1 На правах рукописи КЛИМОВИЧ Александр Владимирович
реклама
На правах рукописи КЛИМОВИЧ Александр Владимирович СОЗДАНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ CagA-АНТИГЕНА HELICOBACTER PYLORI И АНТИТЕЛ ПРОТИВ НЕГО 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 2 Работа выполнена в Федеральном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» и в Федеральном государственном учреждении «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Научный руководитель: доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России Защита состоится «___» ________ 2010 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., 69/71). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12. Автореферат разослан «___»__________ 2010 г. Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Суворов А.Н. 3 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Иммунохимические методы анализа приобретают всё большее значение в диагностике инфекционных заболеваний человека. Они позволяют выявлять антигены возбудителя, характеризовать его фенотип и патогенетический потенциал, а также оценивать иммунный ответ организма и исследовать его механизмы. Инфекция бактерией Helicobacter pylori вызывает развитие в слизистой желудка воспалительного процесса, который в большинстве случаев протекает в форме хронического гастрита. В ряде случаев (до 20%) инфекция приводит к возникновению острого гастрита, язвенной болезни, аденокарциномы желудка и MALT-лимфомы (Жебрун, 2006; Kusters et al., 2006). Наиболее выраженные патологические процессы, сопряженные с повышенной вероятностью опухолевой трансформации, вызывают штаммы H. pylori, экспрессирующие цитотоксин CagA (Hatakeyama, Higashi, 2005). Этот белок признан одним из основных факторов патогенности H. pylori и считается ответственным за нарушение целостности эпителия слизистой желудка, индукцию неконтролируемой пролиферации эпителиальных и лимфоидных клеток, секреции провоспалительных цитокинов и модуляцию презентации антигенов клетками эпителия (Brandt et al., 2005; Hatakeyama, 2008; Costa et al., 2009). Цитотоксин CagA является вариабельным белком, и в популяции носителей инфекции H. pylori циркулируют штаммы бактерии, экспрессирующие CagA-белок «западного» или «восточноазиатского» типов, которые различаются по аминокислотной последовательности и биологической активности (Xia et al., 2009). Инфекции CagA-позитивными штаммами H. pylori сопряжены также с развитием ряда экстрагастральных заболеваний аутоиммунной природы. Антитела против CagA-белка вносят существенный вклад в патогенез иммунной тромбоцитопении (Franceschi et al., 2004; Takahashi et al., 2004). Роль и молекулярные механизмы участия цитотоксина CagA и антител против него в патогенезе других аутоиммунных заболеваний (хроническая уртикария, аутоиммунный тироидит и др.) нуждаются в дальнейшем исследовании (Figura et al., 1999; Bakos, Hillander, 2003; Stasi, Provan, 2008). До сих пор остаются неизученными свойства CagA-белка как антигена: не выяснена иммуногенность различных эпитопов молекулы, не исследован изотипический спектр антител, вырабатываемых против этого белка. По заключению ряда экспертов, в том числе III Маастрихтской конференции, для диагностики инфекции H. pylori рекомендуется использовать комплекс иммунологических и молекулярно-биологических методов (Malfertheiner et al., 2007; Mishra et al., 2008; Guarner et al., 2010). Поскольку CagA-белок является маркером высокопатогенных штаммов H. pylori, разработка методов иммунодетекции CagA-антигена и антител против него представляется актуальной проблемой клинической иммунологии (Hatakeyama, Higashi, 2005; Megraud, Lehours, 2007; Monteiro et al., 2009). Решение этой проблемы 4 сдерживается отсутствием стандартизованных препаратов антигена CagA и моноклональных антител (МКАТ) против него. До сих пор не существует эффективной технологии выделения и очистки белка CagA из культур H. pylori, что препятствует получению и аттестации МКАТ против этого антигена. Цель и задачи работы Цель работы состояла в создании иммунохимических реагентов - антигенов и моноклональных антител - для выявления CagA-белка Helicobacter pylori и антител против него. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. С помощью методов биоинформатики выявить области молекулы CagA, различающиеся по степени консервативности и иммуногенности, и определить участки аминокислотной последовательности для конструирования рекомбинантных фрагментов цитотоксина. 2. Создать штаммы бактерий Escherichia coli, экспрессирующие рекомбинантные фрагменты белка CagA H. pylori. 3. Изучить характер связывания рекомбинантных фрагментов CagA с сывороточными антителами и оценить возможность их использования для исследования антител против цитотоксина в сыворотке крови человека. 4. С помощью гибридомной технологии создать панель моноклональных антител против высоко- и низкоиммуногенных участков молекулы CagA. 5. Изучить эпитопную специфичность и иммунохимические свойства полученных моноклональных антител с использованием рекомбинантных полипептидов в качестве антигенов. 