На правах рукописи СЕРЕБРЕННИКОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ МОЛЕКУЛ СОСУДИСТОЙ
реклама
На правах рукописи СЕРЕБРЕННИКОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ МОЛЕКУЛ СОСУДИСТОЙ РЕГУЛЯЦИИ У БОЛЬНЫХ С ПЕРИФРИЧЕСКИМИ ВИТРЕОХОРИОРЕТИНАЛЬНЫМИ ДИСТРОФИЯМИ 03.03.01 – физиология 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Чита- 2013 1 Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель: заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, професор Витковский Юрий Антонович. Официальные оппоненты: Корытов Леонид Иннокентьевич, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, заведующий кафедрой нормальной физиологии. Харинцева Светлана Владимировна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой офтальмологии с курсом отоларингологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук, г. Красноярск. Защита состоится «24» декабря 2013 года в .00 часов на заседании диссертационного совета при ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (адрес 6720090, г. Чита, ул. Горького, 39-а). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (адрес 6720090, г. Чита, ул. Горького, 39-а). Автореферат разослан «___»_ноября_2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.118.01 доктор медицинских наук, профессор И.Н. Гаймоленко 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Периферические витреохориоретинальные дистрофии (ПВХРД) - это группа заболеваний, которая характеризуется различными дегенеративными изменениями сетчатки крайних отделов глазного дна и встречается у пациентов с различными видами рефракции. ПВХРД обнаруживаются в общей популяции в 5-13% случаев [Азнабаев М.Т. и соавт., 2005; Щуко А.Г. и соавт., 2008]. Наличие прогностически опасных видов ПВХРД является основной причиной развития отслойки сетчатки и, как следствие этого, - снижения зрения. По данным литературы, ПВХРД встречаются в 90-96% у больных с отслойкой сетчатки [Щербакова С.Ю., 2009; Mitry D., 2009; Orozco-Gоmez L.P., 2008]. Отслойка сетчатки остается в настоящее время значимой медико-социальной проблемой. Частота регматогенной отслойки сетчатки в общей популяции достигает 10-15 случаев на 100 тыс. населения, в 10% случаев она двухсторонняя [Буткевич В.И. и соавт., 2005, Щуко А.Г. и соавт., 2008; Meier P., 2008; Mitry D., 2009]. Большинство пациентов с данной патологией - люди трудоспособного возраста. Слепота, возникающая на фоне отслойки сетчатки, занимает 6-7 место среди всех возможных причин потери трудоспособности [Терехович М.В. и соавт., 2009]. Возникновение дистрофий возможно в любом возрасте, с одинаковой вероятностью у мужчин и женщин [Батманов Ю.Е. и соавт., 2007, 2008; Зимина М.Г., 2009; Кудинова-Савченко Н.А. и соавт., 2009; Мироненко Л.В. и соавт., 2010]. Учитывая тот факт, что в ранней фазе ПВХРД протекает почти бессимптомно, выявление данного заболевания в большинстве случаев происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями сетчатки. Сложившаяся ситуация ставит вопрос о необходимости поиска молекулярно-генетических предикторов ранней диагностики периферических витреохориоретинальных дистрофий. В настоящее время есть все основания относить ПВХРД к группе мультифакторных заболеваний, развивающихся на фоне нарушения сосудистой регуляции сетчатки. В то же время, вероятно, первичные генетические эффекты определяют особенности продукции молекул сосудистой регуляции и рецепторов к ним. К сожалению, в наши дни молекулярно-генетические исследования не коснулись проблемы ПВХРД. Эти обстоятельства объясняют актуальность исследования полиморфизмов генов сосудистой регуляции при ПВХРД. 3 Цель исследования - изучить генетический полиморфизм молекул сосудистой регуляции у больных с периферическими витреохориоретинальными дистрофиями и оценить их клиникопрогностическое значение для развития заболевания в этническом аспекте. Для достижения цели решались следующие задачи: 1. Выявить и оценить частоту встречаемости аномальных аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) и их сочетаний среди больных с ПВХРД и относительно здоровых резидентов в русской и бурятской этнических группах. 2. Установить степень риска формирования ПВХРД у носителей аномальных аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) среди резидентов Забайкальского края. 3. Сравнить содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста в слезной жидкости и плазме крови у пациентов с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальностей с учетом генотипов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) и их комбинаций. 