На правах рукописи Симонова Евгения Юрьевна ПОЛОВЫЕ
реклама
На правах рукописи Симонова Евгения Юрьевна ПОЛОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ И ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У КРЫС ВИСТАР 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на базе биологического факультета ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» и в ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Макарова Ольга Васильевна кандидат биологических наук Косырева Анна Михайловна Официальные оппоненты: ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава РФ, доктор медицинских наук, профессор Ванько Людмила Викторовна ведущий научный сотрудник лаборатории анализа изображений клеточных структур и тканей факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, доктор медицинских наук Буравков Сергей Валентинович Ведущее учреждение: ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава РФ Защита диссертации состоится «26» сентября 2013 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН Автореферат разослан « » августа 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность В литературе представлено большое число работ, посвященных изучению половых различий частоты возникновения и тяжести течения инфекционно-воспалительных, аутоиммунных и онкологических заболеваний у человека. По данным клинических исследований у мужчин чаще развиваются и тяжелее протекают заболевания, связанные с вирусными, бактериальными, грибковыми и паразитарными инфекциями (Fish E.N., 2008; Gilliver S.C., 2010; Klein S.L., 2012), а у женщин – аутоиммунные воспалительные процессы (Bouman A. et al., 2005; Angele M.K. et al., 2006; Harbo H.F. et al., 2013). Так, среди пациентов с аутоиммунными заболеваниями около 80% составляют женщины, а у мужчин показатель смертности от сепсиса в 2,5 раза выше, чем у женщин (Rettew J.A. et al., 2008; Klein S.L., 2012). Половой диморфизм частоты развития и тяжести течения инфекционно-воспалительных и аутоиммунных заболеваний особенно ярко проявляется после полового созревания, что, очевидно, обусловлено влиянием половых гормонов на морфофункциональное состояние иммунной системы (Bouman A. et al., 2005; Angele M.K. et al., 2006; Klein S.L., Roberts C.W., 2010). Показано, что у женщин репродуктивного возраста выраженность клеточно-опосредованного и гуморального иммунного ответа выше, чем у мужчин (Knöferl M.W. et al., 2002; Angele M.K et al., 2006; Fish E.N., 2008). По данным литературы половые гистофизиологические различия иммунной системы определяются кариотипом и влиянием стероидных половых гормонов – эстрогенов, прогестинов и андрогенов (Olsen N.J., Kovacs W.J., 1996; Bouman A. et al., 2005; Angele M.K. et al., 2006; Klein S.L., Roberts C.W., 2010). Половые различия, обусловленные кариотипом, связаны с экспрессией генов половых хромосом (Fish E.N., 2008). Эти гены кодируют специфические белки, которые участвуют в запуске и регуляции механизмов врожденного и адаптивного иммунного ответа. К таким белкам относятся рецепторы интерлейкинов, толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLRs), транскрипционный фактор FoxP3 (forkhead box P3) и многие другие (Fish E.N., 2008). Половой диморфизм морфофункционального состояния иммунной системы, обусловленный воздействием стероидных половых гормонов, связан с уровнем их продукции и особенностями метаболизма, а также с выраженностью экспрессии рецепторов к половым гормонам клетками иммунной системы (Klein S.L., Roberts C.W., 2010). Уровень стероидных половых гормонов в сыворотке крови зависит от пола, возраста, репродуктивного статуса, фазы эстрального или менструального цикла и других факторов (Gilliver S.C., 2010). Исследования, посвященные анализу половых гистофизиологических различий иммунной системы у человека, в основном касаются мужчин и женщин репродуктивного возраста. В обзоре A. Bouman и соавт. (2005) суммированы многочисленные данные по этой проблеме. Так, выявлено, что по сравнению с мужчинами у женщин выше содержание иммуноглобулинов в 3 сыворотке крови и уровень продукции противовоспалительных цитокинов иммунокомпетентными клетками (Mullen A.C. et al., 2001; Latham K.A. et al., 2003; Bouman A. et al., 2004). Однако в этих работах не учитывается фаза менструального цикла у женщин, хотя во многих исследованиях показано, что морфофункциональное состояние иммунной системы изменяется циклически в зависимости от колебаний уровня эстрогенов и прогестинов в сыворотке крови (Fish E.N., 2008; Lee S. et al., 2010; Gilliver S.C., 2010). Исследования, посвященные изучению половых гистофизиологических различий иммунной системы у детей, фрагментарны. I.M. Lisse и соавт. (1997) выявили, что по сравнению с мальчиками у девочек в возрасте до 6 лет выше абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов и Т-хелперов и ниже процентное содержание натуральных киллерных клеток в периферической крови. В работе J.A. Bartlett и соавт. (2001) показано, что у девочек в возрасте 8-12 лет выше фагоцитарная активность гранулоцитов. V. Wiegering и соавт. (2009) при исследовании цитокинового профиля здоровых детей в возрасте от 0 до 18 лет выявили, что по сравнению с девочками у мальчиков до 6 лет выше уровень продукции лимфоцитами ИЛ-2, тогда как у девочек старше 12 лет выше уровень продукции ИНФ-γ. Работы по изучению половых гистофизиологических различий иммунной системы у экспериментальных животных немногочисленны. В исследовании M.A. De Leόn-Nava и соавт. (2009) показано, что у самок мышей линии Balb/c по сравнению с самцами выше уровень продукции ИНФ-γ и ниже уровень продукции ИЛ-4 клетками селезенки, однако авторами не учитывалась фаза эстрального цикла у самок. Г.