6. Изучить взаимодействие моноклональных антител с нативным белком CagA из культур бактерий H. pylori и определить методы их применения для выявления цитотоксина. Основные положения, выносимые на защиту 1. Анализ аминокислотных последовательностей белков CagA с помощью методов биоинформатики оказался эффективным подходом к конструированию рекомбинантных полипептидов и созданию МКАТ. 2. Созданные рекомбинантные фрагменты CagA соответствуют изолированным участкам первичной структуры цитотоксина, обладающим разной иммуногенностью, что позволяет получать МКАТ против высоко- и низкоиммуногенных детерминант молекулы CagA. 3. Рекомбинантные фрагменты CagA позволяют выявлять антитела против цитотоксина в сыворотках носителей инфекции H. pylori, исследовать их изотипический состав и специфичность в отношении различных участков молекулы белка CagA. 4. Рекомбинантные фрагменты могут служить основой для стандартизации методов количественного определения белка CagA в биологическом материале. 5 5. Созданные МКАТ способны взаимодействовать как с рекомбинантными фрагментами CagA, так и с «природным» белком CagA в культурах H. pylori, и позволяют дискриминировать CagA-позитивные и CagA-негативные штаммы H. pylori методами иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа. Новизна и научная значимость работы В результате молекулярно-генетического типирования клинических изолятов H. pylori впервые осуществлен анализ особенностей молекулярной организации гена cagA штаммов H. pylori, циркулирующих на территории России. В базе данных GenBank депонированы первые последовательности гена cagA российских изолятов бактерии. Предсказана методами биоинформатики и подтверждена в экспериментах разная иммуногенность отдельных участков молекулы CagA. Созданы штаммы Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантные фрагменты цитотоксина CagA, которые в совокупности воспроизводят всю аминокислотную последовательность этого белка. Впервые создана панель МКАТ, распознающих антигенные детерминанты высоко- и низкоиммуногенных участков молекулы цитотоксина CagA. Впервые предложена система двухцентрового иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления CagA-антигена, основанная на использовании исключительно МКАТ. Созданные реагенты открывают перспективы для решения ряда научно- исследовательских задач, таких как изучение закономерностей иммунного ответа на цитотоксин, анализ протективной эффективности антител против него, молекулярных механизмов развития язвенной болезни и опухолевой трансформации, роли CagA-белка в патогенезе экстрагастральных аутоиммунных заболеваний. Практическая значимость работы На основе полученных рекомбинантных фрагментов CagA белка разработан вариант ИФА для выявления специфических антител в сыворотках носителей высокопатогенных штаммов H. pylori. Рекомбинантные фрагменты CagA могут быть использованы в качестве контрольных и калибровочных реагентов для различных иммунометрических систем. Созданные в работе МКАТ против CagA-белка представляют собой основу для разработки и производства диагностических тест-систем, позволяющих выявлять пациентов-носителей высокопатогенных CagA-позитивных штаммов H. pylori, а также контролировать эффективность проводимой терапии. Внедрение результатов исследования Разработанные диагностических реагенты лабораториях проходят России, апробацию что в нескольких подтверждается научных и соответствующими документами. На базе Городской больницы №31 (г. Санкт-Петербург) у пациентов с идиопатической тромбоцитопенией и выявленным носительством H. pylori проводится исследование антител, связывающих рекомбинантные фрагменты CagA. В лаборатории 6 аллергодиагностики НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (г. Москва) разработанные иммунохимические реагенты применяют для анализа взаимосвязи между инфекцией CagA-позитивными штаммами H. pylori и аллергическим иммунным ответом у детей. Результаты работы используются при проведении практического курса «Иммунологические методы исследования» на кафедре цитологии и гистологии биологопочвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Личный вклад автора в проведение исследования Данные, представленные в работе, получены лично автором. Диссертантом выполнены все этапы создания штаммов-продуцентов рекомбинантных фрагментов CagA, иммунизации экспериментальных животных, получения гибридом, изучения свойств МКАТ, моделирования систем иммуноанализа на их основе. Приготовление меченых МКАТ и антигенов выполнено при участии сотрудников лаборатории гибридомной технологии ФГУ «РНЦ РХТ». Секвенирование образцов ДНК проведено специалистами компании «АТГ Сервис Ген» (Санкт-Петербург). Культивирование клинических изолятов H. pylori выполнено сотрудниками НИЛ «Диагностика» (Санкт-Петербург). Апробация работы Материалы работы были представлены на IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии: Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), на научной конференции «От лучей Рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института (Российского Научного Центра Радиологии и Хирургических Технологий)» (СанктПетербург, 2008), на XIX Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Хельсинки, 2009). Публикации Результаты работы отражены в 3 статьях и тезисах докладов 4 конференций. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 129 страницах и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, а также выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 33 рисунками. Список цитированной литературы включает 167 литературных источников. 