в словарь и выучите основные термины и понятия: дизоксирибонуклеопротеиды (ДНП): эухроматин, гетерохроматин, кариотип, политенная хромосома, хромосома типа ламповых щеток, В-хромосомы кариотип, кариограмма, идиограмма, спутничная хромосома. Зарисуйте строение метафазной хромосомы, спутничной хромосомы, политенной хромосомы, хромосомы типа ламповых щеток. Подсчитайте число хромосом на метафазной пластинке, по заданию преподавателя. Постройте кариограмму на основании унифицированной Денверской номенклатуры, 1960 г. Измерьте абсолютную длину и плечи хромосом (в мм) и данные занесите в табл. 3. 23 Таблица 3 Параметры хромосом № № пары хромогомолосомы гичных в паре хромосом (1,2) I 1 Длина, в мм общая, короткого плеча, La Lp длинного плеча, Lq Lh длина гетерохраматина Примечания 27,0 2 Число строк в таблице должно соответствовать числу хромосом изучаемого кариотипа плюс 1. 6. Вычислите индекс спирализации Is и значения морфометрических показателей La, Ir, Ib, Ic, Ih и занесите их в таблицу 4. Порядок выполнения. Абсолютная длина самой хорошо заметной хромосомы (ее называют тестерная) измеряется при микрокопировании, с помощью окулярмикрометра и выражается в мкм. Затем вычисляется коэффициент увеличения К хромосом на фотографии метафазной пластинки, а затем – через коэффициент увеличения – вычисляется абсолютная длина каждой хромосомы кариотипа. Например, длина тестерной хромосомы La΄1.1 на фотографии равна 27 мм, или 271000, мкм, физическая или абсолютная длина этой же хромосомы на метафазной пластинке La1.1 составляет 11,0 мкм, тогда коэффициент увеличения . В нашем примере К = (27·1000): 11 = 2454,5 раза. Далее, La1.2 вычисляют делением ее длины на фотографии, выраженной в мкм, на коэффициент увеличения К. Выраженную в мкм абсолютную длину хромосом заносим в таблицу. Iq Плечевой индекс I p I b . Центромерный индекс I c Ip . La Относительная длина хромосомы Lr La 100% . La Процент гетерохроматиновой зоны Ih Длина гетерохроматиновой зоны 100% . Длина всей хромосомы 24 Индекс спирализации Is вычисляется как отношение суммы двух самых коротких хромосом к сумме двух самых длинных хромосом, выраженное в %. Таблица 4 Морфометрические параметры хромосом, при I = .. ..., % . s Группа, № пары гомологичных хромосом № хромосомы в паре I 1 La , мкм Ir, % Ib Ic Ih, % 11,0 2 Число строк в таблице должно соответствовать числу хромосом изучаемого кариотипа. 7. Проанализируйте данные кариограммы и таблиц, используя представления о морфологическом подобии гомологичных хромосом и их числе в кариотипе. Сделайте обоснованный вывод. 8. Сделайте расшифровку кариотипов больных людей: 1) 47,ХХУ,9qh+; 2) 47,ХXY,Yqh-; 3) 46,XX,5r; 4) 47,XХХ,21pstk; 5) 45,X0,15pss . 9. Сколько телец полового хроматина можно обнаружить в большинстве интерфазных клеток людей с кариотипами: 1) 46,XX; 2) 46,XY; 3) 47,XXY; 4) 48,XXXY; 5) 45,X; 6) 47,XXX; 7) 48,XXXX; 8) 49,XXXXУ? 10.Объясните хромосомный механизм появления индивидуумов с отклонениями числа аутосом и половых хромосом. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Раскройте понятия кариотип, кариограмма, идиограмма. 2. Каковы химический состав, строение и морфология хромосом. 3. В чем заключается содержание цитогенетического метода. 4. Охарактеризуйте методы дифференцированной окраски хромосом. 5. Опишите степени упаковки ДНК в метафазную хромосому (нуклеосома, нуклеосомная нить, хромонема). 6. Охарактеризуйте различные типы хромосом. 7. Приведите примеры хромосомных и геномных мутаций у человека. 25 Форма отчета 1. Представление на проверку оформленной тетради и устная защита работы. Работа по изучению кариотипа оформляется как отдельное задание. 2. Выполнение проверочного теста на сайте i-exam. 3. ПОПУЛЯЦИОННО-СТАТИСТИЧЕСКИЙ МЕТОД ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Методы, используемые для установления частот генов и генотипов в популяции, демонстрирующие характер их изменения под влиянием окружающей среды и различных факторов популяционной динамики, называются популяционно-статистические. С помощью этих методов можно: - определить частоты генов и генотипов; - установить, как под действием отбора меняются частоты генов; - выявить, как влияют факторы популяционной динамики на частоты тех или иных фенотипов и генотипов; - установить влияние факторов окружающей среды на экспрессию генов; - определить степень межпопуляционного генетического разнообразия и вычислить расстояние между популяциями. При изучении генетики популяций человека необходимо знание их демографических характеристик (размер популяций, рождаемость, смертность, возрастная структура, национальный состав), географические и климатические условия жизни, религиозные убеждения и др., так как при сочетании некоторых характеристик популяции человека могут быть панмиксными (случайные браки) и инбредными (высокая частота кровнородственных браков). В популяции человека формирование субпопуляций связано с формами изоляции, которые свойственны только человеку: расовая, социальная (специальное положение, экономические, этнические, языковые, административные особенности), религиозно-конфессиональная и идеологическая. Популяции человека разделяют на крупные, численность которых > 4000 человек, малые ( субпопуляции, или демы), численность которых 1500–4000 человек, и изоляты, численность которых < 1500 человек. Для получения достоверных результатов выбирают достаточно большую популяцию. Для генетических исследований оптимальным является размер популяции от 0,5 до 5,0 млн. человек. Для сбора материала используется обзорный метод и его различные модификации. Совокупность генов в популяции называют генофондом. Генофонд отражается в значениях частот различных генотипов в ней. 26 Наследственные заболевания распределены по различным регионам земного шара, среди разных рас и народностей неравномерно, а знания о распространении частот заболеваний и количестве гетерозиготных носителей в регионе имеет большое значение, т.к. способствует организации профилактических мероприятий. При статистической обработке материала основой для определения генетической структуры популяции является закон генетического равновесия Харди-Вайнберга, 1908 г, который сформулировали, независимо друг от друга, математик Г. Харди в Англии и врач В. Вайнберг в Германии. Закон отражает закономерность, в соответствии с которой: «В популяции из бесконечно большого числа свободно скрещивающихся особей, в отсутствии мутаций, избирательной миграции организмов с различными генотипами и давления естественного отбора, первоначальные частоты аллелей сохраняются из поколения в поколение». В основе сохранения частот аллелей лежат статистические закономерности случайных событий в больших выборках. Важнейшей характеристикой популяции являются частоты аллелей (генов) и генотипов. Для расчета частот генотипов, фенотипов и аллелей в диаллельной системе применяются формулы: pA+qa = 1 (pA+qa)2 = 1 p2AA+2p·qAa+q2aa = 1, где pA – частота доминантной аллели, qa – частота рецессивной аллели, p2 – частота гомозиготного генотипа АА, 2p·q – частота гетерозигот Аа, q2 – частота генотипа аа (рецессивной гомозиготы). Закон Харди – Вайнберга описывает условия генетической стабильности популяции. Популяцию, генофонд которой не меняется в ряду поколений, называют Менделевской. В природе эти популяции