Начало формы Н.Б. АХМАТУЛЛИНА, А.А. ТАШЕНОВА, К.А

Н.Б. АХМАТУЛЛИНА, А.А. ТАШЕНОВА, К.А. ИСКАНДАРОВА,
У.Ж. ИСАМБАЕВА
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДА
ВИРУСА ГРИППА МЕТОДАМИ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ И ХРОМАТОГРАФИИ
(Институт общей генетики и цитологии МОН РК, г. Алматы)
Проводилось сравнительное выделение РНП вируса гриппа методами
ультрацентрифугирования и хроматографии. Показана одинаковая эффективность изоляции
биологически активных РНП-комплексов из вирионов
Изучение индуцированной изменчивости вирусов и разработка подходов к направленному
мутагенезу является актуальнейшей задачей теоретического и прикладного значения,
приближающей нас к решению одного из центральных вопросов современной генетики и
биологии - управление регуляторными механизмами наследственной изменчивости.
В основу экспериментов легли созданные нами теоретические предпосылки получения
направленных мутаций у вирусов с фрагментарным геномом /1/. Суть предлагаемого подхода
заключается в воздействии различными мутагенными факторами на отдельные гены вируса с
последующим анализом характера влияния мутаций в каждом конкретном гене на свойства
реассортантов. Разработка способов получения отдельных типов мутаций создает также
перспективы направленного конструирования вакцинных штаммов с полезными свойствами
/2/.
Совершенствование методов разделения генома ортомиксовирусов на отдельные гены или
части генома (функционирующие в виде самостоятельных РНП) с сохранением их
генетических функций имеет самостоятельный научный интерес.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали вирус чумы птиц, А/FPV (Н7N5, штамм Вейбридж), активно
репродуцирующийся в развивающихся куриных эмбрионах (lg ЭИД/50 = 9,0) и в культуре
куриных фибробластов.
Клеточные культуры. Использовали первично трипсинизированную культуру куриных
фибробластов (КФ) и клетки МДСК.
Заражение клеток, определение инфекционной и гемагглютинирующей активности вируса
осуществляли общепринятыми методами. Очистку и концентрацию вируса проводили на
центрифуге L3-50 "Beckman".
Для выделения РНП ультрацентрифугированием к вирусной суспензии в буфере NТ (0,15 М
NaCl, 0,01 М трис-HCl, рН 7,5) добавляли NP40 или тритон Х100 (до концентрации 0,5-1%),
инкубировали в течение 20 мин при температуре 370С и центрифугировали в ступенчатом
градиенте плотности глицерина (15-25%) в течение 4 ч. при 22000 об/мин.
Для выделения вирионных РНП методом гель-хроматографии материал, обработанный
детергентом, наносили на колонку с сефадексом G100, уравновешенную буферным
раствором NТ, и проводили элюцию препаратов РНП. Собирали до 30 фракций объемом 5,0
мл. Оптическую плотность препаратов при 260 нм и 280 нм определяли на СФ-26.
Концентрацию белка в пробах вируса определяли по Bradford /3/. Содержание белка в
хроматографических препаратах определяли по поглощению ультрафиолета при 280 нм,
концентрацию вычисляли по формуле Варбурга и Христиана: С(мг/мл)=f.Е280 нм /4/.
Содержание РНК, определенное путем измерения поглощения ультрафиолета при длине
волны 270 и 290 нм, было рассчитано по формуле /5/:
Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по Лэммли /6/. Пластины гелей
фиксировали и окрашивали Кумасси R-250 на изопропиловом спирте.
Результаты исследований и их обсуждение
Известные способы получения рибонуклеопротеидов (РНП) ортомиксовирусов заключаются,
в основном, в разрушении вирионов детергентом с последующим седиментационным
выделением РНП /7,8,9/.
Для выделения структурных РНП очищенную вирусную суспензию разводили буфером НТ до
значения 640 ГАЕ/мл и обрабатывали детергентом (NP40 или тритон Х100 в необходимой
концентрации). Выделение РНП проводили центрифугированием в ступенчатом градиенте
плотности сахарозы (15-30%) или глицерина (15-25%) при 22000 об/мин. в течение 4 ч.
Электрофоретический анализ полипептидного состава полученных осадков и очищенного
вируса показал значительную степень депротеинизации вирионов, в исследованных пробах
обнаруживалась только нуклеокапсидная фракция, содержащая белки NP и М1 (рис.1).
Рис.1
Белки нативного вируса A/FPV и РНП-комплексов
1,2 - белки нативного вируса;
3 - белки РНП-комплекса, полученного обработкой NP40;
4 - белки РНП-комплекса, полученного обработкой тритоном Х100.