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клинические изоляты H. pylori. В работе использовали 17 культур H. pylori, изолированных из биоптатов стенки желудка, полученных в ходе гастроскопического обследования пациентов с хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка. Культуры были предоставлены сотрудниками НИЛ «Диагностика» (Санкт-Петербург). 7 Образцы сывороток. Образцы сыворотки крови субъективно здоровых доноров и пациентов с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки (всего 80 образцов) были получены из НИЛ «Диагностика» и Городской больницы №31 (Санкт-Петербург). Лабораторные животные. В работе использованы мыши гибриды F1(SJL/JxBALB/c), полученные в результате межлинейного скрещивания в виварии РНЦ РХТ. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей. С помощью множественного выравнивания (алгоритм ClustalW) 39 полноразмерных аминокислотных последовательностей CagA, аннотированных в базе данных GenBank, в молекуле цитотоксина выявлены консервативные и вариабельные области. С использованием алгоритма Paircoil исследовали (Berger et al., 1995) распределение вероятности образования суперскрученной альфа-спирали в аминокислотной последовательности CagA. Участки аминокислотной последовательности, которые образуют суперскрученную спираль, характеризуются высокой иммуногенностью (Cooper et al., 1997). Значения вероятности образования суперспирали выше уровня 0,5 считали показателем потенциально высокой иммуногенности соответствующего участка молекулы CagA. Области, характеризующиеся низким уровнем вероятности (<0,5) рассматривали как низкоиммуногенные. На основе этих данных определяли участки молекулы CagA для конструирования и экспрессии рекомбинантных фрагментов цитотоксина. С помощью анализа нуклеотидных последовательностей cagA, аннотированных в GenBank, в программах Vector NTI Advanced 11 и Primer 3 0.4.0 (Rozen, Skaletsky, 2000) сконструированы 6 специфических олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов гена cagA: Для обеспечения направленного клонирования ПЦР-продуктов в 3`-область последовательности смысловых TTCATAGGATCCTGATCAAAAATCAATCG-3`, TTGAGGATCCTAATTTCAAATACACCAACG-3`, праймеров (cagA1F cagA2F 5`5`- cagA3F 5`- ATATGGATCCGTTAAGAATGGTGTG-3`) был включен сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы BamHI, в антисмысловые TTTTCACTGCAGCATAATTGCCTGTG-3`, ATTTCTGCAGTTACCTTCTTAGCAACTTG-3`, праймеры cagA2R cagA3R (cagA1R 5`5`5`- ATGCTCTGCAGTTTCTCTCGCCAAGCAGT-3`) – сайт узнавания PstI. Конструирование и экспрессия рекомбинантных фрагментов CagA-белка. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на матрице тотальной ДНК из биоптатов стенки желудка носителей H. pylori амплифицировали фрагменты гена сagA, которые затем клонировали в экспрессионные плазмидные векторы pQE30 и pQE31 (Qiagen). Полученные генетические конструкции реплицировали в бактериях E. coli TOP10F` 8 (Invitrogen), анализировали секвенированием и использовали для трансформации бактерий E. coli линии M15[pREP4] (Qiagen) методом электропорации. Экспрессию рекомбинантных белков индуцировали внесением изопропил-бета-D-тиогалактозида и контролировали с помощью электрофореза в денатурирующем акриламидном геле (ДСНПААГ, Laemmli, 1970) и иммуноблоттинга с МКАТ против 6xHis-мотива (Novagen). Белки очищали методом металл-хелатной аффинной хроматографии в денатурирующих условиях на Ni-NTA-агарозе (Qiagen) в присутствии мочевины. Концентрацию белка в пробах измеряли по методу Брэдфорда и Лоури. Чистоту фракций оценивали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и денситометрического анализа фореграмм в пакете программ GelPro 3.1. Молекулярно-генетическое типирование изолятов H. pylori. Из культур клинических изолятов H. pylori выделяли геномную ДНК и проводили амплификацию фрагментов гена cagA методом ПЦР (Panayotopoulou et al., 2007). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенирования. Работа с клеточными культурами. Клетки постоянной миеломной линии 653А, гибридные клетки, полученные в результате слияния спленоцитов иммунизированных мышей с миеломным партнером, а также первичные культуры мышиных перитонеальных макрофагов культивировали в планшетах (Nunc) при 37°С, 100% влажности, в атмосфере с 8% CO2. Базовая культуральная среда содержала 90% DMEM и 10% сыворотки крупного рогатого скота («Биолот», Санкт-Петербург). Клетки криоконсервировали в среде, состоящей из 45% DMEM, 45% сыворотки и 10% диметил-сульфоксида (Sigma), и хранили в жидком азоте. Иммунизация мышей. Мышей F1(SJL/JxBALB/c) иммунизировали препаратами рекомбинантных белков, растворенных в фосфатно-солевом буфере или заключенных в акриламидный гель. Антиген эмульгировали в полном (для первой иммунизации) или неполном (для второй иммунизации) адъюванте Фрейнда (Sigma) и инъецировали животным в дозе 30 мкг внутрибрюшинно. Для последующей антигенной стимуляции белок растворяли в фосфатно-солевом буфере и инъецировали животным в дозе 10 мкг внутрибрюшинно. Через 7 дней после третьей иммунизации у мышей брали пробы крови, и в сыворотках определяли титр антител к рекомбинантным фрагментам белка CagA. Создание гибридом. Слияние спленоцитов иммунизированных мышей и клеток миеломной линии 653А проводили с использованием 50% раствора полиэтиленгликоля ПЭГ-1000 (Sigma) по