не встречаются, но их выделение имеет чисто теоретическое значение. В строгом смысле закон Харди – Вайнберга демонстрируется в бесконечно больших популяциях, в которых осуществляется панмиксия и на которые не действуют никакие внешние факторы, изменяющие ее генетическую и генотипическую структуру. Одно из важнейших применений закона Харди – Вайнберга состоит в том, что с применением его формул моно рассчитать частоты генов и генотипов в популяции. Пример: частота фенилкетонурии (ФКУ) в популяции составляет 1:10000, ФКУ – аутосомно-рецессивное заболевание, следовательно, индивидуумы с генотипами АА и Аа – здоровы, с генотипами аа – больны ФКУ. 27 Популяция, следовательно, представлена генотипами в следующем соотношении: p2AA+2p·qAa+q2aa=1 ? + ? + 1 = 10000. Исходя их этих условий: q2aa=1/10000=0,0001. pA = 1 – qa = 1 – 0,01 = 0,99 p2AA = 0,992 = 0,9801 2p · q Aa = 20,990,01 = 0,0198, или 1,98% (2%) Следовательно, в данной популяции частота гетерозигот по гену ФКУ по изучаемой популяции составляет приблизительно 2%. Количество индивидуумов с генотипом АА составляет 100000,9801=9801, количество индивидуумов с генотипом Аа (носителей) составляет 100000,0198=198 человек. В том случае, если ген в генофонде представлен несколькими аллелями, например, ген I группы крови системы АВ0, то соотношение различных генотипов выражается формулой ( рI A qI A qI b rI o ) 2 и принцип Харди – Вайнберга остается в силе. Например: среди египтян встречаются группы крови в системе АВ0 в следующем процентном соотношении: 0(I) - 27,3%, A(II) - 38,5%, B(III) 25,5%, AB(IV) - 8,7% Определить частоту аллелей I0, IA, IB и разных генотипов в этой популяции. При решении задачи можно воспользоваться формулами: ; ( ; , где А – частота группы крови А (II); 0 – частота группы крови 0(I); В – частота группы крови В(III). ; ( ; Проверка: pIA+qIB+rI0=1 (0,52+0,28+0,20=1). Для генов, сцепленных с полом, у самок (в случае гомогаметного пола) равновесие частот генотипов ХАХА, ХАХа и ХаХа совпадают с таковыми для аутосомных генов: p2+2p·q +q2. Для самцов (в случае гетерогаметного пола) в силу гемизиготности возможны лишь два генотипа ХАY или ХаY, которые воспроизводятся с частотой равной частоте соответствующих аллелей у самок в предшествующем поколении: p и q. Из этого следует, что фенотипы, определяемые рецессивными аллелями, сцепленными с Х-хромосомой, у самцов встречаются чаще, чем 28 у самок. Если частота сцепленного с полом рецессивной аллели равна q, то частота определяемого им фенотипа для самцов будет равна q, а для самок q2. . Отношение q 1 . Из этого соотношения следует, что чем 2 q q меньше значение q , тем выше отношение частоты рецессивного фенотипа у самцов к его частоте у самок. Так, при частоте гена дальтонизма qa = 0,08 этот синдром встречается у мужчин в 1 = 12,5 раз чаще, чем у 0,08 женщин, при частоте аллели гемофилии qa=0,0001, у мужчин заболевание встречается в 10000 раз чаще, чем у женщин. Для установления и подтверждения типа наследования заболеваний необходимо проверить соответствие сегрегации в отягощенных семьях заданной популяции менделеевским закономерностям. Для расчета сегрегационной частоты можно использовать ряд методов: метод сибсов Вайнберга, пробандовый метод. Для установления и подтверждения типа наследования и распределения генотипов в популяции используется метод χ2 (хиквадрат). ЗАДАНИЕ 1. Изучите конспект лекций и материал учебной литературы. 2. Запишите в словарь и выучите основные термины и понятия: панмиксная популяция, генофонд, частота аллели, частота фенотипа и генотипа в популяции, Закон Харди – Вайнбергера (его содержание), мутационное давление, генетический груз, коэффициент отбора, популяционно-генетический анализ, генетический дрейф, инбридинг, адаптационный коэффициент, коэффициент отбора (S). 3. Смоделируйте панмиксную популяцию и сделайте вывод о ее генетической структуре и о генетическом равновесии в ряду поколений (по заданию преподавателя), в двух вариантах, при S = 0 и при S = –1 аа. Методика выполнения При S = 0 отбор отсутствует и все особи жизнеспособны и плодовиты, при S = –1 аа все особи с генотипом аа погибают в каждом поколении, не оставляя потомства. Гаметы условно представлены картонными кружочками. Кружок темного цвета обозначает гамету с доминантной аллелью А, белого – с рецессивной аллелью а. Каждая группа студентов, численностью не менее 2, набирает по сто «гамет»: «яйцеклетки» и «сперматозоиды». Например, А – 30 кружочков, а – 70 кружочков, всего – 100 сперматозоидов и А – 30 кружочков, а – 70 кружочков, всего – 100 яйцеклеток. Их после отсчета и в процессе работы не смешиваем, иначе набирать их придется после 29 каждого поколения! Один из студентов достает, не глядя, по 1 кружочку («яйцеклетки»), другой аналогично достает – «сперматозоиды», третий студент записывает полученную комбинацию генотипа в табл. 5, используя правило конвертов. Сочетание двух темных кружков означает АА, гомозиготу по доминанту; двух белых аа, гомозиготу по рецессиву; темный и белый – Аа, гетерозиготу. Так как сочетание кружков – гамет случайно, то при составлении генотипов имитируется процесс панмиксии. В первом варианте работу повторить 3 раза, то есть в трех поколениях. Таблица 5 Число генотипов и частота аллелей в модельной популяции Поколение Число генотипов АА Аа Всего χ2 аа Частота аллелей рА qа I вариант: S = 0 F1 F2 F3 II вариант: S = - 1 aa F1 F2 F3 F4 F5 F6 Во втором варианте следует выполнять работу до тех поколений, в которых число генотипов не будет повторяться, что свидетельствует об установлении в популяции нового равновесного состояния. При записи генотипов могут вкрадываться как случайные ошибки, так и отражаться закономерное изменение числа генотипа. Поэтому необходимо вычислить критерий χ2 – критерий соответствия практически полученных данных теоретически ожидаемому. Для этого определим теоретически ожидаемую частоту генотипов для заданного соотношения гамет. Например, если исходные гаметы: кружки А – 30, а – 70; то по таблице Пеннета: ♂ ♀ pА 0,3 qа 0,7 30 pА 0,3 qa 0,7 р·q Aa 0,21 q2 aa 0,49 p2 AA 0,09 р·q Aa 0,21 В этой таблице 0,09 АА – соответствует 9 генотипам АА из 100; 0,42 Аа – соответствует 42 генотипам Аа из 100; 0,49 аа – соответствует 49 генотипам аа из 100, полученным в опыте. Далее составим таблицу для определения χ2 : Число генотипов Генотип АА Аа аа Всего Допустим, практически полученные генотипы (в среднем по 3 поколениям) 12 36 52 100 Теоретически ожидаемое (q) 9 42 49 100 Отклонение (d) +3 –6 +3 0 Квадрат отклонения (d ²) 9 36 9 - 2 факт d 2 q χ факт. = 9:9+36:42+9:49 = 1 + 0,86 + 0,18 = 2,04; при n = 2 , при P =0,05 (5% уровень значимости). Сравнив методом χ2 полученные результаты с теоретически ожидаемыми, делаем вывод, что полученное отношение не отличается от ожидаемого, так как χ2факт. < χ2 табличное 5,99. (табл. 6) 2 Таблица 6 Стандартные значения χ при разных степенях свободы (по Р. Фишеру, с сокращениями) 2 Число степеней свободы, n 1 3,84 2 5,99 3 7,81 4 9,49 5 11,07 6 12,59 7 14,07 8 15,51 9 16,92 10 18,31 0,05 Вероятность, Р 0,01 6,63 9,21 11,34 13,28 15,09 16,91 18,48 20,09 21,67 23,31 0,001 10,83 13,82 16,27 18,47 20,50 22,50 24,30 26,10 27,90 29,60 31 Следовательно, в I варианте в панмиксной популяции сохраняются первоначальные частоты аллелей (рА – 0,3 и qa – 0,3). Аналогичную работу проведите для каждого поколения I варианта и для поколения II варианта. Сделайте выводы по результатам своей работы. 