1 Министерство образования и науки Украины ОДЕССКИЙ
реклама
Министерство образования и науки Украины ОДЕССКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. И. И. МЕЧНИКОВА Кафедра генетики и молекулярной биологии Методические указания к большому специальному практикуму по генетическому анализу дрозофилы для студентов III - IV курса кафедры генетики и молекулярной биологии Одесса 2008 2 Печатается по решению Совета биологического факультета ОНУ (протокол № от 2008) Авторы: Хаустова Нина Дмитриевна, к. б. н., доцент кафедры генетики и молекулярной биологии Одесского национального университета им. И.И.Мечникова; Белоконь Светлана Васильевна, к. б. н., ст. преподаватель кафедры генетики и молекулярной биологии Одесского национального университета им. И.И.Мечникова. Рецензенты: Герасименко В. П. д.б.н., профессор, заведующий кафедрой генетики Одесского государственного аграрного университета; Галкин Б.Н., д.б.н., профессор, заведующий ПНИЛ-5 Одесского национального университета им. И.И.Мечникова. Ответственный редактор: д.б.н., профессор Тоцкий В.Н. 3 «Генетическим анализом мы называем систему опытов, наблюдений и вычислений, имеющих целью разложение свойств (признаков) организма на отдельные наследственные элементы, «отдельные признаки», и изучение свойств соответствующих им генов». А. А. Серебровский Гибридологический метод – основной метод генетического анализа Методы генетического анализа очень разнообразны, но основным является гибридологический метод, или метод скрещиваний, разработанный Г. Менделем в 1865 году. Его основным принципом является проведение индивидуальных или массовых скрещиваний, в которых в качестве родителей используют гомозиготные исходные формы, различающиеся по одному (моногибридное скрещивание), двум (дигибридное скрещивание) или многим (полигибридное скрещивание) альтернативно проявляющимся признакам. В каждом поколении ведут строгий количественный учёт всех потомков по каждому изучаемому признаку отдельно, независимо от других. Обычно анализируют два или три поколения потомков. Для решения специальных задач в генетическом анализе дрозофилы используют различные системы скрещиваний, среди которых наиболее распространёнными являются следующие: Реципрокные скрещивания – система двух скрещиваний, в одном из которых исследуемый признак в данном проявлении принадлежит материнской форме (прямое скрещивание), а в другом – отцовской (обратное скрещивание). Возвратные скрещивания – скрещивания гибрида первого поколения с одной из родительских форм. Анализирущее скрещивание – скрещивание с гомозиготной рецессивной формой, которая служит анализатором, поскольку с её помощью можно устанавливать структуру исследуемых генотипов – их гомозиготность или гетерозиготность. Циклические скрещивания – система скрещиваний многих форм (различающихся или сходных по одному признаку) друг с другом во всех сочетаниях. Использование указанных типов скрещиваний, а также других методических приёмов, позволяет решать важнейшие задачи генетики, в частности изучать наследование отдельных признаков, локализовать гены, проводить анализ структуры и функции генов, выяснять генетическую структуру популяций, природу мутаций и т. д. 4 Характеристика объекта и методических приёмов, используемых в генетическом анализе дрозофилы Дрозофила (наиболее широко используется вид Drosophila melanogaster) – насекомое с полным превращением. В лабораторных условиях при оптимальной температуре 24 – 25 °С весь цикл развития проходит за десять – двенадцать дней. Установлено, что самки и самцы дрозофилы становятся половозрелыми на вторые сутки после вылупления. Вылупившиеся самки примерно в течение шести – двенадцати часов не способны к спариванию и оплодотворению, в это время около 70 % самцов также бывают стерильными, так как в первые часы после вылупления у самцов и самок часто ещё нет зрелых половых клеток. Для скрещиваний используют только неоплодотворенных (виргинных) самок. Это объясняется тем, что в семяприёмнике оплодотворённой самки в течение нескольких суток может сохраняться сперма от предыдущей копуляции. Самки начинают откладывать яйца на второй – третий день после вылупления. Число яиц в суточной кладке быстро увеличивается и достигает максимума на четвертый – пятый день, затем интенсивность откладки яиц уменьшается. Репродуктивный период у самцов продолжается от двадцати до пятидесяти дней, у самок – от тридцати до восьмидесяти дней. За это время самки могут спариваться до десяти раз, и количество потомков одной самки достигает от одной до восьми тысяч. Плодовитость мух зависит от температуры, условий их содержания и плотности популяции. При высокой плотности культуры отмечено уменьшение плодовитости. Максимальная плодовитость проявляется при 