стандартной методике (Galfre et al.., 1977). Для селекции гибридов в среду добавляли гипоксантин, аминоптерин и тимидин (Sigma). Культуральные надосадки тестировали методом непрямого твердофазного ИФА. Культуры, продуцирующие антитела против CagA, клонировали методом лимитирующих разведений, тестировали, наращивали в массовой культуре, и часть клеток замораживали, а часть – прививали в брюшную полость мышам F1(SJL/JxBALB/c) для 9 получения асцитов. Клетки из собранных асцитов осаждали центрифугированием. Фракцию иммуноглобулинов (Ig) выделяли из асцитической жидкости осаждением полунасыщенным раствором сульфата аммония. МКАТ очищали методом аффинной хроматографии на белок-G-сефарозе (Pharmacia). Варианты ИФА. Оценку титра антител в сыворотках мышей, отбор гибридомпродуцентов МКАТ и исследование специфичности МКАТ выполняли с помощью непрямого твердофазного ИФА. В качестве антигенов использовали аффинно очищенные рекомбинантные белки rCagAfr.1-4. Выявляющим реагентом служил конъюгат аффинно очищенных кроличьих антител против мышиных Ig с пероксидазой. Во всех вариантах ИФА пероксидазную активность определяли с использованием субстрат-хромогенной смеси (3,3`,5,5`-тетраметилбензидин и H2O2, «Хема-Медика», Санкт-Петербург). После остановки реакции оптическую плотность раствора регистрировали при длине волны 450 нм (ОП450). Каждый эксперимент выполняли в трех повторностях. Рекомбинантные фрагменты CagA, меченные биотином, использовали при исследовании взаимного расположения эпитопов, распознаваемых МКАТ, методом ингибиторного ИФА (Nagata et al., 2004), а также при отборе МКАТ, способных распознавать молекулы антигена в растворе. Выявляющим реагентом служил конъюгат стрептавидин-пероксидаза (Sigma). При разработке серологической системы непрямого ИФА для выявления антител против CagA тестировали 80 образцов сыворотки крови. Антитела, связавшиеся с адсорбированными на твердой фазе рекомбинантными фрагментами CagA, выявляли коктейлем меченных пероксидазой МКАТ против легких κ- и λ-цепей Ig человека (для выявления суммарных антител) или конъюгатом МКАТ против тяжелой α-цепи человека (для определения фракции антител класса IgA). Реакцию считали положительной в случае, если значение ОП450 превышало фоновый показатель не менее, чем в три раза. Специфичность теста проверяли методом ингибиторного ИФА, предварительно инкубируя сыворотки с антигеном. Интактные сыворотки использовали в качестве контроля. Значения ОП450 сравнивали с помощью парного двухвыборочного t-критерия. Суммарные антитела против CagA в тех же 80 сыворотках крови выявляли также с помощью прямого ИФА с использованием набора ХеликоБест-антитела («Вектор-Бест», Новосибирск) – единственной ИФА-системы для определения антител против CagA, разработанной и сертифицированной в России. Антитела, связавшиеся с адсорбированным на твердой фазе антигеном, выявляли с помощью того же антигена, меченного пероксидазой. Результаты выявления антител против CagA в сыворотках, полученные с помощью двух вариантов ИФА, сравнивали по общепринятым критериям (Altman, Bland, 1994). Двухцентровый вариант ИФА, предназначенный для выявления белка CagA, моделировали с использованием раствора очищенного рекомбинантного фрагмента CagA с концентрацией 1 мкг/мл. Чувствительность теста оценивали методом титрования 10 раствора антигена. В этом варианте ИФА на твердую фазу адсорбировали МКАТ, предназначенное для захвата антигена из раствора. Антиген, связанный МКАТ на твердой фазе, выявляли вторым МКАТ, меченным пероксидазой. Разработанный вариант ИФА апробировали с использованием лизатов клинических изолятов H. pylori. Бактерий лизировали в денатурирующих условиях в присутствии мочевины. После центрифугирования надосадки уравновешивали по концентрации суммарного белка и исследовали в двухцентровом ИФА. Тест повторяли трижды, и средние значения ОП450 для и cagA-позитивных cagA-негативных изолятов сравнивали с помощью двухвыборочного t-критерия. Иммуноблоттинг. Метод иммуноблоттинга использовали при характеристике рекомбинантных белков, а также при исследовании специфичности МКАТ и их способности выявлять нативный белок CagA H. pylori. Лизаты рекомбинантных бактерий E. coli или H. pylori подвергали электрофоретическому разделению в ДСН-ПААГ. Белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Sigma) с помощью полусухого электропереноса. Мембраны инкубировали в растворе МКАТ (0,1-1 мкг/мл), затем иммунные комплексы выявляли конъюгатом кроличьих антител против мышиных Ig с пероксидазой. Пероксидазную активность, связанную с мембраной, проявляли с помощью хромогенной смеси 4-хлорнафтола (Sigma) и H2O2. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью программ Microsoft Excell 2007 и Statistica 8. Основным методом сравнения результатов ИФА был двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями. При анализе связанных данных использовали парный t-тест. Различия с уровнем значимости p<0,05 считали достоверными. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ последовательностей белков CagA и конструирование праймеров. С помощью in silico анализа репрезентативной выборки аминокислотных последовательностей CagA в полипептидной цепи цитотоксина выявлены 3 области с различными свойствами. N-концевая область молекулы CagA (а.к.