4. Решите следующие задачи: 4.1 Болезнь Тея-Сакса обусловлена аутосомным рецессивной аллелью. Характерные признаки этой болезни – отставание в умственном развитии и слепота, смерть наступает в возрасте около четырех лет. Частота заболевание среди новорожденных около десяти на 1 млн. Исходя из равновесия Харди-Вайнберга, рассчитайте частоты аллелей, генотипов и гетерозиготных носителей в пересчете на 200 человек. 4.2 Кистозный фиброз поджелудочной ткани (муковисцидоз) – наследственная болезнь, обусловленная рецессивной аллелью; характеризуется плохим всасыванием в кишечнике и обструктивными изменениями в легких и других органах. Смерть наступает обычно в возрасте около 20 лет. Среди новорожденных кистозный фиброз случается в среднем у 4 на 10000. Исходя из равновесия Харди – Вайнберга, рассчитайте частоты всех трех генотипов у новорожденных, какой процент составляют гетерозиготные носители. 4.3 В табл. 7 приведена частота аллелей, контролирующих группы крови системы АВ0, среди людей из четырёх обследованных популяций. Определите частоту различных генотипов в каждой из указанных популяций. Таблица 7 Частота аллелей, определяющих группы крови в системе АВ0 Частота гена Популяция IA IB i Индейцы ута 0,013 0,0 0,987 Эскимосы 0,333 0,027 0,640 Грузины 0,198 0,038 0,764 Индийцы 0,206 0,254 0,540 4.4 В табл. 8 приведена частота (в процентах) групп крови 0, А, В и АВ в четырёх различных популяциях. Определите частоту 32 соответствующих аллелей и разных генотипов в каждой из этих популяций. Таблица 8 Частота групп крови АВ0 Группа крови системы АВ0 Популяция 0 А В АВ Индейцы навахо 77,7 22,3 0 0 Полинезийцы 36,5 60,8 2,2 0,5 Немцы 36,5 42,5 14,5 6,5 Египтяне 27,3 38,5 25,5 8,7 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ Обоснуйте, что в соответствии с законом Харди – Вайнерга частоты аллелей не изменяются от поколения к поколению; Равновесные частоты генотипов задаются возведением в квадрат суммы частот аллелей и не изменяются от поколения к поколению; Равновесные частоты генотипов достигаются за одно поколение. Охарактеризуйте факторы динамических процессов в популяции. Коэффициент отбора, его сущность. Почему в близкородственных браках чаще проявляются наследственные заболевания? Как вычислить число носителей рецессивной аллели в популяции? Как будут распространяться в популяции человека рецессивные аллели АР заболеваний, которые научились лечить? Форма отчета 1. Представление на проверку рабочей тетради. 2. Решение задач на определение генетической структуры популяции с использованием Закона Харди – Вайнберга. 3. Устная защита выполненной работы. 33 4. МЕТОД ДЕРМАТОГЛИФИКИ И ПАЛЬМОСКОПИИ ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Метод предложен в 1892 г. Ф. Гальтоном. Основан метод на изучении кожных узоров пальцев и ладоней, а также сгибательных ладонных борозд. Ф. Гальтон установил, что названные узоры являются индивидуальной характеристикой человека и не изменяются в течение его жизни. Ф. Гальтон дополнил классификацию рельефа кожных узоров, основы которой были разработаны Я. Туркинье в 1823 г. В настоящее время установлена наследственная обусловленность кожных узоров. Вероятно, признак наследуется полигенно, на характер пальцевого и ладонного узоров оказывает влияние материнский организм через механизм цитоплазматической наследственности. Дерматоглифические исследования важны при идентификации зиготности близнецов. Сходство узоров 4–5 пальцев из 10 пар свидетельствует в пользу разнояйцевости близнецов, если не менее 7 имеют сходные узоры – это указывает на однояйцевость. Установлено, что у людей с синдромами Дауна, Клайнфельтера, Шерешевского-Тернера наблюдаются специфические изменения не только рисунков пальцев и ладоней, но и характера основных сгибательных борозд на коже ладоней. Наблюдаются дерматоглифические изменения и при некоторых хромосомных аберрациях. Описаны специфические дерматоглифические отклонения при шизофрении, миастении, лимфоидной лейкемии. 5. МЕТОДЫ ГЕНЕТИКИ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Методы генетики соматических клеток в значительной мере компенсируют невозможность применения к человеку гибридологического метода. Благодаря разработке методов генетики соматических клеток человек включен в группу объектов экспериментальной генетики. Соматические клетки быстро размножаются на питательной среде, они успешно клонируются, давая идентичное потомство, могут сливаться и образовывать гибридные клоны. Соматические клетки подвергаются селекции на различных питательных средах и долго сохраняются при глубоком замораживании. Все это позволяет использовать культуры соматических клеток, полученных из материала биопсии (периферическая кровь, кожа, опухолевая ткань, ткань эмбрионов, клетки из околоплодной жидкости), 34 для генетических исследований человека. Всем хорошо известна линия клеток HL (Henrietta Lacks), которая поддерживается в культуре и используется в научных исследованиях с 1951 года. При генетических исследованиях соматических клеток человека используют простое культивирование, клонирование, селекцию, гибридизацию. Так, для гибридизации могут использоваться клетки от разных людей, а также от человека и других животных (мыши, крысы, морской свинки, обезьяны, джунгарского хомячка, курицы и др.). Гибридные клетки при делении обычно «теряют» хромосомы одного из видов. Например, в гибридных клетках «человек – мышь» постепенно утрачиваются все хромосомы человека, а в клетках «человек – крыса» сохраняются все хромосомы человека и одна хромосома крысы. Таким образом, можно получать клетки с желаемым набором хромосом, что дает возможность изучать сцепление генов и их локализацию, изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. Методы генетики соматических клеток дают возможность судить о генетической гетерогенности наследственных болезней, изучать их патогенез на биохимическом и клеточном уровнях, появилась возможность точной диагностики наследственных болезней в пренатальный период. 6. БЛИЗНЕЦОВЫЙ МЕТОД Метод предложен в 1875 г. Гальтоном первоначально для оценки роли наследственности и среды в развитии психических свойств человека. В настоящее время метод широко применяется в изучении наследственности и изменчивости человека для определения соотносительной роли наследственности и среды в формировании различных признаков. С помощью близнецового метода можно выявить наследственный характер признака, определить пенетрантность аллели, оценить эффективность действия на организм некоторых внешних факторов (лекарственных препаратов, обучения, воспитания). Сущность метода заключается в сравнении проявления признака в разных группах близнецов при учете сходства или различия их генотипов. Монозиготные близнецы (МБ) генетически идентичны, т.к. развиваются из одной зиготы, поэтому среди монозиготных близнецов наблюдается высокий процент конкордантных пар, в которых признак развивается у обоих близнецов, что свидетельствует о генетической обусловленности признака. По признакам, в формировании которых ведущая роль принадлежит факторам среды, между близнецами наблюдается несовпадение или дискордантность. Количественную оценку относительной роли наследственности и среды можно сделать на основе 35 расчета коэффициента наследственности Н и коэффициента влияния среды Е. с помощью формулы К. Хольцингера: Н=(КМБ-КДБ)/(100-КДБ), где КМБ – конкорданность признака (в %) для МБ; КДБ – то же для ДБ. Если Н=1, т.