24 °С. С понижением температуры развитие дрозофилы замедляется, а при повышении температуры – ускоряется, однако при температуре 31 °С дрозофила становится бесплодной из-за стерильности самцов. Фертильность самцов восстанавливается при помещении мух в нормальные условия. Характеристика лабораторных линий Drosophila melanogaster, используемых на лабораторных занятиях по большому специальному практикуму Bar, B, I, 57,0. Полосковидные глаза. black, b, II, 48,5. Черный. Тело очень темное. brown, bw, II, 104,5. Коричневоглазый. Цвет глаз от коричневого до гранатового. cinnabar, cn, II, 57,5. Киноварноглазый. Цвет глаз яркий, шарлаховый, глазки бесцветные. Curly, Cy, II, 8,5. Крылья загнуты вверх. Гомозиготы летальны (присутствует инверсия). cut, ct, I, 20,0. Обрезанный край крыла. 5 Dichaete, D, III, 40,4. Двущетинковый. Крылья растопырены. dumpy, dp, II, 13,0. Короткокрылый. На груди воронкообразные углубления. ebony, e, III, 70,7. Черный цвет тела. scarlet, st, III, 44,0. Шарлаховый цвет глаз. sepia, se, III, 26,0. Коричневато-красный цвет глаз. Окраска глаз темнеет с возрастом. singed, sn, I, 21,0. Опаленный. Щетинки изогнуты. spineless, ss, III, 58,5. Бесщетинковый. Щетинки малы. Stubble, Sb, III, 58,2. Остриженный. Щетинки короткие, толстые. Гомозиготы летальны. vermilion, v, I, 33,0. Киноварный цвет глаз. vestigial, vg, II, 67,0. Зачаточнокрылый. Крылья и жужжальцы зачаточные. Ярко выражено плейотропное действие мутации. white apricot, wa, I, 1,5. Белоглазый. Глаза белые, глазки, мальпигиевы сосуды и семенники бесцветны. white, w, I, 1,5. Абрикосовоглазый. yellow, y, I, 0,0. Жёлтый цвет тела. Ротовой аппарат личинки коричневый. Постановка скрещиваний Мух наркотизируют эфиром в морилке и сразу же при утрате ими подвижности вытряхивают из морилки на стеклянную пластинку. Затем тщательно изучают исследуемые признаки и описывают их. Необходимо следить за тем, чтобы мухи при наркотизации не погибли. У переморенных мух крылья поднимаются вертикально вверх. Отбирают самцов и девственных самок для скрещиваний. Молодые, только что вылупившиеся самки и самцы имеют более длинное светлое тело и короткие ещё не расправившиеся крылья. Так выглядят мухи в течение первых трёх – четырёх часов после вылупления. В последующие часы девственные самки не отличаются от оплодотворённых, в связи с чем, отбор виргинного материала начинают с первого дня вылета мух. Для этого за несколько часов до начала отбора из пробирки удаляют всех мух, затем дважды или трижды в день отбирают всех вновь вылетевших самок. Для скрещивания в каждую пробирку среднего размера сажают по две самки и три самца так, чтобы они не попали на корм. Обычно их помещают на стенки пробирки и пробирку держат в горизонтальном положении до окончания наркотизации. Затем пробирку помещают в вертикальное положение. После постановки скрещиваний следует тщательно закрыть пробирки ватными тампонами и снабдить этикетками. Обычно для получения первого поколения ставят по три пробирки для каждого направления реципрокных скрещиваний, для получения второго поколения – по пять – шесть пробирок. 6 Анализ потомков Анализ F1 в эксперименте начинают обычно на девятый – десятый день со дня постановки скрещивания и проводят в течение следующих девяти дней до начала вылета следующего поколения. В условиях большого специального практикума анализ потомков проводят, как правило, одноразово на четырнадцатый день со дня постановки скрещивания (четвертый день лета мух). Каждую пробирку анализируют отдельно. Сначала разделяют мух по полу, а затем анализируют по изучаемым признакам. Например, при проведении дигибридного скрещивания с целью изучения наследования окраски тела и длины крыльев каждая муха должна быть исследована по обоим признакам и отнесена к соответствующему фенотипическому классу. Результаты наблюдений заносят в протокол. После проведенного анализа скрещивают между собой мух первого поколения для получения F2. Для скрещивания желательно использовать мух из каждой предварительно проанализированной пробирки. Анализ F2 в условиях практикума проводят на четвертый день лета мух. Особей из каждой пробирки анализируют отдельно по приведенной выше схеме. При оформлении протокола опыта объединяют данные по каждому фенотипическому классу отдельно по самкам и самцам и затем суммарно по всем обнаруженным классам. Оформление протоколов опытов Записать тему и цель эксперимента, указать его номер и дату. После ознакомления с мухами исходных линий установить фенотипы и описать их в соответствующей графе таблицы. Рядом с таблицей записать схему скрещиваний и теоретически ожидаемые результаты. Данные анализа потомков скрещиваний занести в соответствующие графы таблиц. С помощью метода χ2 провести сравнение