о. 1 – 595, Рис.1а,б) высоко консервативна (более 95% консенсусных позиций) и, вероятно, является низкоиммуногенной, поскольку на её протяжении вероятность образования суперскрученной альфа-спирали не превышает уровень 0,5. Центральный сегмент молекулы цитотоксина (а.к.о. 596 – 768) также консервативен. Вероятность образования суперспирали на этом участке существенно превышает критический уровень 0,5, что позволяет прогнозировать высокую иммуногенность данной области молекулы. Cтерминальная область CagA характеризуется низкой потенциальной иммуногенностью и содержит участок с высокой вариабельностью последовательности. На основе анализа консервативности нуклеотидных последовательностей, фланкирующих участки гена cagA, кодирующие указанные области, подобраны 11 олигонуклеотидные праймеры амплификации и направленного клонирования фрагментов гена cagA (Рис. 1в). Создание и характеристика генетических конструкций. С помощью полимеразной цепной реакции амплифицированы четыре перекрывающиеся фрагмента гена cagA с молекулярными размерами около 1730, 1270, 1000 и 2000 п.н. (Рис. 1в,г). Первый фрагмент кодирует консервативную низкоиммуногенную область цитотоксина, второй соответствует высокоиммуногенному консервативному участку. Третий фрагмент кодирует вариабельную низкоиммуногенную область цитотоксина, а четвертый включает в себя последовательности второго и третьего фрагментов. Рис. 1. A-B: Схема, иллюстрирующая алгоритм выбора фрагментов гена cagA для амплификации и клонирования на основе анализа распределения консервативности (А- диаграмма сходства) и потенциальной иммуногенности (Б – диаграмма распределения вероятности образования суперскрученной спирали) в аминокислотной последовательности CagA. По оси абсцисс указаны номера а.к.о., по оси ординат – уровень сходства (на А) и вероятность образования суперспирали (Б). В - взаиморасположение праймеров, разработанных для амплификации фрагментов гена cagA, и последовательностей этих фрагментов. Г: Электрофоретическое разделение продуктов амплификации фрагментов гена cagA H. pylori в агарозном геле. Fr.1, fr.2, fr.3 и fr.4 - продукты ПЦР, молекулярный размер 1730, 1270, 1000 и 2000 п.н., соответственно. M – ДНК-маркер. В результате клонирования продуктов амплификации получены плазмидные конструкции pQE31-cagAfr.1, pQE31-cagAfr.2, pQE30-cagAfr.3 и pQE31-cagAfr.4 (5138, 4682, 4406 и 5414 п.н.). Секвенирование плазмид и последующий анализ последовательностей подтвердили, что все четыре вставки являются фрагментами гена cagA H. pylori и находятся в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей гексагистидиновый мотив, расположенной в 5`-области от сайта клонирования. Фрагменты cagAfr.1-3 были амплифицированы на общей матрице ДНК, выделенной из одного биоптата, поэтому их нуклеотидные последовательности были объединены в одну последовательность длиной 3345 п.н. Эта последовательность гена cagA была депонирована в базе данных GenBank под номером FJ428215. Четвертый 12 фрагмент (cagAfr.4) был амплифицирован с ДНК, изолированной из биоптата другого пациента. Его нуклеотидная последовательность (1941 п.н.) отличалась по ряду позиций от последовательности FJ428215 (сходство 94,9%). Она была аннотирована отдельно, под номером GQ892188. В результате виртуальной трансляции частичных нуклеотидных последовательностей гена cagA FJ428215 и GQ892188 установлены и депонированы в GenBank аминокислотные последовательности белков CagA ACR15106 (1114 а.к.о) и ACX37408 (646 а.к.о.), соответственно. Создание штаммов-продуцентов, получение и очистка рекомбинантных белков. В результате трансформации бактерий линии E. coli M15[pREP4] перечисленными выше плазмидами созданы четыре новых штамма бактерий. При индукции изопропилтиогалактозидом культуры-продуценты синтезировали рекомбинантные белки rCagAfr.1, fr.2, fr.3 и fr.4 с молекулярной массой 65, 44, 39 и 75 кДа, соответственно (Рис. 2а). Эти значения совпадали с расчетными данными, полученными на основании анализа нуклеотидных последовательностей конструкций. Рекомбинантные белки реагировали с МКАТ к гексагистидиновому мотиву (Рис. 2б), что свидетельствовало об успешном создании химерных полипептидов. Денситометрический анализ фореграмм показал, что относительный уровень экспрессии рекомбинантных полипептидов составил 5-20% массы тотального белка в клетках-продуцентах. В результате очистки рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии получены препараты высокой степени чистоты (до 97%). Средний выход чистых целевых белков составлял около 15 мг/л бактериальной культуры. Рис. 2. Выявление рекомбинантных белков в клетках E. coli. A. Электрофоретическое разделение лизатов бактерий, продуцирующих белки rCagAfr.1, fr.2, fr.3 и fr.4 с молекулярным весом 65, 44, 39 и 75 кДа, соответственно (указаны стрелками). Б. Выявление белков rCagAfr.1, fr.2, fr.3 и fr.4, содержащих гексагистидиновый мотив, с помощью антител к гексагистидину. Анализ последовательностей рекомбинантных белков. Анализ последовательностей белков rCagAfr.1-4, ACR15106 и ACX37408 выявил, что они представляют «западный» тип CagA-белка, наиболее характерный для штаммов H. pylori, распространенных в Европе и Северной Америке (Xia et al., 2009). Расчет вероятности образования суперспирали в последовательностях rCagAfr.1-4 показал, что 13 рекомбинантные фрагменты полностью воспроизводят