4. Оценить роль полиморфизма генов молекул сосудистой регуляции в развитии осложнений ПВХРД. Научная новизна исследования. Впервые обнаружено, что аллельные варианты eNOS (C786T), AGT (Met235Thr), EDN1 (Lys198Asn) предрасполагают к развитию ПВХРД, влияют на развитие осложнений заболевания в русской и бурятской этнических группах. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск формирования ПВХРД по сравнению с таковыми русской национальности. Впервые установлено, что уровень эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД обеих этнических групп увеличен по сравнению со здоровыми. Содержание метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских, тогда как в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальности их уровень ниже по сравнению с контрольной группой. У пациентов обеих национальностей заметно увеличивается содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД. По мере развития осложнений ПВХРД в виде разрывов 4 и отслойки сетчатки уровень эндотелина-1 повышается, а метаболитов оксида азота снижается. Впервые выявлено, что различные аллельные варианты и генотипы влияют на уровень молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости. Наличие аллели Asn полиморфизма гена EDN1 (Lys198Asn) обуславливает повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости больных c ПВХРД не зависимо от национальности. Носительство аллели С у русских и аллели Т гена eNOS (C786T) у бурят в гомо- и гетерозиготоном состоянии определяет более высокое содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД. Носительство аллели G полиморфизма гена VEGFA (C634G) в гомо- и гетерозиготном состоянии способствует более высокой продукции ростового фактора у здоровых и больных ПВХРД не зависимо от национальности. У больных - носителей генотипа С/С и С/G падает содержание VEGF в плазме крови. Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования получены новые данные о патогенезе ПВХРД, демонстрирующие роль генов молекул сосудистой регуляции eNOS (C786T), EDN1 (Lys198Asn), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr) в механизмах развития заболевания. Носительство патологических аллелей оказывает влияние на продукцию молекул сосудистой регуляции и развитие осложнений ПВХРД среди представителей русской и бурятской этнических групп Забайкальского края. Выявленные факты позволяют оценить риск развития ПВХРД в этническом аспекте и разработать новые методы прогнозирования и ранней диагностики заболевания среди резидентов русской и бурятской национальностей. Полученные сведения о наличии полиморфизмов eNOS (C786T), EDN1 (Lys198Asn), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и использоваться для оценки риска развития ПВХРД. Внедрение результатов работы. Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной физиологии и офтальмологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия». Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию Читинской государственной медицинской 5 академии «Актуальные вопросы медицины» 16 октября 2013 года. клинической и экспериментальной Положения, выносимые на защиту: 1. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (C786T) и EDN1(Lys198Asn) русской национальности и EDN1(Lys198Asn), VEGFA(C634G), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск развития ПВХРД. У пациентов с ПВХРД независимо от национальности встречаемость генотипа Asn/Asn гена EDN1 (Lys198Asn) выше при наличии осложнений. У бурят с отслойками сетчатки отсутствуют нормальные генотипы генов EDN1(Lys198Asn), VEGFA(C634G) и AGT (Met235Thr). Распределение полиморфизмов генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности. 2. В слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень эндотелина-1 увеличивался, а метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста снижался по сравнению с контрольной группой. Концентрация молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости зависит от клинических проявлений ПВХРД. 3. Содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости у пациентов с ПВХРД зависит от полиморфизма генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) и VEGFA (C634G) и их сочетаний, присутствует этнический компонент. Влияние полиморфизмов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) и VEGFA (C634G) на развитие данной патологии носит этнический характер. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 2 рисунками и 32 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования и клинической характеристики больных, шести глав собственных результатов исследования, главы обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из отечественных и зарубежных источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской 6 Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000 ред.). Клиническая характеристика группы больных с ПВХРД. Методом сплошной выборки обследовано 213 пациентов с ПВХРД, проживающих на территории Забайкальского края. Средний возраст пациентов составил 34±6 лет. С целью изучения этнического компонента все больные были разделены на 2 группы: - Первая группа – 131 пациент с ПВХРД (38 мужчин и 93 женщины) русской национальности; - Вторая группа – 82 пациента с ПВХРД (17 мужчин и 65 женщин) бурятской национальности. Данные об этнической принадлежности выясняли путем опроса, включая указания на национальную принадлежность предков до третьего поколения. Критерии исключения из исследования: пациенты с наличием сопутствующих заболеваний, таких как гипертоническая болезнь, сахарный диабет, онкологические заболевания, а также больные с наличием глазной патологии (глаукома, возрастная макулярная дегенерация, катаракта, конъюнктивиты, кератиты, увеиты, вторичные отслойки сетчатки, дегенеративный ретиношизис). Исключены из исследования пациенты, пользующиеся контактными линзами, беременные, спортсмены, лица, перенесшие оперативные вмешательства в течение последних трех месяцев, в том числе лазерные и хирургические операции на глазах. Контрольную группу составили 196 человек, проживающие на территории Забайкальского края, сходные по половым и возрастным характеристикам, не имеющие на момент исследования ПВХРД и соматической патологии. Всем испытуемым проводилось офтальмологическое обследование, включающее определение остроты зрения (без коррекции, с коррекцией), биомикроскопию переднего отрезка глаза, биомикроофтальмоскопию (в условиях мидриаза) с помощью контактной трехзеркальной линзы Гольдмана, измерение внутриглазного давления - по показаниям. Молекулярно-генетическое исследование для выявления полиморфизмов генов eNOS (C786T), EDN1 (Lys198Asn), AGT(Met235Thr) и VEGF (C634G). Забор крови осуществляли утром натощак из кубитальной вены в вакутейнер с 3,8% цитратом в объеме 5,0 мл. Выделение ДНК осуществляли при помощи набора реагентов для биологических проб (НПФ «Литех», Россия, Москва). Выявление мутаций проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами (НПФ 7 «Литех» - «SNP-экспресс», Россия, Москва). Детекция продуктов амплификации осуществляли электрофоретическим способом. Иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения содержания эндотелина-1, VEGF и метаболитов оксида азота использовалась слезная жидкость и плазма крови 213 пациентов с ПВХРД и 196 здоровых лиц. В группе пациентов с ПВХРД забор слезы производился на больном и парном глазу. Нестимулированную слезную жидкость собирали из нижнего конъюнктивального мешка с помощью стерильной одноразовой пластиковой насадки в объеме 20 мкл в стерильные пробирки типа «Эппендорф» и хранили при температуре -200С. Во время проведения исследования она разводилась в 10 раз буфером для цитокинов Cytokine Assay Buffer (UpstateMillipore, Watford, UK). Концентрацию ЭТ-1 и VEGF определяли методом иммуноферментного анализа с применением тест-систем (ЗАО «ВекторБест», Новосибирск; «Biomedica gruppe», Австрия). Уровень оксида азота изучали по конечным продуктам его метаболизма – нитроксида-нитрита (NO2) с использованием раствора Грисса. Статистическая обработка результатов. Обработка результатов выполнена методами непараметрической и вариационной статистики с применением программы Statistiсa 6.0 (StatSoft Inc., США) и электронных таблиц Microsoft Excel, версия XP. При сравнении изучаемых клинических и лабораторных показателей использовались непараметрические методы в связи с ненормальным распределением значений в вариационных рядах. При сравнении групп использовался критерий Манна-Уитни. Различия между сравниваемыми вариационными рядами считали значимыми при p<0,05. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартального (25-й и 75-й персентили) интервала – указывали в скобках. Статистически значимые различия между группами по количественным признакам оценивались при помощи критерия Манна – Уитни (U-тест). Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применялся критерий 2 (точный критерий Фишера). Для определения частот аллельных вариантов генов использовался закон Харди-Вайнберга. Вычислялась относительная вероятность события (ОР). РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В основу нашего исследования мы положили гипотезу о ведущем значении нарушений региональной гемодинамики в патогенезе ПВХРД. Как известно, в развитии ПВХРД и отслойки сетчатки важную патогенетическую роль играет нарушение кровообращения глаза [Поздеева О.Г., 2012; Саксонова Е.О., 2000]. Причины, приводящие к таким 8 изменениям - различные. Однако, факторами, обуславливающими индивидуальное реагирование механизмов регуляции сосудистого тонуса в норме и патологии, являются генетические. В первом блоке наблюдений мы изучили частоты аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr) среди пациентов с ПВХРД и здоровых лиц Забайкальского края с учетом этнических особенностей распределения. Мы исходили их того, что полиморфизмы генов при различных заболеваниях имеют разные уровни распространенности в регионах мира. Возможные положительные ассоциативные связи между полиморфизмами и заболеваниями сетчатки, установленные внутри одной популяции, необязательно будут таковыми в других популяциях. Установлено, что у пациентов с ПВХРД бурятской национальности превалирует нормальная аллель С, а у русских – аномальная аллель Т полиморфизма гена еNOS (C786T) (табл. 1). Таблица 1 Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов гена еNOS (C786T) среди резидентов русской и бурятской национальностей Показатель Русские Буряты Группа Пациенты с Группа Пациенты с контроля ПВХРД контроля ПВХРД Генотипы С/C 41 (36,6%) 23 (17,5%) 5 (5,9%) 24 (29,3%) р=0,016 р1 =0,001 р = 0,002 C/T 46 (41,1%) 50 (38,2%) 26 (31,0%) 41 (50,,%) T/T 25 (22,3%) 58 (44,5%) 53 (63,1%) 17 (20,7%) р=0,016 р1=0,001 p =0,001 р1=0,019 Всего 112 131 84 82 Аллели С 128 (57,1%) 96 (36,6%) 36 (21,4%) 89 (54,3%) р=0,008 р1=0,001 p =0,001 р1=0,033 Т 96 (42,9%) 166 (63,4%) 132 (78,6%) 75 (45,7%) р=0,016 р1 =0,001 p=0,004 Всего 224 262 168 164 Примечание: р – уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; р1 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (2тест). 9 Резиденты бурятской национальности - обладатели «дикого» варианта гена eNOS (С-аллель) в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД, тогда как присутствие аномальной Т-аллели носит протективный характер. Встречаемость заболевания у носителей Т-аллели значительно меньше. Учитывая высокую частоту аномальной аллели (Т) в контрольной группе у резидентов бурятской национальности (78,6%), можно предположить, что ген eNOS имеет прямое отношение к патогенезу ПВХРД. Обнаружено, что среди пациентов русской национальности, имеющих ПВХРД, 82,5%, а среди бурят - 92,7% носителей аномальной аллели гена EDN1Lys198Asn. Этнических различий встречаемости генотипов и аллельных вариантов гена EDN1Lys198Asn между резидентами русской и бурятской национальностей выявлено не было. Среди бурят с ПВХРД аномальный генотип G/G гена VEGFA (C634G) встречался в 2,5 раза чаще по сравнению с контрольной группой. Таким образом, буряты с ПВХРД – обладатели аномальной аллели G и патологического генотипа G/G в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД. Этнических различий встречаемости генотипов и аллельных вариантов гена VEGFA (C634G) среди резидентов русской и бурятской национальности выявлено не было. Выявлено, что 91,4% пациентов с ПВХРД бурятской национальности являлись носителями аномального варианта гена AGT Met235Thr. У всех бурят с отслойками сетчатки встречалась Thr-аллель, из них в 50% случаев в гомозиготном состоянии. В бурятской этнической группе у больных с разрывами сетчатки мутантная аллель Thr встречалась чаще, чем у русских с таким же типом ПВХРД. Выявлены этнические различия: у бурят с ПВХРД аномальная аллель Thr встречалась чаще, а нормальная аллель Met реже, чем у русских. Мы не обнаружили изменений концентрации эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц. Однако мы выявили изменение уровня молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости. Обнаружено, что у русских в группе пациентов с ПВХРД содержание эндотелина-1 в слезной жидкости в 2,3 раза выше по сравнению с контрольной группой. Такая же закономерность прослеживалась у пациентов бурятской национальности: содержание эндотелина-1 в слезной жидкости у больных в 1,7 раза выше по сравнению со здоровыми (табл. 2). 