е. 100%, то можно считать, что экспрессия признака определяется только генотипом индивидуума. Если Н=70%, то 70% - в формировании признака отводится наследственности, а 30% – факторам среды. Существуют таблицы конкордантности близнецов по различным признакам и заболеваниям (В.П. Эфроимсон, 1971, С.М. Гершензон, 1983, В.И.Иванов, 2006, и др.). Трудности близнецового метода связаны с низкой рождаемостью близнецов в популяциях (1:86–1:88), с идентификацией монозиготности близнецов, что важно для достоверности выводов. Для идентификации монозиготности применяют полисимптомный метод сравнения близнецов по многим признакам, методы, основанные на иммунологической идентичности близнецов по эритроцитарным антигенам (АВ0, МN, резусу), по сывороточным белкам, -глобулину), наиболее достоверный критерий – трансплантационный тест с применением перекрестной пересадки кожи. ЗАДАНИЕ 1. В табл. 9 приведены данные о конкордантности некоторых признаков у пар МБ и ДБ. Таблица 9 Конкордантность признаков человека, установленная при исследовании пар МБ и ДБ, 5 (По С.М. Гершензон, 1983) Признак МБ ДБ Группа крови (система АВ0) 100 64 Корь 95 87 99,5 28 Цвет волос 97 23 Форма бровей 100 51 Рахит 88 22 Скарлатина 84 47 Папиллярные линии кистей рук 92 40 Косолапость 23 2 Цвет глаз 36 Проанализируйте приведенные результаты и сделайте предварительное заключение об относительной роли наследственности и факторов среды в развитии каждого из указанных признаков. Для уточнения сделанного заключения проведите расчеты коэффициентов наследственности (Н) и влияния среды (Е), используя формулу Хольцингера. 7. БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Биохимический метод изучает наследственные заболевания, обусловленные генными мутациями и полиморфизм по нормальным первичным продуктам генов. С помощью биохимических методов описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ и установлено, что среди них наиболее распространены болезни, связанные с нарушением строения ферментов, транспортных и других белков. Подтверждением этому является изучение глобиновых цепей гемоглобина, которое показало, что большое разнообразие гемоглобинов у человека, связанное с изменением последовательности аминокислот в его цепях, часто является причиной развития АД заболеваний (гемолитические анемии, метгемоглобинемии, эритроцитоз, серповидно-клеточная анемия), при нарушениях, приводящих к подавлению синтеза цепей гемоглобина возникают талассемии. Примером наследственно-обусловленного нарушения метаболизма является фенилкетонурия. Дефекты ферментов устанавливают по содержанию продуктов метаболизма в крови, в моче. Биохимическую диагностику проводят в два этапа. 1.Подбирают индивидуумы с предположительными случаями заболевания. 2. С помощью точных лабораторных биохимических методов уточняют диагноз заболевания. Биохимические методы исследования применяют для диагностики как в пренатальном периоде, так и после рождения. Биохимические показатели (параметры) являются объективным описанием фенотипа. Объектом биохимической диагностики являются аминокислоты, углеводы, липиды, мукополисахариды, ионы металлов, их метаболиты, концентрация и активность ферментов и др. Биохимическая диагностика является универсальной, так как исследуется любая ткань или любой секрет организма. Довольно часто используют комбинированные биохимические методы, иммуногистохиический, качественные реакции, полуколичественные и 37 количественные тесты. Наиболее точными методами являются жидкостная хроматография с использованием аминокислотного анализа, хроматомассспектрометрия, газовая хроматография и др. С помощью различных биохимических методов анализа диагностированы многие НБО (наследственные болезни обмена): митохондриальные болезни, болезни углеводного обмена, болезни обмена метаболитов, обмена гемма и порфиринов, болезни холестеринового обмена, лизосомные болезни и многие другие. Тогда как нарушение первичных продуктов генов выявляют с помощью биохимических методов, соответствующие повреждения генов могут быть выявлены методами молекулярной генетики. Диагностировать определенные виды мутаций возможно, используя для этого метод обратной транскрипции и ДНК-зонды для различных мутаций нуклеотидных последовательностей человека. Большое значение среди молекулярно-генетических методов имеет метод секвенирования ДНК, с помощью которого определяются нуклеотидные последовательности ДНК. В области молекулярной генетики человека больших успехов добилась новая наука, называемая геномикой, на молекулярном и клеточном уровнях успешно развивается генная инженерия и биотехнология. На основе некоторых генов человека получают и испльзуют первичные генные продукты, например, инсулин. Молекулярно-генетическое изучение ДНК человека раскрывает перспективы терапии и генотерапии наследственных болезней. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. В чем сущность и возможности биохимических методов? 2. В чем сущность, возможности и перспективы молекулярногенетических методов? 8. ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Изучение клеточного материала развивающегося плода методами генетики соматических клеток, молекулярной биологии, цитологических и биохимических методов дает возможность ранней диагностики наследственной патологии у человека. Материал внутриутробно развивающегося организма можно получать разными способами. 1. Амниоцентез (15–16 неделя беременности). Материалом для исследований служит амниотическая жидкость, содержащая продукты жизнедеятельности плода и клетки его кожи и слизистых цитологическими методами определяют пол плода и выявляют 38 хромосомные и геномные мутации. Биохимическими методами обнаруживают дефект белковых продуктов генов, изучают ДНК с помощью ДНК-зондов. С помощью амниоцентеза диагностируются все хромосомные аномалии, свыше 60 наследственных болезней обмена веществ, несовместимость матери и плода по эритроцитарным антигенам. 2. Биопсия ворсин хориона (первая треть беременности). 3. Пункция сосудов плода. Методы фетоскопии и ультразвуковых исследований дают возможность определять пол плода, некоторые пороки развития путем непосредственного наблюдения. Пренатальная диагностика должна проводиться на 20–22-й неделе беременности. Пренатальное обследование проводится в случаях: 1) при обнаружении транслокаций хромосом у одного из родителей; 2) при наличии у родителей АД заболевания; 3) при наличии в семье детей с АР; 4) при возрасте матери старше 35 лет; 5) при привычных выкидышах; 6) при наличии в семье детей с врожденными пороками развития. 9. МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСУЛЬТИРОВАНИЕ Медико-генетическое консультирование – это эффективный вид специализированной помощи населению, направленной на предупреждение появления в семье детей с наследственной патологией. При медико-генетическом консультировании составляют прогноз рождения в данной семье ребенка с наследственной болезнью, родителям объясняют вероятность этого события и оказывают помощь в принятии решения. В случае большой вероятности рождения больного ребенка родителям рекомендуется либо воздержаться от деторождения, либо провести пренатальную диагностику, если она возможна при данном виде патологии. Медико-генетическое консультирование включает 3 основных этапа. 