EPISCREEN PLUS ™ - определение α -глюкозидазы (25 тестов) Обновление 27.04.2012 Сокращения CLSI – Институт клинических и лабораторных стандартов. CV – коэффициент вариации IU – международная единица LOD – предел обнаружения LOQ – предел линейности NAG – нейтральная альфа-глюкозидаза OD – оптическая плотность PNP – пара (4)-нитрофенол PNPG - пара (4)-нитрофенол-альфа-Д-глюкопиранозид WHO – Всемирная организация здравоохранения Набор EPISCREEN PLUS рассчитан на определение ферментативной активности не менее 25 образцов (в том числе корректирующее вещество). Состав набора: Реагент 1 (5 мл): реакционный буфер (pH6,8), содержащий 1% SDS. Реагент 2 (0,15 мл): раствора субстрата (PNPG в DMSO). Реагент 3 (5 мл): раствор ингибитора (буфер, содержащий глюкозу). Реагент 4 (60 мл): остановочный (стоп) буфер (0,02 М NaOH). Реагент 5 (1 мл): стандартный раствор (5мМ PNP). Реагент 6 (60 мл): буфер для разведения (0,02 М NaOH + 0,1% SDS) Материалы, не входящие в состав набора: - Спектрофотометр с фильтром 405 нм. - Теплая водяная баня /термошейкер. - Расходные материалы: планшет на 96 лунок, наконечники на 1,5 мл, пробирки типа Eppendorf). Основные сведения. Нейтральная изоформа α-глюкозидазы секретируются исключительно в придатках яичек и является достоверным маркером функциональной способности придатков яичек. У пациентов с азооспермией и нормальной концентрацией андрогенов в крови, активность нейтральной альфаглюкозидазы в семенной плазме является специфическим маркером секреторной функции эпидимиса. У пациентов с двухсторонней обструктивной азооспермией «выше» придатков (между эпидидимисом и эякуляторным каналом) наблюдаются очень низкие концентрации этого фермента в эякуляте. И, наоборот, у пациентов с азооспермей, вследствие нарушений процессов сперматогенеза, обструкцией между придатками и яичками или в самих яичках, сохраняется нормальная активность этого фермента в эякуляте. Таким образом, определение активности αглюкозидазы в семенной плазме мужчин с азооспермией, в большинстве случаев позволяет дифференцировать причину азооспермии. Низкая активность нейтральной α-глюкозидазы в семенной плазме пациентов с олигозооспермией, может указывать на частичную обструкцию эпидидимиса, связанную с инфекциями или воспалительными заболеваниями. У пациентов с нормальной концентрацией сперматозоидов активность α-глюкозидазы в семенной плазме коррелирует с изменениями морфологии средней части и хвоста сперматозоида при окраске по Шорру. Принцип метода. Альфа-глюкозидаза катализирует (pH= 6,8; Т=37°C) превращение субстрата 4-нитрофенил-адглюкопиранозида (PNPG) в глюкопиранозид и 4-нитрофенол, как показано ниже. Желтый цвет последнего продукта измеряется спектрофотометрически при 405 нм. PNPG + альфа-глюкозидаза → альфа-D-глюкопиранозид + PNP (желтый) Поскольку реакционный буфер содержит SDS, кислая форма альфа- глюкозидазы (простатическая), селективно ингибируется. Это позволяет определить непосредственно нейтральную форму фермента. Определение активности фермента Активность α-глюкозидазы выражается в МЕ в литре (или мМЕ/мл). Одна единица способна высвобождать 1 мкмоль PNP из молекулы PNPG в минуту, при определенных условиях (рН = 6,8, T = 37°C) - 7. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ EpiScreen Plus ™ был разработан для оценки нейтральной формы фермента. Основными преимуществами нового комплекта являются: 1) оценка нейтральной формы фермента 2) сокращение времени инкубации 3) малый объем образца спермы 4) использование калибровочного графика для вычисления результатов 5) наличием ингибитора (коррекция фона) В таблице 1 показано сравнение методов Episcreen ™, EpiScreen Plus ™, и метода ВОЗ. Таблица 1: Сравнение Episcreen ™, EpiScreen Plus ™ и метода ВОЗ. активность ферментов инкубационный период Стандартная кривая Коррекция фона объем пробы Общая 4ч Нейтральная 2ч Нейтральная 2ч 125 мкл PNP глюкоза 20 мкл PNP кастаноспермин 15 мкл EpiScreen PlusTM и ВОЗ метод тестировались параллельно на 144 образцах семенной плазмы, полученной от 94 пациентов (доноры и 50 мужчин после vas-эктомии (отрицательный контроль) соответственно). Метод сравнения показал, что оба исследования дают одинаковые результаты. EpiScreen Plus ™ немного отличаются от ВОЗ: а) реакционным буфером (рН 6,8) б) использованием глюкозы вместо кастаноспермина в качестве ингибитора. Процесс ингибирования α-глюкозидазы глюкозой (ингибирование продукта) является рНзависимым и объясняется связыванием глюкозы с сайтом связывания моносахаридов α–глюкозидазы. Наши экспериментальные данные показали дозозависимое снижение активности фермента. Концентрация глюкозы в растворе ингибитора EpiScreen Plus ™ была оптимизирована для получения показателей, коррелирующих с методом ВОЗ, использующем в качестве ингибитора кастаноспермин. ВОЗ рекомендует применять только два образца для внутреннего контроля для коррекции фоновой концентрации. Наши эксперименты показали, что вариабельность фона образцов спермы довольно большая (+ / 20%). Мы рекомендуем использовать