10 Таблица 2 Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) в слезной жидкости больных с ПВХРД русской и бурятской национальностей; Me (25-й; 75-й персентили) Русские Буряты Контрольна Глаза с Парные Контрольн Глаза с Парные я группа ПВХРД глаза ая группа ПВХРД глаза n=112 n=196 n=66 n=84 n=117 n=47 0,87 2,04 1,56 0,84 1,44 1,02 (0,46; 1,36) (1,22; 2,52) (0,87; 2,21) (0,53; 1,13) (1,14; 2,02) (0,91; 1,44) р=0,001 р=0,001 р1=0,001 Примечание: n – количество глаз; p – уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни). У пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости оказался в 4 и 4,8 раза ниже по сравнению с контрольными группами. У бурят с ПВХРД уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости выше по сравнению с русскими (табл. 3). Таблица 3 Уровень метаболитов NO (мкг/мл) в слезной жидкости больных с ПВХРД русской и бурятской национальностей; Me (25-й; 75-й персентили) Русские Буряты Контрольна Глаза с Парные Контрольн Глаза с Парные я группа ПВХРД глаза ая группа ПВХРД глаза n= 112 n=196 n=66 n=84 n=117 n=47 4,35 0,92 1,25 4,30 1,07 1,75 (3,50; 5,29) (0,46; 1,41) (0,84; 2,41) (3,91; 5,08) (0,61; 3,89) (0,77; р=0,001 р=0,001 р=0,001 2,49) р1 =0,049 р=0,001 Примечание: n – количество глаз; p – уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни). Выявлено, что концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских. 11 В обеих этнических группах прослеживается увеличение содержания эндотелина-1 и уменьшение концентрации метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД по сравнению со здоровыми лицами. Причем максимальный уровень эндотелина-1 и минимальный уровень метаболитов NO был обнаружен в слезной жидкости пациентов с отслойками сетчатки. Проанализировав изменения уровня эндотелина-1, метаболитов оксида азота в слезной жидкости, мы предложили коэффициент риска развития осложнений ПВХРД (К), равный соотношению содержания эндотелина-1 и метаболитов оксида азота. Предварительно все данные были переведены в единую систему (фмоль/мл) (табл. 4). Таблица 4 Уровень эндотелина-1, метаболитов NO в слезной жидкости пациентов русской национальности с различным течением ПВХРД; Me (25-й; 75-й персентили) Контрольная Неосложнен ПВХРД, ПВХРД, группа ные ПВХРД осложненные осложненные разрывами отслойкой сетчатки сетчатки n=112 n=99 n=83 n=14 ЭТ-1 0,87 1,65 1,96 2,35 (фмоль/мл) (0,46; 1,36) (0,71; 2,02) (1,55; 2,33) (1,18; 3,53) p=0,035 р=0,001 p1=0,049 NOx 4,35 1,07 0,92 0,53 (мкг/мл) (3,50; 5,29) (0,80; 1,60) (0,46; 1,53) (0,34; 0,92) р=0,001 р=0,001 р=0,001 р1=0,022 NOx 94565,2 23260,9 20000,0 11521,7 (фмоль/мл) (76086,9; (17391; (10000,0; (7391,3; 115000,0) 34782,6) 33260,9) 20000,0) К=ЭТ-1/NOx 9,20 70,93 98,0 203,96 -6 x 10 (6,05; 11,84) (40,83; 58,08) (70,05; 155,0) (159,65; 176,5) Примечание: n-количество глаз, p – уровень статистически значимых различий по сравнению с контролем; p1- уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с неосложненным течением ПВХРД (Критерий Манна-Уитни). Предложенный нами коэффициент отражает преобладание вазоконстрикторного или вазодилатирующего эффекта. У пациентов бурятской национальности мы получили аналогичные результаты. Среди 12 пациентов с отслойками сетчатки обеих этнических групп этот коэффициент оказался максимальным и превышал норму на два порядка. В связи с этим, предложенный коэффициент может применяться в качестве предиктора осложнений ПВХРД. Обнаружено, что в слезной жидкости здоровых лиц русской и бурятской национальностей увеличивался уровень VEGF по сравнению с больными. Также установлено, что у пациентов обеих национальностей заметно повышается содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД, что является свидетельством развития репаративных процессов (рис. 1). * * ** ** *** *** нг/мл 40 35 30 ♦ ♦ 25 20 15 Русские Буряты 10 5 0 Контрольная группа Неосложненные ПВХРД, ПВХРД осложненные ретинальными разрывами ПВХРД, осложненные отслойкой сетчатки * - уровень статистически значимых различий по сравнению с контролем; ** - уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с неосложненным течением ПВХРД; ***- уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с ПВХРД, осложненных разрывами; ♦ - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими. Рис. 1. Уровень VEGF в слезной жидкости у пациентов русской и бурятской национальностей с неосложненным и осложненным течением ПВХРД Мы изучили зависимость концентрации вазоактивных веществ от генотипов, а также изменение содержания эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF при сочетании полиморфных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr). На концентрацию эндотелина-1 в слезной жидкости оказывал влияние генотип EDN1 (Lys198Asn). Установлено, что в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень эндотелина-1 среди 13 носителей генотипов Asn/Asn и Lys/Asn выше по сравнению с гомозиготами по нормальной аллели Lys. У пациентов с ПВХРД обеих национальностей среди носителей генотипа Lys/Asn и Asn/Asn содержание эндотелина-1 в слезной жидкости было выше по сравнению со здоровыми резидентами, обладателями аналогичных генотипов в контрольных группах (табл. 5). Таблица 5 Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) в слезной жидкости пациентов с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальностей в зависимости от генотипов гена EDN1 (Lys198Asn); Ме (25-й; 75-й персентили) Генотип Lys/Lys Lys/Asn Asn/Asn Русские Контрольная 1,39 0,88 0,87 группа (1,10; 1,95) (0,53; 1,51) (0,79; 3,23) n=112 Пациенты с 1,12 2,1 2,7 ПВХРД (0,89; 1,17) (1,99; 2,10) (2,19; 3,16) n=196 p=0,008 р1=0,001 p1 =0,001 Буряты Контрольная 0,92 0,61 1,35 группа (0,80; 1,04) (0,44; 1,76) (0,91; 1,73) n=84 р2=0,001 Пациенты с 0,65 2,0 2,13 ПВХРД (0,45; 0,94) (1,44; 2,08) (1,76; 2,35) n=117 p =0,001 p =0,001 p1 =0,001 p1 =0,008 р2=0,001 Примечание: n – количество глаз; p – уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий с генотипом Lys/Lys; p2 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни). Таким образом, наличие патологического аллельного триплета Asn полиморфизма EDN1 (Lys198Asn) обуславливают высокое содержание эндотелина-1 в слезной жидкости у гетерозигот Lys/Asn и гомозигот Asn/Asn. Продукция оксида азота и содержание в слезной жидкости его метаболитов зависит от полиморфизма фермента eNOS (С786Т). Среди обладателей генотипа Т/Т русской национальности, у которых обнаружены 14 периферические дистрофии сетчатки, уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости ниже, чем у генотипа С/С. И наоборот, у представителей бурятской национальности с ПВХРД содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости выше у гомозигот по аномальной аллели Т, чем у носителей С/С генотипа. Снижение уровня метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД, возможно, связано с изменением активности эндотелиальной NO-синтазы – продукта полиморфного гена. У пациентов с ПВХРД бурятской национальности концентрация VEGF в плазме крови и слезной жидкости у носителей генотипа G/G полиморфизма VEGFA (C634G) существенно выше, чем у гомозигот С/С. В русской этнической группе обнаружено повышение уровня VEGF в плазме крови у носителей генотипа G/G по сравнению с гомозиготами по нормальной С-аллели. Различия в генах, регулирующих сосудистый тонус, могут сказываться на уровне продукции кодируемых белков и, тем самым, на соотношении вазоконстрикторов и вазодилататоров. В связи с этим полиморфизм генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) представляет значительный интерес, т.к. именно эти белки вносят наибольший вклад в регуляцию сосудистого тонуса. Мы оценили распространенность сочетания отдельных полиморфизмов генов сосудистой регуляции в норме и при ПВХРД. Под сочетанием полиморфных вариантов генов мы принимаем комбинацию гомозигот по аномальной аллели двух и более генов. В русской этнической группе при сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена eNOS-786 (C/C) и VEGFA-634 (G/G) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости выше, а метаболитов оксида азота – ниже. Подобные результаты получены при сочетании генотипов eNOS-786 (C/C) и EDN1-198 (Asn/Asn). А концентрация VEGF в слезной жидкости резко снижена при сочетании аномальных генотипов eNOS-786 (T/T) и VEGFA634 (G/G). При сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена VEGFA-634 (G/G) и EDN1-198 (Asn/Asn) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости пациентов с ПВХРД бурятской национальности оказался выше, а метаболитов оксида азота – заметно ниже (табл. 6). 15 Таблица 6 Уровень эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости бурят с ПВХРД при сочетании полиморфных вариантов генов EDN1(Lys198Asn), AGT(Met235Thr) и VEGF (C634G) VEGFA-634 VEGFA-634 VEGFA-634 VEGFA-634 (C/C) + (G/G) + (C/C) + (G/G) + EDN1-198 EDN1-198 AGT-235 AGT-235 (Lys/Lys) (Asn/Asn) (Met/Met) (Thr/Thr) ЭТ-1 1,1 1,6 0,8 1,7 (фмоль/мл) (0,8; 1,2) (1,2; 1,6) (0,6; 1,1) (1,2; 2,2) p=0,023 p=0,010 NO (мкг/мл) 1,75 0,76 1,59 0,79 (1,56; 1,95) (0,69; 0,85) (0,97; 2,76) (0,54; 1,01) p=0,031 p=0,047 VEGF 22,0 22,1 25,2 16,9 (нг/мл) (17,3; 60,5) (19,9; 23,5) (14,9; 26,8) (11,2; 25,3) p=0,05 Примечание: р – уровень статистически значимых различий по сравнению с сочетанием генотипов по нормальным аллелям (Критерий Манна-Уитни). Очевидно, уникальный