1. Уточнение диагноза. Для этой цели используют генеалогический, цитологический, биохимический и другие необходимые методы исследований, которым подвергаются пробанд и его родственники. Точный клинический и генетический диагноз заболевания позволяет установить степень генетического риска и выбор эффективных методов пренатальной диагностики и профилактического лечения. 2. Прогноз потомства. Сущность генетического прогноза заключается в определении вероятности появления наследственной патологии в семье. 39 Генетический риск может быть определен либо путем теоретических расчетов, либо с помощью эмпирических данных. Наиболее эффективным является проспективное консультирование, когда риск рождения больного ребенка определяется до наступления или в ранние сроки беременности. Проспективное консультирование проводят в случае кровного родства супругов, при отягченной наследственности по линии мужа или жены, при воздействии мутагенных средовых факторов на супругов незадолго до наступления беременности, а также после рождения больного ребенка относительно здоровья будущих детей. Расчет риска при моногамном заболевании может осложниться при пониженной экспрессивности или неполной пенетрантности гена, позднем проявлением генетической аномалии, генетической гетерогенности заболевания. При хромосомных болезнях в случае отсутствия нарушений в кариотипе родителей, вероятность повторного рождения второго ребенка с хромосомной аномалией оценивается по эмпирическим данным для каждого вида аномалии с учетом возраста родителей. При мультифакторных заболеваниях, т.е. заболеваниях с наследственной предрасположенностью, для расчета генетического риска используют данные о популяционной и семейной частоте каждого из них. Специфический генетический риск до 5% – низкий, до 10% – повышенный в легкой степени, до 20% – средний, более 205 – высокий. 3. Принятие правильного решения в отношении деторождения. 1. 2. 3. 4. 5. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ Какова, по Вашему мнению, результативность лечения наследственных болезней? В чем заключается профилактика наследственных болезней? В чем заключается медико-генетическое консультирование? Что вы знаете о перспективных научных направлениях в разработке способов радикального лечения наследственных заболеваний? Что такое генетический мониторинг, и каково его значение в профилактике наследственных болезней? В чем состоит причина возникновения наследственных болезней человека? 10. СТАТИСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МОДИФИКАЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ 10.1. Построение вариационных рядов 40 Предметом изучения биометрии являются варьирующие (изменяющиеся) признаки у относительно однородной группы объектов, называемой совокупностью. Различают совокупность генеральную и выборочную, или случайную, которую называют выборка. Генеральной совокупностью может быть любая группа особей. Изучается же часть членов генеральной совокупности, так называемая выборочная совокупность, или выборка. Основное требование к выборке – её репрезентативность, т.е. достоверное отражение генеральной совокупности. Достигается это случайным отбором объектов для формирования выборки. Объем генеральной совокупности принято обозначать буквой N, а выборочной – n. Если в выборку включено меньше 30 членов (n30), ее называют малой, во всех других случаях – большой. По характеру изменчивости различают изменчивость качественную и количественную. Количественная изменчивость может быть дискретной, т.е. прерывистой (она выражается только целыми числами: количество детей при рождении, число сосков у многоплодных животных и т.д.), и непрерывной, когда варианты могут принимать любое значение (вес, рост, размер обуви, объем крови в организме и т. д.). Величина признака отдельной особи, т.е. числовое его значение, называется вариантой и обозначается буквой Х. Обработка варьирующих показателей начинается с их группировки. Способ группировки зависит как от характера изменчивости, так и от объема выборки. Наиболее простым методом группировки, применяемым при любом характере изменчивости при небольших размерах выборки (n30), является ранжирование. Пример: вес новорожденных при рождении был равен (в кг): 3,3; 3,1; 3,2; 4,2; 3,4; 3,0; 3,8; 3,3; 3,2; 4,2. Ранжированный ряд этой выборки будет выглядеть так: 3,0; 3,1; 3,2; 3,2; 3,3; 3,3; 3,4; 3,8; 4,2; 4,2. Сущность ранжирования состоит в том, что варианты располагаются в строгом порядке по принципу их увеличения или уменьшения (т.е. по ранжиру). Минимальный вес новорожденных 3,0 кг, максимальный – 4,2 кг. Для больших выборок (n30) основным методом группировки является построение вариационного ряда. В зависимости от того, как варьирует признак – дискретно или непрерывно, в широком или узком диапазоне – статистическая совокупность распределяется в безинтервальный или интервальный вариационные ряды. В безинтервальном вариационном ряду частоты относятся непосредственно к ранжированным значениям признака, которые приобретают положение отдельных групп или классов вариационного ряда. Например, при изучении возраста установлены следующие значения (лет): 18, 19, 20, 21, 22, 23. При составлении 41 безинтервального вариационного ряда устанавливаем следующие классы: 1) 18; 2) 19; 3) 20; 4) 21; 5) 22; 6) 23. По такому принципу проводится группировка в классы по признакам размер обуви, возраст, число детенышей в приплоде и другим, изменяющимся в узком диапазоне. Интервальные ряды бывают равноинтервальные и разноинтервальные. Пример составления равноинтервального вариационного ряда рассматривается подробно. В неравноинтервальных рядах характер распределения частот меняется по мере изменения ширины классовых интервалов. В качестве числовых характеристик неравноинтервальных рядов используют особые показатели. Неравноинтервальную группировку применяют в биологии сравнительно редко, например, при фенологических наблюдениях, наблюдениях за сезонными изменениями в природе, за перелетом птиц и др. Вариационным рядом называется двойной ряд, отражающий распределение вариант по классам. При составлении вариационного ряда значения, которые принимает признак, называют классами (W), а количество вариант в классе – частотами (p или f). Сумма частот по всем классам должна равняться объему выборки (n). В математическом выражении это записывается так: p = n. Если признак имеет большой размах изменчивости, то в этом случае в один класс рекомендуется объединить варианты с несколькими, близкими между собой, значениями. Классы вариационного ряда в таком случае не будут совпадать со значениями, которые признак может принимать в процессе изменчивости, а будут характеризоваться несколькими показателями: началом класса (Wн), т.е. минимальным значением признака, концом класса (Wк), т.