контроль коррекции фоновой концентрации для каждого образца семенной плазмы. Выполнение исследования. Все параметры были рассчитаны на основе руководства Института клинических лабораторных стандартов. Диапазон измерений: 2.32-144 мМЕ/мл Чувствительность: 96,0% (вазэктомия / нормоспермия) Специфичность: 93,6% (вазэктомия / нормоспермия) Точность: Низкие значения: 0,96 мМЕ/мл Высокие значения:: 3,70 мМЕ/мл Коэффициент вариации в рамках одной постановки: 3,08% Коэффициент вариации между постановками: 10,52% Порог отсечки (Cutoff): 6,35 мМЕ / мл или19,98 мМЕ в эекляте (с поправкой на объем эякулята) Условия и срок хранения. Набор EpiScreen Plus ™ необходимо хранить при температуре 2-8°C, в защищенном от солнечного света месте, стабильность набора 24 месяца. Проверка перед использованием. Не использовать продукт, в случае, если пробка на флаконах открыта или продукт поставлен в нарушенной упаковке. Хранить при температуре 2-8°C. В реагенте 1 может возникнуть осадок, который исчезает при нагревании до 37°C. Типы образцов. Анализ может быть выполнен на образце свежей или замороженной семенной плазмы. Методика проведения исследования Перед использованием нагрейте реагенты 1, 2, и 3 до 37°C в течение 30 минут. Мы рекомендуем использование терморегулируемой водяной бани для оптимального нагрева образцов. Не инкубируйте в воздушном инкубаторе, так как это может привести к нарушению результатов анализа. Выполните следующие шаги: 1. Для каждого анализируемого образца: - Приготовить реакционный раствор: 3 мкл реагента 2 в 147 мкл реагента 1 - Приготовить раствор ингибитора: 3 мкл реагента 2 в 147 мкл из реагента 3 2. Внести по 20 мкл образца в две пробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл 3. Добавить 130 мкл реакционного раствора в одну пробирку (образец) и 130 мкл раствора ингибитора в другую (проба с глюкозой, коррекция фона). 4. Перемешать и инкубировать точно 2ч при 37°C 5. За время инкубации необходимо подготовить растворы для построения калибровочной кривой. Приготовьте самый высокий стандарт (200 мкм) путем растворением 100 мкл реагента 5 в 2400 мкл реагента 6. Для приготовления других стандартов используйте разведения, как указано в таблице 2. Реагент 6 используется как «нулевой» стандарт. Таблица 2: Стандартные разведения PNP Стандарт «200 мкл» (мкл) Reagent 6 (мкл) 375 250 125 25 0 125 250 375 475 500 Концентрация калибратора (мкл) 150 100 50 10 0 6. Через 2 ч, остановите инкубацию путем добавления 1 мл 4 реагента 4 и перемешайте (с использованием Vortex). 7. Внесите по 200 мкл всех стандартов / образцов в лунки планшета. 8. Считайте абсорбцию при 405 нм. Расчет результатов по калибровочному графику. Вычтите значение ОП нулевого стандарта из всех значений ОП стандартов (дельта ОП). Отложите значения дельта ОП (Y-ось) против стандартных концентраций (по оси Х) и постройте график линейной регрессии. Коэффициент R2 должно быть не менее 0,99. Пример показан ниже. Вычисление активности фермента: Вычтите значение ОП нулевого стандарта из всех значений ОП образцов и соответствующих образцов с глюкозой. Вычтите значение дельта OD образцов с глюкозой из значения дельта ОП образца (коррекция фона). Рассчитайте соответствующие значения концентрации PNP путем деления ОП скорректированного по фону образца на угол наклона стандартной калибровочной кривой. Окончательно активность фермента (мМЕ / мл) вычисляется путем умножения значения PNPх0,479. (См. ниже). Пример расчета 1. ОП образца=0,845; ОП образца с глюкозой=0,06, угол наклона калибровочного графика 0,0097; 2. Коррекция по фону семенной плазмы=0,845-0,06=0,785; 3. Концентрация PNP=0,785/0,0097=80,93мкМ; 4. Активность фермена-80,93*0,479=38,76 Полученная активность фермента должна быть умножена на объем эякулята для оценки активности во всем объеме эякуляте. Примечание Стандартная кривая включает отдельные точки от 0 до 200 мкМ, поскольку значение PNP в большинстве случаев находятся в этих пределах. Экспериментально показана, что линейность гарантирована до 300 мкМ. При желании можно изменить калибровочный график до 300 мкМ, что соответствует активности фермента 144 мМЕ/мл. При более высокой активности рекомендуется разведение образца. Фактор коррекции. Фактор получен с учетом разведения образца, времени инкубации (120 мин). В этом исследовании образец начальный объем пробы 20 мкл в конце доводится до объема 1150 мкл (20 мкл образца + 130 мкл реакционного буфера + 1000 мкл стоп буфера). Окончательный фактор разведения - 57,5. Активность фермента определяется образованием PNP в минуту. Таким образом, полученный результат надо умножить на фактор разведения и разделить на 120 для учета временного фактора (57,5/120=0,479). Предупреждение. Этот тест направлен на помощь в диагностике, как и другие биологические тесты: интерпретация результатов должна проводиться в рамках клинических и анамнестических данных. Должны быть исключены другие случаи недостаточности функции эпидидимиса, например, гипоандрогения или тяжелая атрофия яичек. Библиография.