экспериментально полученных данных с теоретически ожидаемыми, обсудить и сделать выводы. Темы и содержание экспериментальных работ Раздел 1. Гибридологический анализ взаимодействия генов на примере генетического контроля окраски глаз Тема 1. Анализ взаимодействия генов, локализованных в разных аутосомах Постановка дигибридного скрещивания мутантов дрозофилы, различающихся по одному и тому же признаку (например, bw × st). Анализ F1, 7 установление единообразия и появления признака дикого типа у потомков. Анализ F2, выявление типа взаимодействия генов по характеру расщепления потомков. Тема 2. Анализ взаимодействия генов при локализации одного из них в половой хромосоме Постановка реципрокных скрещиваний мутантов дрозофилы, различающихся по одному и тому же признаку (например, v × bw). Анализ F1, обнаружение различий среди потомков прямого и обратного скрещиваний. Анализ F2, выявление особенностей расщепления при сцеплении одного из взаимодействующих генов с Х-хромосомой. Тема 3. Анализ взаимодействия генов, локализованных в одной аутосоме Постановка дигибридного скрещивания мутантов дрозофилы, различающихся по одному и тому же признаку (например, cn × bw). Анализ F1, сопоставление полученных результатов с таковыми при свободном комбинировании взаимодействующих генов. Анализ F2, обнаружение отклонений от характерной формулы расщепления из-за сцепления взаимодействующих генов. Тема 4. Анализ наследования окраски глаз у дрозофилы методом циклических скрещиваний Проведение реципрокных скрещиваний родительских форм (например, w, a w , bw, cn, se), различающихся по анализируемому признаку. Анализ самок и самцов из F1, построение гипотезы о характере наследования признака. Анализ F2, подтверждение гипотезы о характере наследования признака, предположение о возможных генотипах родителей на основании результатов отдельных скрещиваний. Запись схем скрещиваний и заполнение сводной таблицы. Решение циклической задачи. Определение количества генов, по которым различаются родительские формы, и генотипов родителей. Раздел 2. Определение группы сцепления и локализация гена Тема 5. Определение группы сцепления 4.1. Определение сцепления гена с Х-хромосомой Проведение реципрокных скрещиваний анализируемого мутанта с мухами дикого типа (например, ♀N × ♂w; ♀w × ♂N). Анализ самок и самцов из F1 и установление сходства или различий результатов реципрокных скрещиваний. Анализ F2, подтверждение гипотезы о сцеплении анализируемого мутантного гена с Х-хромосомой. 4.2. Определение сцепления гена с аутосомой Проведение скрещиваний анализируемого мутанта с мухами, маркированными доминантными генами в хромосомах 2 и 3 (например, ♀vg × ♂Cy/Pm;D/Sb). Анализ F1, отбор самцов из соответствующего фенотипического класса и проведение анализирующего скрещивания с самками 8 исследуемой линии (например, ♀vg × ♂Pm-Sb) Определение сцепления мутантного гена с одной из аутосом. Тема 6. Локализация гена в группе сцепления Проведение тригибридного скрещивания анализируемого мутанта с линией, маркированной двумя генами той же группы сцепления, с целью получения тригетерозиготы (например, ♀vg × ♂bcn). Постановка анализирующего скрещивания тригетерозиготы с использованием соответствующего анализатора (например, ♀vg/bcn × ♂bcnvg/bcnvg). Идентификация фенотипических классов (некроссоверов, одинарных и двойных кроссоверов) потомков Fа. Определение расположения генов в хромосоме и расстояния между ними по результатам анализирующего скрещивания. Построение генетической карты и указание местоположения изучаемого гена. Рекомендованная литература 1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: В 3 т. – М.: Мир, 1987 – 1988. 2. Андрієвський О.М., Хаустова Н.Д. Методичні вказівки до лабораторних робіт з генетичного аналізу дрозофіли. – Вид. ОНУ, 2003. 3. Ватти К.В, Тихомирова М.М. Руководство к практическим занятиям по генетике. – М.: Просвещение, 1979. 4. Гершензон С.М. Основы современной генетики. – К.: Наук. думка, 1983. 5. Инге-Вечтомов С.И. Генетика с основами селекции. – М.: Высш. шк, 1989. 6. Медведев Н.Н. Практическая генетика. – М.: Наука, 1968. 7. Орлова Н.Н. Генетический анализ. – М.: МГУ, 1991. 8. Орлова Н.Н. Основы генетического анализа. – М.: МГУ, 1985. 9. Рокицкий П. Ф. Введение в статистическую генетику. – Минск, 1986, Вышейш. шк., 1978. 10.Тихомирова М.М. Генетический анализ: Учебное пособие. – Л.: Изд-во ЛГУ, 1990. 11.Тоцький В.М. Генетика: підручник для студентів біологічних спеціальностей університетів. Одеса: Астропринт. Видання друге, виправлене і доповнене. – 2002. 12.Хаустова Н.Д. Методические указания к генетическому анализу дрозофилы. – Изд. ОГУ, 1993. 13.Хаустова Н.Д., Бланковська Т.П. Збірник циклічних задач з генетичного аналізу дрозофіли. – Вид. ОДУ, 1993.