е. максимальным значением признака. Разберем на конкретном примере построение равноинтервального вариационного ряда. Пример. При взвешивании 50 спортсменов получены следующие данные (в кг): 58 49 58 47 42 50 51 53 54 55 53 63 50 59 52 53 55 54 54 57 50 50 50 53 54 61 57 51 57 56 58 66 67 52 50 58 46 47 50 59 57 60 52 46 49 52 53 47 56 54 Для составления вариационного ряда необходимо: 1. Найти в учетах данных максимальное (max) и минимальное (min) значения признака. Разница между максимальным и минимальным значениями варианты признака – называется размах изменчивости признака, или лимит. lim = max–min. 42 2. Исходя из объема выборки и размаха изменчивости, выбрать оптимальное число классов (k) для проведения группировки. Число наблюдений 40–60 61–100 101–200 201–500 Число классов 6–10 7–10 9–12 12–17 В нашем примере число измерений равняется 50, следовательно число классов должно быть в пределах 6–10. В этих пределах подбирать число классов следует таким образом, чтобы величина классового промежутка была удобной для подсчета и, желательно, оканчивалась на цифру 5 или 0. 3. На основании выбранного количества классов и размаха изменчивости признака установить величину классового промежутка (i), т.е. величину, на которую один класс должен отличаться от другого: lim max min k k max = 67; min = 42; i lim 25 3 k 8 k = 8 (подобранное нами число классов = 8) i lim = 25; Началом первого класса обычно служит варианта с минимальным значением признака, концом первого класса – величина, равная началу первого класса, увеличенному на классовый промежуток (i). Конец последнего класса завершается максимальным значением варианты. Конец предыдущего и начало следующего классов не должны совпадать. Они должны отличаться или на целое число, или на десятые или сотые доли числа, в зависимости от величины изучаемого признака и классового промежутка. Установленные для нашего примера границы классов заносятся в таблицу. Статистические показатели для характеристики совокупности Полученные при проведении обследования данные характеризуют каждую особь совокупности в отдельности. Нас же интересуют, в первую очередь, наиболее общие свойства этой совокупности. Чтобы их установить, данные обрабатывают статистически. Основная задача статистической обработки наблюдений – нахождение ряда показателей, характеризующих в обобщенном виде свойства данной совокупности. Одним из таких показателей является средняя арифметическая, характеризующая среднее значение признака. Средняя арифметическая представляет собой точку равновесия вариационного ряда, отклонения от которой в сторону увеличения или уменьшения признака взаимно уравновешиваются. Средняя 43 арифметическая показывает, какую величину признака имели бы особи данной группы, если бы эта величина была у всех одинаковой. Простейший метод вычисления средней арифметической величины для малой выборки (n30) – это простое суммирование, т.е. нахождение суммы вариант выборки и деление ее на объем выборки. Среднюю арифметическую обозначают Хср или М. Хср Х1 Х 2 Х 3 Х n n Х , n где Х – величина варьирующего признака; n – объем выборки; – сумма. Для больших выборок среднюю арифметическую удобнее вычислить косвенным методом по формуле Xсс А р а i , n где А – среднее значение условного среднего класса; р – частоты; а – условное отклонение; n – объем выборки; i – величина классового промежутка. ЗАДАНИЕ Пользуясь вариационным рядом, представленным в табл. 10, составить табл. 11, необходимую для вычисления средней арифметической косвенным методом. Таблица 10 Распределение вариант по весу Границы классов (Wн –Wк) Частоты (р) 42–45 1 46–48 5 49–51 11 52–54 14 55–57 8 58–60 7 61–63 2 44 64–67 2 р = n = 50 Для вычисления средней арифметической необходимо: 1. Найти в построенном вариационном ряду условный средний класс. В качестве условного среднего класса рекомендуется выбрать класс, который занимает центральное место в данном вариационном ряду и имеет наибольшее по сравнению с другими классами значение частот (р). В нашем примере условным средним классом будет четвертый класс с наибольшей встречаемостью вариант (р = 14) и варьированием веса в пределах 52–54 кг. Таблица 11 Рабочая таблица для вычисления средней арифметической методом условных отклонений № класса Границы классов (Wн –Wк) Частоты (р) Условные отклонения (а) Произведение условных отклонений на частоты (ра) 1 42–45 1 –3 –3 2 46–48 5 –2 –10 3 49–51 11 –1 –11 4 52–54 14 0 0 5 55–57 8 1 8 45 6 58–60 7 2 14 7 61–63 2 3 6 8 64–67 2 4 8 р = n = 50 ра = 12 2. Выделить условный средний класс линиями и принять за нулевой. 3. Вычислить условное среднее значение нулевого класса. Его обозначают буквой А. В нашем примере А 52 54 106 53 2 2 1. Определить условное отклонение (а) каждого класса от нулевого путем вычитания порядкового номера нулевого класса от порядкового номера других классов. Вверх от класса, принятого за условный нулевой, получим натуральный ряд отрицательных чисел (–1, –2, –3 и т.д.), вниз – натуральный ряд положительных чисел (+1, +2, +3 и т.д. в зависимости от класса). 2. Найти произведение частоты на условное отклонение для каждого класса (ра) и заполнить графу табл.11 3. Найти сумму частот (р = n = 50). 4. Вычислить сумму произведений частот на условное отклонение. Она равна: ра = –24+36 = 12. 5. Вычислить среднее арифметическое по формуле: Xср = 53 + 9/50×3 = 53,72. Таким образом, средний вес равен 53,72 кг. По правилам арифметики можно результат округлить до 53,7 кг. 10.3. Показатели изменчивости Средние величины характеризуют всю выборку в целом. Но основное свойство ее членов – свойство изменяться от особи к особи – остается при этом нераскрытым. Для суждения о степени изменчивости или вариабельности признаков в биометрии наиболее часто используются следующие показатели: – лимит или размах изменчивости; – среднее квадратическое или стандартное отклонение; – коэффициент вариации или изменчивости. 46 Лимит или разница между максимальным и минимальным значениями признака в выборке является наиболее простым, но и наиболее точным способом количественного выражения степени изменчивости этого признака. Например, вес спортсменов max = 67 кг, min = 42, lim = 67–42 = 25 кг. Основным показателем изменчивости является среднее квадратическое отклонение. Среднее квадратическое или стандартное отклонение – это статистическая величина, которая показывает, насколько признак, присущий данному варианту, отклоняется от средней арифметической для данной выборки. Среднее квадратическое отклонение обозначают либо греческой буквой S, либо сигма δ. Вычисление среднего квадратического отклонения для малых выборок Для малых выборок среднее квадратическое отклонение вычисляют по формуле: S (X ср Х )2 n 1 Порядок работы: 1 Находят отклонение каждой варианты от средней арифметической для данной выборки, т.е. устанавливают центральные отклонения. 2 Центральные отклонения возводят в квадрат, чтобы избавиться от отрицательных чисел. 3 Находят сумму квадратов. Пример. Представлена совокупность, состоящая из 5 особей. Все они имеют одинаковый возраст и относятся к одной группе. Нужно вычислить среднюю длину их тела и среднее квадратическое отклонение этого признака. 1. Составим простой вариационный ряд (табл. 12) Таблица 12 Составление вариационного ряда Показатели вариационного ряда Варианты ряда (длина тела в см) Отклонение каждой варианты Особи Статистические показатели №1 №4 №2 №5 45 35 40 32 от +7 +2 №3 38 Средняя арифметическая Х ср= 38 см 0 Сумма всех отклонений 47 средней арифметической X – Xср –3 Квадраты отклонений 49 9 (X – Xср)2 (Х – Хср) = 0 –6 4 36 0 Сумма квадратов отклонений (Х – Хср)2 = 98 2. Вычислим среднюю арифметическую Хср: Х ср Х 45 40 38 35 32 190 38см n 5 5 3.