Выделение РНП комплекса методом гель-хроматографии проводили на колонках с
использованием сефадексов различных марок. Для этого суспензию очищенного
дифференциальным центрифугированием вируса, обрабатывали детергентом NP 40 в
концентрации 1%, наносили на колонку с сефадексом G100, уравновешенную
соответствующим буфером, и проводили элюцию. В собранных фракциях определяли
оптическую плотность на СФ-26 путем измерения поглощения ультрафиолета при л=260 нм и
280 нм (рис.2).
Рис. 2
Оптическая плотность фракций, полученных при гель-хроматографии
вируса А/FPV, обработанного детергентом
Из графика видно, что материал, элюированный с колонки, разделился на 2 фракции.
Полученные фракции осаждали ультрацентрифугированием и анализировали с помощью
электрофореза в полиакриламидном геле. Пробы, содержащие нуклеокапсид, отбирали для
дальнейшего разделения, т.е. подвергали дальнейшему фракционированию
центрифугированием в линейном градиенте концентрации сахарозы (15-30%), а также
хроматографии на колонках с использованием сефадекса G100. Фракции, показавшие
наибольшее поглощение ультрафиолета при измерении оптической плотности были
сгруппированы в 3 препарата (рис. 3).
Pис. 3
Оптическая плотность фракций, полученных при гель-хроматографии
РНП-комплексов, выделенных центрифугированием
На рис.3 представлено распределение оптической плотности препаратов, полученных при
центрифугировании РНП-комплексов в линейном градиенте концентрации глицерина и
сахарозы. Для подтверждения полноты разделения фрагментов РНП была проведена
рехроматография суммы полученных проб на сефадексе G150. (рис. 4).
Pис. 4.
Оптическая плотность фракций, полученных при рехроматографии
РНП-комплексов, выделенных центрифугированием
По результатам предварительного определения молекулярных масс РНП комплекс был
разделен на фрагменты с молекулярными массами 160, 205 и 350 КД. Молекулярные массы
фрагментов определяли по калибровочной кривой, построенной по элюционным объемам
белков-маркеров (BSA, папаин, глютатион). Содержание РНК в этих фрагментах было
расчитано по формуле /5/. Приблизительное содержание РНК и белка в выделенных
фрагментах РНП составляло 7-10% и 90-93% соответственно, что согласуется с
литературными данными о процентном соотношении РНК/белок в рибонуклеопротеиде
вируса гриппа.
Проведенные исследования показали, что разрушение вирионов гриппа с помощью
неионного детергента способствовало высокоэффективной диссоциации РНП от
поверхностных гликопротеидов, что позволяет методами центрифугирования и гельхроматографии изолировать РНП-комплексы из вирионов и зараженных клеток. Определена
биологическая активность выделенных препаратов РНП. Указанные РНП-комплексы были
разделены методом гель-хроматографии на три фрагмента. Установлена возможность
реассоциации фрагментов РНП в биологически активный комплекс, что было определено по
наличию гемагглютинирующей активности, выявляемой через 24 и 48 часов после введения в
аллантоисную полость куриных эмбрионов смеси выделенных фрагментов РНП.
Таким образом, создана основа для дальнейшей экспериментальной работы, позволяющая
получать стабильный воспроизводимый препарат РНП - объект, с которым можно проводить
исследования, направленные на получение индуцированных мутаций. Это позволит в
конечном итоге создать перспективы для получения направленных мутаций у вируса гриппа,
что одинаково актуально как для разработки научных основ регуляции жизнедеятельности
вирусов, так и детального изучения их изменчивости.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахматуллина Н.Б. Генетика вирусов человека и животных // Алма-Ата. Наука. 1990.
2. Г.И. Александрова, А.И. Климов. Живая вакцина против гриппа // С.-Петербург. Наука. 1994.
3. Bradford M. Anal.Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
4. Практикум по биохимии растений // С-Петербург. 1996. С. 102.
5. Практикум по биохимии растений // С-Петербург. 1996. С. 123.
6. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4
// Nature. 1970. V. 277. P. 680-685.
7. Albo C., Valencia A., Portela A. // J. Virol. 1995. V.69. P. 3799-3806.
8. Ruigrok R.W., Baudin F. //J. Gen. Virol. 1995. V. 76. P. 1009-1014.
9. Жирнов О.П. Способ выделения свободного рибонуклеопротеида вирусов гриппа типов А и
В // авторское свидетельство. 07.01.92. Бюл. №1. Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского.
SUMMARY
The comparative investigation of the influenza virus RNP isolation using centrifuge and
chromatography methods has been investigated. The same efficacy of both methods has been
shown.