профиль распределения потенциальной иммуногенности на соответствующих участках полноразмерного белка CagA. Рекомбинантный фрагмент rCagAfr.1 представляет собой низкоиммуногенный Nконцевой участок цитотоксина белок CagA, rCagAfr.2, вероятно, несет иммунодоминантные эпитопы молекулы CagA, а фрагмент rCagAfr.3 представляет низкоиммуногенный C-концевой участок CagA. Наконец, в последовательности фрагмента rCagAfr.4 представлены одновременно центральный и C-концевой участки цитотоксина, а его потенциальная иммуногенность высока. Таким образом, рекомбинантные фрагменты rCagAfr.1-4 в совокупности представляют практически полную последовательность белка CagA, при этом высоко- и низкоиммуногенные эпитопы цитотоксина оказываются изолированными в разных фрагментах. Рис. 3. Схема взаиморасположения последовательностей рекомбинантных фрагментов rCagAfr.1, 2, 3 и 4, а также частичных последовательностей белков CagA, размещенных в GenBank, - ACR15106 и ACX37408. His6 – N-терминальный гексагистидиновый мотив. 1 и 1114 – номера а.к.о. в последовательности ACR15106, начиная с N-конца. Выявление антител против CagA в сыворотках. Очищенные рекомбинантные фрагменты rCagAfr.1-3 были использованы для разработки ИФА-системы, выявляющей антитела против CagA в сыворотке крови человека. Исследование 80 сывороток показало, что 46,3% (37/80) образцов содержали антитела, которые реагировали по крайней мере с одним из трех фрагментов, при этом в большинстве случаев (94,6%, 35/37) сыворотки взаимодействовали с rCagAfr.2. Лишь два образца (5,4%, 2/37) дали слабую реакцию с rCagAfr.1 и rCagAfr.3 при отсутствии сигнала на rCagAfr.2. Эти данные экспериментально подтверждают предсказанные параметры иммуногенности белков: наибольшей потенциальной иммуногенностью, в соответствии с расчетами, обладал именно рекомбинантный фрагмент rCagAfr.2, который и был выбран для дальнейшей работы. Специфичность выявления антител в сыворотках с использованием белка rCagAfr.2 была подтверждена с помощью ингибиторного ИФА. Предварительная инкубация сывороток с антигеном снижала эффективность образования иммунных комплексов (p<0,05, Рис. 4). Таким образом, результаты тестирования позволили отнести 35 сывороток к анти-CagAпозитивным, 45 – к негативным (Табл. 1). Изотипический прогностическим спектр антител признаком против белков H. pylori (Castillo-Rojas et al., 2002; считается важным Bhat et al., 2005; 14 Vorobjova et al., 2006, 2008; Лазебник и др., 2006), что определяет необходимость разработки вариантов ИФА, позволяющих оценивать вклад различных фракций иммуноглобулинов в уровень суммарных антител против CagA. Эта задача может быть решена с использованием в качестве выявляющих реагентов МКАТ против отдельных изотипов и субизотипов Ig человека. Так, предложенная ИФА-система была модифицирована для выявления анти-CagA антител изотипа IgA за счет использования конъюгата специфических МКАТ против тяжелых α-цепей. Тестирование сывороток в этой системе показало, что из 35 образцов, в которых были выявлены суммарные антитела против CagA, IgA антитела были обнаружены в 24 сыворотках (68,5%). Рис. 4. Влияние предварительной инкубации сывороток с антигеном на выявление суммарных антител против CagA. Данные по 35 образцам. Контроль – интактные сыворотки. Ингиб. – образцы, преинкубированные с rCagAfr.2. Указаны средние, максимальные и минимальные значения ОП450, а также 95%-доверительные интервалы. Уровень суммарных антител против CagA в тех же сыворотках определяли с помощью референс-системы «ХеликоБест-антитела», которая отличается принципом выявления антител, связавшихся с адсорбированным на твердой фазе антигеном. В соответствии с критериями, рекомендованными производителем, анализ экспериментальных данных позволил отнести 42,5% образцов свыоротки (34/80) к позитивным и 57,5% (46/80) – к негативным или сомнительным (Табл. 1). Сопоставление результатов, полученных с помощью двух тест-систем, показало, что предложенный в настоящей работе лабораторный вариант ИФА характеризуется высокой чувствительностью (94,1%) и специфичностью (93,5%). Табл. 1 Сравнение результатов выявления антител против CagA в сыворотках с помощью двух вариантов ИФА Непрямой ИФА Референс-ИФА Позитивные Негативные Позитивные 32 (40.0%) 3 (3.8%) Негативные 2 (2.5%) 43 (53.8%) 15 Иммунизация мышей и оценка иммунного ответа. Проведена серия иммунизаций 6 групп мышей препаратами рекомбинантных белков. Сравнение титров антител в сыворотках иммунизированных животных выявило, что уровень иммунного ответа животных, которым инъецировали rCagAfr.1 или rCagAfr.3 в ПААГ, был существенно выше, чем у мышей, иммунизированных этими белками в растворенной форме. Результаты иммунизации белком rCagAfr.2 в растворимой форме и в ПААГ не отличались. Эти данные, с одной стороны, свидетельствуют об адъювантном эффекте ПААГ и демонстрируют целесообразность его использования в дополнение к стандартным приемам иммунизации животных. С другой стороны, они служат экспериментальным подтверждением различий в иммуногенности антигенов rCagAfr.1-3, предсказанных с помощью методов биоинформатики. Получение и характеристика МКАТ. Для создания гибридом-продуцентов МКАТ против rCagAfr.1, fr.2 и fr.3 проведено 3 независимых цикла слияния и отбора гибридов. Получено 36 гибридом-продуцентов антител к рекомбинантным фрагментам