Вычислим отклонения размеров длины тела от средней арифметической (Х – Хср) и полученные данные проставим в таблицу. 4.Так как сумма отклонений всегда равна нулю (Х – Хср) = 0, то отклонения следует возвести в квадрат и определить сумму квадратов отклонений. В данном примере они будут равны: (Х – Хср)2 = 49+4+0 + 9 + 36 = 98. S ( Х Х ср ) 2 n 1 98 5см 4 48 Вычисление среднего квадратического отклонения для больших выборок ЗАДАНИЕ Вычислить среднее квадратическое отклонение (S) для данной группы спортсменов по весу 1 Составить вариационный ряд (табл. 13). 2 Определить частоту (р) значений веса в каждом классе. 3 Найти условные отклонения (а) от условного среднего класса. 4 Условное отклонение возвести в квадрат, а2, (графа 4). 5 Найти произведение частоты на условное отклонение, р×а, (графа 5). 6 Вычислить произведение p× a2, (графа 6). 7 По формуле вычислить среднее квадратическое отклонение S (δ): S i pa 2 n pa n 2 В нашем примере S = ±4,5 кг. Таблица 13 Вычисление среднего квадратического отклонения Условные отклонения Границы классов Частоты (Wн –Wв) (р) (а) (а)2 ра ра2 Графа 1 Графа 2 Графа 3 Графа 4 Графа 5 Графа 6 42–45 1 –3 9 –3 9 46–48 5 –2 4 –10 20 49–51 11 –1 1 –11 11 52–54 14 0 0 0 0 55–57 8 1 1 8 8 58–60 7 2 4 14 28 61–63 2 3 9 6 18 64–67 2 4 16 8 32 р = n = 50 ра = +12 ра2 = 126 49 Нужно обратить внимание на то, что S имеет два знака (+ и –). Это свидетельствует об отклонении вариант от средней арифметической как в положительную, так и в отрицательную сторону. Среднее квадратическое отклонение является показателем разнообразия признака. В пределах Хср ± 1S находится 68,28 % вариант выборочной совокупности, в пределах Хср ± 2S находится 95,4% вариант выборочной совокупности, в пределах Хср ± 3S – 99,73% вариант выборочной совокупности. Согласно правилу 3S все варианты выборочной совокупности должны укладываться в интервал от –3S до +3S, если минимальный вариант (min вес) не ниже Х –3S, а максимальный (max вес) не выше Хср+3S, то наблюдения ведутся над однородной генеральной совокупностью, исключив варианты, которые выходят за пределы Хср+3S В нашем примере: Хср + 3S = 53,7 + (3×4,5) = 67,2 кг, Хср – 3S = 53,7 – (3×4,5) = 40,2 кг. Как видим, минимальный вариант 42 не ниже Х – 3S , т.е. 40,2 кг, а максимальный вариант 67,2 не превышает Х=3S, т.е. 67,2 кг. Таким образом, выборка однородна, и изучаемые индивидуумы относятся к одному вариационному ряду. Среднее квадратическое отклонение выражается в тех же единицах, которыми измеряется признак, т.е. является поименованной величиной. Коэффициент изменчивости (вариации) Основное достоинство среднего квадратического отклонения заключается в том, что оно дает полную количественную характеристику изменчивости изучаемого показателя. Однако сравнить изменчивость двух групп с разными средними значениями изучаемого признака и, тем более, изменчивость разных признаков с помощью данного показателя, нельзя. Вот здесь на помощь и приходит следующий показатель изменчивости – коэффициент изменчивости или вариации. Коэффициент изменчивости характеризует изменчивость в относительных величинах. Это отношение среднего квадратического отклонения к средней арифметической для данной выборки, выраженное в процентах. Коэффициент изменчивости определяется по формуле: где Cv – коэффициент изменчивости; S – среднее квадратическое отклонение; Хcp – средняя арифметическая. Cv S 100 (%), X cp ЗАДАНИЕ Вычислить Cv для изучаемых Вами признаков. В нашем примере: Cv = (4,5:53,7)×100 = 8,4%. 50 Коэффициент изменчивости позволяет сравнивать степень изменчивости разных признаков. Чем коэффициент изменчивости выше, тем общая изменчивость признака тоже выше. Низкие коэффициенты изменчивости указывают на генетическую однородность популяции по данным показателям, высокие коэффициенты изменчивости свидетельствуют о ее неоднородности. Ориентировочно считают, что если Cv 5% – изменчивость низкая, Cv от 5 до 10% – средняя, Cv 10% – высокая. Максимальное значение коэффициента изменчивости обычно не превышает 30%. 10.4. Нормированное отклонение Нормированное отклонение – это показатель, характеризующий отдельную варианту или группу вариант. Обозначается буквой Н. Нормированное отклонение – это величина, которая указывает, на сколько долей среднего квадратического отклонения каждый конкретный член совокупности отклоняется от средней арифметической. Вычисляется он по формуле: Н X X ср S , где Н – нормированное отклонение; Хср – средняя арифметическая; S – среднее квадратическое отклонение. Как и коэффициент изменчивости, нормированное отклонение – величина относительная. Каждая варианта характеризуется определенным значением Н. Если Н какой-либо варианты равно +1, значит эта варианта больше Х на 1. Чем больше значение Н, тем дальше от средней арифметической отстоит данная особь. 10.5. Ошибки статистических величин Для изучения изменчивости того или иного признака берут не всех представителей, а только часть их (выборочную совокупность или выборку). В каждом конкретном случае в выборку могут попасть особи, имеющие несколько более высокие или более низкие значения признака, поэтому вычисленные значения биометрических величин будут отражать свойства генеральной совокупности с определенными ошибками. Эти ошибки не могут быть устранены при самой тщательной организации исследований, но их можно учесть. Они получили название ошибок репрезентативности или выборочности. Ошибки статистических показателей будут тем больше, чем выше изменчивость признака и чем меньше объем выборки. 51 Ошибки статистических показателей обозначаются буквой m. Чтобы различать, к какому показателю относится ошибка, рядом с условным ее обозначением подстрочно приписывается обозначение данного показателя. Например: ±m x – ошибка средней арифметической, ± ms – ошибка среднего квадратического отклонения, ±mcv – ошибка коэффициента изменчивости. Все ошибки измеряются в тех же единицах, что и сами показатели. Ошибки статистических показателей вычисляются по формулам: mX где S n mx – ошибка средней арифметической, S – среднее квадратическое отклонение, n – объем выборки. В нашем примере mx = 4.5:7.07 = 0,64 кг = ±0,6 кг. mS где mS – ошибка среднего квадратического отклонения, (в нашем примере mS = ±0,5 кг); S – среднее квадратическое отклонение. n – объем выборки. mcv где S 2n Cv n mcv – ошибка коэффициента изменчивости, Сcv – коэффициент измечивости, n – объем выборки. В нашем примере mcv = ±1,2% Ошибки статистических показателей позволяют уточнить границы, в которых находится фактическое значение данных показателей. Такими границами считается интервал, равный промежутку: показатель 2 ошибки. В нашем примере mx = ± 0,6 кг. 2mx = ± 1,2 кг, следовательно: Хср = 53,7 1,2 кг,S = 4,5 0,5 кг, Сcv = 8,4 1,2%. Вычислить mср , mS, mcv для изучаемых Вами признаков. 52 10.6. Критерий достоверности Критерий достоверности позволяет определить, насколько велика допущенная в опыте ошибка. Его обозначают буквой t и вычисляют по формуле: t X ср m хср 3 Если критерий достоверности больше 3 (t3), то данные опыта достоверны, ошибка составляет около 5%. Если критерий достоверности меньше 3 (t3),то полученным данным верить нельзя. Критерий достоверности зависит от размаха изменчивости и от числа наблюдений. Если t3, то нужно увеличить выборку, взять для наблюдений больше особей, проверить, нет ли случайных значений вариант. В нашем примере 53,7 : 0,6 = 89,5. Полученное число больше 3, значит, данные достоверны. 