ансамбль аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) может отчасти определять характер индивидуального реагирования в механизмах развития ПВХРД. В связи с этим нами был изучен уровень эндотелина-1 и метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости и плазме крови у здоровых лиц и пациентов с ПВХРД с учетом аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr). Полученные результаты подтвердили, что ПВХРД является полигенным заболеванием. В результате мутаций структура гена или промотора участка может менять скорость транскрипции, стабильность мРНК или качество и активность продуцируемого белка. Это, в конечном итоге, сказывается на активности регуляторных молекул. Решающее значение в регуляции сосудистого тонуса придается эндотелиальным факторам. Одно из направлений функционирования эндотелия – его участие в формировании адекватного кровотока, что обеспечивается согласованием агрегатного состояния крови и тонуса сосудов. Сочетание на эндотелии вазоконстрикторов и вазодилататоров в физиологических условиях является основой для адекватного кровотока, особенно в сосудах микроциркуляции [Кузник Б.И., 2012; Лупинская З.А., 16 2003]. Эндотелиальный слой регулирует местный сосудистый тонус и участвует в формировании системных гемодинамических реакций, являясь конечным звеном нейрогенной и гуморальной регуляции сосудистого тонуса, где эта реакция реализуется и моделирует различные внутриклеточные процессы. Таким образом, получены новые сведения о роли полиморфизма генов молекул регуляции сосудистого тонуса в механизмах развития периферических витреохориоретинальных дистрофий и их осложнений. Концептуальная схема патогенеза ПВХРД представлена на рис. 2. Усиление ретинальной гипоксии Гипоксия Ишемия ПВХРД Апоптоз Развитие осложнений ПВХРД Промотер гена эндотелина-1 VEGF Проэндотелин-1 Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF) Гладкомышечная клетка «Большой» ЭТ-1 Пролиферация эндотелиоцитов, развитие сосудов Вазоконстрикция ЭТв2 ЭПФ Просвет сосуда Изменение регионарной гемодинамики ЭТ-1 ЭТА ЭТв1 Эндотелиальная клетка Клеточная пролиферация Вазодилатация NO eNOS Рис. 2 Концептуальная схема включения отдельных звеньев патогенеза в развитие осложнений ПВХРД Мы считаем, что исследование генов молекул сосудистой регуляции может оказаться востребованным для прогнозирования развития ПВХРД и его осложнений. Полученные сведения о наличии полиморфизма генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr), EDN1 (Lys198Asn) и VEGFA (C634G) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска развития ПВХРД. ВЫВОДЫ 1. Встречаемость полиморфизмов генов сосудистой регуляции у пациентов с ПВХРД зависит от этнической принадлежности. У лиц бурятской национальности с ПВХРД превалирует аллель С, а у русских – 17 аллель Т полиморфизма гена еNOS (C786T). Среди здоровых лиц бурятской национальности чаще встречается генотип С/С, а с ПВХРД – G/G полиморфизма VEGFA (C634G). Наличие аллели G полиморфизма VEGFA (C634G) располагает их к развитию ПВХРД. Генотип Met/Met полиморфизма гена AGT Met235Thr среди русских с ПВХРД встречается в 4 раза чаще, чем среди бурят. В бурятской этнической группе обладатели аномальной аллели полиморфизма гена AGT Met235Thr в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск формирования ПВХРД по сравнению с таковыми русской национальности. 2. Уровень эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД обеих этнических групп увеличен по сравнению со здоровыми лицами. Среди пациентов с ПВХРД русской национальности содержание эндотелина-1 в слезной жидкости в 2,3 раза, а бурятской – в 1,7 раза выше, чем у здоровых. Содержание метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских. Уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальности ниже по сравнению с контрольной группой. Уровень VEGF в слезной жидкости у больных ПВХРД русской и бурятской национальностей ниже, чем у здоровых лиц. 3. У пациентов обеих национальностей заметно увеличивалось содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД. У русских содержание VEGF в слезной жидкости контрольной группы и пациентов с ПВХРД, осложненными ретинальными разрывами, ниже в два раза по сравнению с резидентами бурятской национальности. 4. Коэффициент К, отражающий соотношение концентрации эндотелина-1 и метаболитов оксида азота существенно повышался по мере развития осложнений ПВХРД. У пациентов с ретинальными разрывами, предложенный коэффициент К увеличивался в 10 раз, а с отслойками сетчатки – в 23 раза по сравнению с неосложненным течением заболевания. 