белка CagA, из которых по результатам тестирования надосадков и ростовым характеристикам отобраны 4 антителопродуцирующие культуры. В ходе отбора гибридом этим клонам присвоены коды 1H1, 1H11, 3H7 и 7E4, которые далее использованы как шифры МКАТ, синтезируемых этими культурами. Исследование способности МКАТ реагировать с рекомбинантными фрагментами CagA методами ИФА и иммуноблоттинга (Рис. 5а, б) показало, что МКАТ 1H1 взаимодействует исключительно с фрагментом rCagAfr.1, МКАТ 1H11 распознает два рекомбинантных антигена - rCagAfr.2 и fr.4, а МКАТ 7E4 связывается с тремя фрагментами - rCagAfr.2, 3 и 4. Наконец, МКАТ 3H7 реагирует с белками rCagAfr.3 и 4. Рис. 5. Исследование антигенной специфичности МКАТ методами иммуноблоттинга (А) и непрямого ИФА (Б). А – выявление рекомбинантных белков rCagAfr.1, fr.2, fr.3 и fr.4 (65, 44, 39 и 75 кДа, обозначены 1, 2, 3 и 4, соответственно) в лизатах E. coli. ЭФ - электрофореграмма разделения лизатов в 10% ПААГ. Указаны шифры МКАТ. Б – ИФА с очищенными рекомбинантными белками. Указаны средние значения оптической плотности (ОП450) по трем экспериментам. Эти данные позволили определить взаимное расположение эпитопов, распознаваемых четырьмя МКАТ. При этом, поскольку созданные рекомбинантные белки rCagAfr.1-3 представляют полную последовательность цитотоксина CagA, аннотированную в 16 GenBank под номером ACR15106, стало возможным картирование эпитопов МКАТ на полной молекуле CagA, начиная с N-конца (Рис. 6). МКАТ 7E4 выявляет белки rCagAfr.2, fr.3 и fr.4. Следовательно, детерминанта, распознаваемая этим антителом, расположена на участке аминокислотной последовательности CagA, общем для трех белков, то есть между Ser796 и Val876 белка CagA ACR15106. МКАТ 1H11 взаимодействует с рекомбинантными белками rCagAfr.2 и fr.4, однако не связывается с rCagAfr.1 и fr.3, что свидетельствует об отсутствии эпитопов этого МКАТ на последних двух белках. Таким образом, можно локализовать детерминанту, распознаваемую антителом 1H11, в интервале между Asp562 и Gln795. Аналогичным образом, эпитоп, распознаваемый МКАТ 3H7, расположен на участке Asn877-Tyr1114 белка CagA ACR15106, а антигенная детерминанта 1H1 локализована в N-терминальной области ACR15106, между Asp1 и Ser461. Таким образом, МКАТ 1H1, 1H11, 3H7 и 7E4 распознают 4 различные неперекрывающиеся линейные эпитопа на молекуле CagA, что подтверждается результатами иммуноблоттинга, непрямого ИФА, а также ингибиторного ИФА. Рис. 6. Картирование эпитопов, распознаваемых МКАТ 1H1, 1H11, 7E4 и 3H7 на молекуле CagA ACR15106. Цифры по горизонтальной шкале – номера а.к.о. в последовательности ACR15106, начиная с N-конца. Способность МКАТ реагировать с природным белком CagA H. pylori исследовали методом иммуноблоттинга, используя лизаты 17 клинических изолятов H. pylori. Антитела 1H1, 1H11 и 3H7 выявляют антиген с молекулярным весом 120-130 кДа в белковых фракциях 15-и из 17-и протестированных изолятов H. pylori (Рис. 7). Именно в диапазоне 120-140 кДа находится молекулярный вес цитотоксина CagA (Hatakeyama, Higashi, 2005), что позволяет утверждать, что МКАТ 1H1, 1H11 и 3H7 связываются с полноразмерным белком CagA. В то же время, названные реагенты не выявляют белок 120-130 кДа в пробах двух культур (№7 и №8), что свидетельствует, вероятно, об отсутствии гена cagA в геноме этих двух изолятов. Для проверки этого предположения, было проведено молекулярно-генетическое типирование всех использованных культур H. pylori. Амплификация участка гена cagA и секвенирование ампликонов подтвердило, что 15 из 17 штаммов являются cagAпозитивными – они несут ген cagA, причем его «западную» форму в двух вариантах – АВС (Xia et al., 2009; размер ампликона 520 п.н., Рис. 7в) или ABCC (630 п.н.). В геноме двух изолятов (№7 и №8) ген cagA не обнаружен. 17 Анализ особенности молекулярной организации гена cagA клинических изолятов H. pylori выполнен в России впервые. Он свидетельствуют о том, что на территории Северо-Запада России преимущественно распространены «западные» штаммы H. pylori, а «восточноазиатские» штаммы H. pylori на данной территории представлены редко. Рис 7. Выявление белка CagA (120-130 кДа) и гена cagA в 17 культурах H. pylori. A – электрофоретическое разделение белковых проб, уравненных по концентрации суммарного белка, в ПААГ. 1-17 – номера проб, К – контрольная культура E. coli, экспрессирующая rCagAfr.4 (75кДа). М- маркер молекулярных весов белков. Б - выявление белка CagA с помощью МКАТ 3H7 методом иммуноблоттинга. В - электрофоретическое разделение продуктов амплификации фрагментов гена cagA. К – контроль, плазмида pQE31-cagAfr.4. М – маркер молекулярных размеров ДНК. Таким образом, выявление белка CagA с помощью МКАТ 1H1, 1H11 и 3H7 методом иммуноблоттинга оказывается специфичным и позволяет эффективно различать CagAпозитивные и CagA-негативные штаммы. Разработка двухцентрового ИФА. При конструировании иммунометрической системы выявления белка CagA методом двухцентрового ИФА осуществлен подбор комплементарной пары МКАТ. В качестве реагента, иммобилизованного на твердой фазе и захватывающего антиген из раствора, выбрано антитело 1H11, которое характеризуется высокой эффективностью связывания растворенного антигена и сохраняет активность при прямой адсорбции на твердой фазе. МКАТ 3H7, конъюгированное с пероксидазой, выбрано в качестве