10.7. Достоверность разности между средними значениями При сопоставлении данных двух изучаемых групп можно вычислить достоверность разницы данного показателя между ними. Для этого вычисляют критерий достоверности различий. Этот показатель предложил маиематик В.С. Госсет, публиковавший свои работы под псевдонимом Стьюдент, отсюда и название – критерий Стьюдента. Критерий Стьюдента td вычисляют по формуле: где td – показатель достоверности разности, td X ср 1 X ср 2 m 2 хср1 m 2 , хср 2 X ср1 – X ср2 – разность между средними арифметическими двух сравниваемых групп: от большего значения Хср вычисляется меньшее. Разность принято считать достоверной, при td факт ≥ td теор.: нулевая гипотеза об отсутствии существенных различий между средними опровергается. При td факт < td теор. различия находятся в пределах случайных колебаний для принятого уровня значимости и нулевая гипотеза не опровергается. Табличное значение td (t) выбирается по таблице, которая помещается в каждом учебнике по биометрии. Под числом степеней свободы ν (ню) понимается число наблюдений, уменьшенное на число ограничений. Например: n1= 50, n2= 50, ν = (n1 – 1) + (n2 – 1) = (50 – 1) + (50 – 1) = 98. 53 В табл. 14 даются достоверные величины td при трех порогах вероятности (Р): 0,05; 0,01; 0,001 с учетом числа степеней свободы. Оптимально будет выбрать уровень Р 0,05. В месте пересечения строки значения ν и графы уровня вероятности и находится табличное значение td. Так, при значении = ν 1 и Р 0,05 td табличное равно 12,71. Таблица 14 Значения критерия t (td) на 5%, 1% и 0,1% уровне значимости Число степеней свободы, ν Вероятность, Р 0,05 0,01 0,001 1 12,71 63,66 – 2 4,30 9,93 31,60 10 2,23 3,17 4,59 30 2,04 2,75 3,65 50 2,01 2,68 3,50 100 1,98 2,63 3,39 ∞ 1,96 2,58 3,29 Например, сравнивая по весу 2 группы детей (n1 = 50, n2 = 50) имеем: Х1 = 23 ± 3,1 кг, Х2 = 24 ± 2,0 кг, td X cp1 X cp 2 td 24,0 23,0 1 0,27; 3,69 m2 xcр1 m2 xcр 2 3,12 2,02 Таким образом, tdфакт = 0,27 tdтабл (1,98), следовательно, вес детей в двух группах различается недостоверно, т.е. нельзя сказать, какая группа имеет лучшие показатели. 10.8. Построение вариационной кривой и гистограммы Графическое выражение изменчивости признака, отражающее как размах вариации, так и частоту встречаемости отдельных вариант выполняются в виде вариационной кривой. Вариационная кривая (рис. 7) строится при изучении количественных признаков, значение которых может быть выражено целым и дробным числом. На графике 54 откладываются значения Хср, а также интервала Х S; Х 2S; Х 3S, а также Mo и Ме. Мода (Мо) и медиана (Ме) являются дополнительными характеристиками среднего значения варьирующего признака в совокупности. Мода (Мо) показывает, какая величина варианта (Хмо) данного признака чаще всего встречается в совокупности. Медиана (Ме) указывает на то, какой вариант расположен в середине (центре) вариационного ряда, он делит совокупность на две равные части: с уменьшающимися и увеличивающимися значениями Хср от медианы. Использование Мо и Ме особенно удобно для сопоставления совокупностей по качественным признакам. Например, модальный цвет кожи у европеоидной расы – белый, модальное число пальцев на руке – 5 и т.д. В нормальном распределении величины Хср, Мо и Ме совпадают. При изучении же дискретных количественных признаков (количество детенышей в помете, число индивидуумов с доминантным признаком, количество зубов и т.д.) и качественных признаков – строится гистограмма (рис. 6). При изучении изменчивости качественных признаков (цвет глаз, волос, окраска венчика и др.) устанавливается частота в абсолютных значениях или в процентах в каждом классе изменчивости и вычерчивается гистограмма, а другие показатели изменчивости не вычисляются 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 . Рис. 7. Вариационная кривая веса спортсменов, кг Мо -…, Ме - ..., Хср ± 1δ =…, Хср ± 1δ =…4 , Хср ± 1δ =…. 1-8- классы, 0-16-частоты по классам. 55 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 Рис. 8. Гистограмма изменчивости цвета волос у группы студентов. 1 – черные, 2 – темно-русые, 3 – каштановые, 4 – рыжие, 13 – светлые. 0-18 —частоты по группам. ЗАДАНИЕ Вычислить показатели изменчивости качественного и количественного признака по заданию преподавателя. Оформить работу в виде индивидуального задания. Объяснить значение всех вычисленных показателей изменчивости. 56 ЛИТЕРАТУРА 1. Абрамова З. В. Генетика. Программированное обучение: учеб. Пособие/З.В. Абрамова. М.: Агропромиздат, 1985. 287с. 2. Биология: Учеб.: в 2 кн. Кн.1 / Ярыгин В. Н., Васильева В. Н., Волков И. Н., Синельщикова В. В. 8-е изд. М.: Высшая школа, 2007. 431с. 3. Бочков Н. П. Клиническая генетика.: Учебник для студентов мед. вузов. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ГОЭТАР–Мед, 2001. 447 с. 4. Вопросы и задачи по общей биологии и общей и медицинской генетике (с пояснениями): Учеб. Пособие / В. А. Накаряков, О. Б. Гигани, О. О. Гигани, А. В. Иткес, Н. В. Карасева, Г. И. Мяндина и др./ Под ред. Проф. А. В. Иткеса. М.: ГЭОТАР-МеД, 2004. 160 с..: ил. 5. Генетика: Учебник для мед. вузов / Иванов В. И., Барышникова Н. В., Билева Д. С. и др.: под ред. В. И. Иванова. М.: Академкнига, 2006. 638с. 6. Задачи по современной генетике: Учеб. Пособие / Глазер В. М., Ким А. И., Орлова Н. Н. и др. - М.: Книжный дом «Университет», 2005. 222 с. 7. Медик В. А. Статистика в медицине и биологии: руководство: в 2 т. Т. 1: теоретическая статистика / В. А. Медик, М. С. Токмачев, Б. Б. Фишман; Под. ред. Ю. М. Комарова; Сев.-зап. отделение РАМН. М.: Медицина, 2000. 445 с 8. Пехов А. П. Биология с основами экологии: Учеб. для вузов. 6-е изд. испр. СПб.: Лань, 2006. 687с. 57 Содержание Введение 1. Клинико-генеалогический метод 2. Цитогенетический метод 3. Популяционно-статистический метод 4. Метод дерматоглифики и пальмоскопии 5. Методы генетики соматических клеток 6. Близнецовый метод 7. Биохимический и молекулярно-генетические методы 8. Пренатальная диагностика наследственных заболеваний 9. Медико-генетическое консультирование 10. Статистическое изучение модификационной изменчивости 10.1. Построение вариационных рядов 10.2. Статистические показатели для характеристики совокупности 10.3. Показатели изменчивости 10.4. Нормированное отклонение 10.5. Ошибки статистических величин 10.6. Критерий достоверности 10.7. Достоверность разности между средними 10.8. Построение вариантной кривой и гистограммы Литература 58 Учебное издание Кондратьева Вера Матвеевна Максимюк Николай Несторович МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА Учебно-методическое пособие Оригинал-макет подготовлен кафедрой ББХ НовГУ ________________________________________________________________ __ Изд. лиц. ЛР № 020815 от 21.09.98 Подписано в печать ….2015. Объём 4,2 уч.-изд.л. Тираж 150 экз. Гарнитура Times new Roman. Бумага офсетная. Печать офсетная Отпечатано в ИПЦ НовГУ имени Ярослава Мудрого ул. Большая Санкт-Петербургская, 41, г. Великий Новгород, 173003