5. Наличие аллели Asn полиморфизма гена EDN1 (Lys198Asn) обуславливает повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД не зависимо от национальности. У обладателей генотипа Asn/Asn выявлялся наиболее высокий уровень, генотипа Lys/Asn – средний и генотипа Lys/Lys - низкий уровень эндотелина-1 в слезной жидкости. Концентрация эндотелина-1 у пациентов ПВХРД больше относительно здоровых лиц. 18 6. У пациентов с ПВХРД бурятской национальности - носителей Т/Тгенотипа полиморфизма гена eNOS (C786T) уровень метаболитов оксида азота в плазме крови выше по сравнению с С/С генотипом. Носительство аллели С у русских и аллели Т гена eNOS (C786T) у бурят в гомо- и гетерозиготоном состоянии определяет более высокое содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД. При ПВХРД содержание метаболитов NO в слезной жидкости у бурят, которые являются носителями аномальной аллели Т в гомозиготном и гетерозиготном состоянии, в 6 раз выше по сравнению с пациентами русской национальности. 7. Носительство аллели G полиморфизма гена VEGFA (C634G) в гомо- и гетерозиготном состоянии способствует более высокой продукции ростового фактора у здоровых и пациентов с ПВХРД не зависимо от национальности. У больных-носителей генотипа С/С и С/G падает содержание VEGF в плазме крови. У пациентов с ПВХРД русской этнической группы, обладателей генотипа G/G, концентрация VEGF в слезной жидкости в 5,5 раз выше по сравнению с аналогичной группой бурятской национальности. 8. В плазме крови пациентов бурятской национальности уровень VEGF увеличивался при сочетании аномальных генотипов генов EDN1 (Lys198Asn) и VEGF (C634G). При сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена VEGFA-634 (G/G) и EDN1-198 (Asn/Asn), генотипов VEGFA634 (G/G) и AGT-235 (Thr/Thr) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости наиболее сильно повышался, а метаболитов оксида азота – снижался. В русской этнической группе при сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена eNOS-786 (C/C) и VEGFA-634 (G/G), eNOS-786 (C/C) и EDN1-198 (Asn/Asn) концентрация эндотелина-1 в слезной жидкости росла, а метаболитов оксида азота – падала. Содержание VEGF в слезной жидкости резко снижено при сочетании аномальных генотипов eNOS-786 (T/T) и VEGFA-634 (G/G). Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России: 1. Серебренникова С.В. Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синтазы (C786T) у больных с периферическими витреохориоретинальными дистрофиями в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / С.В. Серебренникова, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский 19 вестник. – 2012. - №1. – С. 17-21. - Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения 01.12.2012). 2. Серебренникова С.В. Содержание эндотелина-1 в плазме крови и слезной жидкости у больных с периферической витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / С.В. Серебренникова, Л.А. Голубина, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. – 2012. - №2. – С. 17-19. - Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения 15.03.2013). 3. Серебренникова С.В. Полиморфизм гена эндотелина-1 (Lys198Asn) у больных с периферической витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае / С.В. Серебренникова, Л.А. Голубина, Ю.А. Витковский // Дальневосточный медицинский журнал. – 2012. - №4. – С. 76-78. 4. Серебренникова С.В. Генетический полиморфизм эндотелина-1 (Lys198Asn) у пациентов с периферической витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае / С.В. Серебренникова, А.А. Петров, Ю.А. Витковский // Молекулярная медицина. – 2013. - №2. - С. 54-56. Работы, опубликованные в других изданиях: 5. Serebrennikova S.V. The levels of endothelin-1 in the plasma of patients with peripheral vitreoretinal degeneration / S.V. Serebrennikova, Yu.A. Vitkovsky // Trombosis research: Abstracts and proceedings of the 22 nd Internashional Congress on Thrombosis. Nice, France, 6 - 9 October, 2012. – Vol.130. – P. 140. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Ген AGT - ген ангиотензиногена Ген EDN1 - ген эндотелина-1 ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция ПВХРД - периферические витреохориоретинальные дистрофии ЭТ-1 - эндотелин-1 NO - оксид азота NOx - суммарное количество метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов) eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота HIF-1 - фактор, индуцируемый гипоксией VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста 20