выявляющего реагента, поскольку оно сохраняет специфичность связывания антигена после конъюгирования с ферментной меткой и распознает антигенную детерминанту, пространственно удаленную от эпитопа 1H11. Моделирование иммуноферментной системы выполнено с использованием очищенного белка rCagAfr.4, который включает центральную и C-концевую области цитотоксина и несет 18 одновременно эпитопы, распознаваемые МКАТ 3H7 и 1H11. Полученный результат показал, что с помощью выбранных реагентов возможно выявление антигена в широком диапазоне концентраций. Нижним порогом чувствительности разработанного варианта ИФА является концентрация антигена около 1 нг/мл. С помощью двухцентрового ИФА проведено выявление белка CagA в пробах 17 изолятов H. pylori, уравненных по общему содержанию белка. Уровень сигнала в пробах cagA-позитивных культур (среднее значение оптической плотности ± стандартная ошибка 0,85±0,06) был достоверно выше, чем уровень, определяемый в пробах cagA-негативных изолятов H. pylori (0,04±0,01; p<0,01). Заключение. Таким образом, использование технологии создания рекомбинантных белков позволило преодолеть проблему получения стандартизированных препаратов антигена CagA высокой чистоты. За счет создания панели рекомбинантных фрагментов CagA стало возможным выявление сывороточных анти-CagA антител, изучение иммунологических свойств различных участков цитотоксина, а также картирование эпитопов, распознаваемых МКАТ на молекуле CagA. Изолирование высоко- и низкоиммуногенных участков последовательности цитотоксина, а также использование приемов стимуляции иммунного ответа мышей, позволило получить МКАТ, реагирующие как с иммунодоминантными, так и с низкоиммуногенными эпитопами CagA. Показано, что созданные МКАТ распознают нативный белок CagA H. pylori в различных вариантах иммуноанализа. С использованием полученных МКАТ создана первая система двухцентрового ИФА для выявления CagA, основанная на использовании исключительно моноклональных антител. 4. ВЫВОДЫ 1. На основании in silico анализа в молекуле цитотоксина CagA выделено три качественно различные области, из которых N-концевая высоко консервативна и низкоиммуногенна, центральная - консервативна и обладает высокой иммуногенностью, а C-концевая характеризуется высокой вариабельностью и низкой иммуногенностью. 2. Сконструированы четыре штамма Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантные фрагменты белка CagA. Фрагменты воспроизводят структуру высоко- и низкоиммуногенных областей молекулы CagA и в совокупности представляют всю аминокислотную последовательность белка. 3. Рекомбинантные фрагменты CagA позволяют выявлять сывороточные антитела против цитотоксина, исследовать их изотипический состав и специфичность в отношении различных участков молекулы белка CagA. 4. Впервые созданы штаммы гибридом-продуцентов моноклональных антител против высоко- и против низкоиммуногенных участков молекулы CagA. 19 5. Моноклональные антитела распознают четыре изолированных линейных эпитопа и реагируют как с рекомбинантными полипептидами, так и с нативным белком CagA H. pylori. 6. Моноклональные антитела (1H1, 1H11 и 3H7) позволяют дифференцировать CagAпозитивные и CagA-негативные штаммы H. pylori методом иммуноблоттинга. Антитела 1H11 и 3H7 составляют комплементарную пару для определения белка CagA методом двухцентрового иммуноферментного анализа. 5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи: 1. Климович А.В., Самойлович М.П., Суворов А.Н. Создание и характеристика 2. 3. рекомбинантных фрагментов белка CagA Helicobacter pylori // ЖМЭИ. 2010. В. 2. С. 74-79. Климович А.В., Грязева И.В., Самойлович М.П., Терехина Л.А., Крутецкая И.Ю., Климович В.Б. Создание и характеристика моноклональных антител против белка CagA Helicobacter pylori // ЖМЭИ. 2010. В. 3. С. 62-67. Klimovich A.V., Samoylovich M.P., Gryazeva I.V., Terekhina L.A., Suvorov A.N., Klimovich V.B. Development of Immunoreagents for Diagnostics of CagA-Positive Helicobacter pylori Infections // Helicobacter. 2010. V. 15. P. 193-200. Тезисы: 1. Самойлович М.П., Климович А.В., Терехина Л.А., Грязева И.В., Климович В.Б. 2. 3. 4. Создание моноклональных антител для выявления белка CagA Helicobacter pylori // Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. В. 2(22). Материалы конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург. 2008. С. 192-193. Климович А.В., Терехина Л.А., Грязева И.В., Самойлович М.П., Климович В.Б. Моноклональные антитела против рекомбинантных фрагментов белка CagA Helicobacter pylori // Материалы конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Санкт-Петербург. 2008. С. 126. Терехина Л.А., Грязева И.В., Климович А.В., Самойлович М.П., Климович В.Б. Моноклональные антитела для диагностики CagA-позитивных штаммов против Helicobacter pylori // Материалы научной конференции «От лучей Рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института». Санкт-Петербург. 2008. С. 318–319. Klimovich A.V., Terekhina L.A., Gryazeva I.V., Samoylovich M.P., Suvorov A.N., Klimovich V.B. Development of Recombinant Helicobacter pylori CagA protein fragments for antibody production and characterization // Clinical Microbiology and Infection. 2009. V. 15 (s4). P1162. Abstracts of the European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Helsinki, Finland, 2009).