В. Ковалевский (1996) при изучении развития тимуса в постнатальном онтогенезе крыс выявил половые различия массы этого органа у животных в возрасте 2-5 недель. Таким образом, в литературе отсутствуют систематизированные сведения о половых различиях и возрастных особенностях морфофункционального состояния иммунной системы у человека и лабораторных животных. В связи с вышеизложенным необходимо проведение комплексного морфологического и функционального исследования иммунной системы у экспериментальных животных в разные периоды постнатального онтогенеза с учетом пола. Цель работы: изучить особенности морфофункционального состояния иммунной системы у самцов и самок крыс Вистар в разные периоды постнатального развития. Задачи исследования: 1. Определить содержание стероидных гормонов в сыворотке крови у новорожденных, десятидневных и половозрелых самцов и самок крыс Вистар. 2. Исследовать гистофизиологические особенности тимуса и селезенки, определить уровень продукции цитокинов клетками селезенки и провести анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у новорожденных самцов и самок крыс Вистар. 4 3. Выявить гистофизиологические особенности тимуса и селезенки, оценить уровень продукции цитокинов клетками селезенки и провести анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у самцов и самок крыс Вистар в препубертатном периоде. 4. Исследовать гистофизиологические особенности тимуса и селезенки, определить уровень продукции цитокинов клетками селезенки и провести анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у половозрелых самцов и самок крыс Вистар. 5. Изучить возрастные изменения морфофункционального состояния тимуса и селезенки, цитокинового профиля и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у самцов и самок крыс Вистар. Научная новизна По данным морфологического и морфометрического исследования органов иммунной системы, определения цитокинового профиля и анализа субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови половые различия морфофункционального состояния иммунной системы у крыс Вистар наиболее выражены в неонатальном периоде и в периоде половой зрелости, тогда как в препубертатном периоде различия минимальны. Иммунная система новорожденных и половозрелых самок крыс Вистар по сравнению с самцами характеризуется морфофункциональными признаками более высокой активности. По сравнению с самцами у новорожденных самок выше показатели объемной доли коркового вещества тимуса, уровня продукции Тх1-цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-γ и провоспалительного цитокина ФНО-α клетками селезенки, абсолютного и относительного количества Т-хелперов, незрелых (CD4+CD8+), активированных и регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови. По сравнению с самцами у половозрелых самок в фазе проэструса выше показатели ширины субкапсулярной зоны тимуса, уровня продукции ФНО-α клетками селезенки, абсолютного и относительного количества Т-хелперов и активированных Т-лимфоцитов в периферической крови, а также фагоцитарной активности гранулоцитов. Возрастные изменения морфофункционального состояния иммунной системы у самцов и самцов крыс Вистар сходны и характеризуются морфологическими и функциональными признаками созревания и активации. Практическая значимость Полученные данные о половых различиях и возрастных особенностях морфофункционального состояния иммунной системы у крыс Вистар необходимо учитывать при доклинической оценке эффективности действия противовоспалительных и иммуномодулирующих лекарственных препаратов, при разработке подходов к проведению вакцинации и лечению аутоиммунных и инфекционно-воспалительных заболеваний с учетом пола. 5 Внедрение в практику Материалы диссертационного исследования используются в лекционном курсе на кафедре клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Апробация работы Результаты исследования и основные положения работы доложены и обсуждены на Х Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2012); ХХ Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013); VI Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2013); совместном заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и научных лабораторий ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (май, 2013). Публикации По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 статьи представлены в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», выводов, списка литературы. Работа изложена на 178 страницах машинописного текста и содержит 20 таблиц и 54 рисунка. Список литературы включает 199 источников (15 отечественных и 184 иностранных). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалы исследования Работа была выполнена на 120 особях крыс Вистар обоего пола (питомник «Столбовая»). Крыс содержали в условиях вивария при температуре 20-22°С и относительной влажности 60-70%. Доступ к пище и воде был свободным. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. На проведение эксперимента было получено разрешение биоэтической комиссии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (протокол №5 от 12.03.2008 г.). Исследование было выполнено в осенне-зимний период. Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира и проводили забор органов иммунной системы (тимуса и селезенки) и периферической крови из шейных вен. С целью изучения половых различий и возрастных особенностей морфофункционального состояния иммунной системы были выделены 6 3 экспериментальные группы крыс: новорожденные (n=60; 30 самцов и 30 самок), десятидневные (n=40; 20 самцов и 20 самок), половозрелые (n=20; 10 самцов и 10 самок). Возраст новорожденных крыс составлял 1-2 дня, возраст половозрелых животных – 2-2,5 месяца. Выбор возраста животных экспериментальных групп проводили с учетом данных литературы по содержанию половых гормонов в сыворотке крови и функциональному состоянию иммунной системы в разные периоды постнатального онтогенеза (Гриффин Дж., Охеда С., 2008; Ярилин А.А., 2010). Неонатальный период (первые 4 дня после рождения у крыс) характеризуется высоким уровнем эстрогенов в сыворотке крови (Берштейн Л.М., 1998). Иммунная система новорожденных особей находится в состоянии физиологического иммунодефицита, который обусловлен функциональной незрелостью иммунокомпетентных клеток (Chirico G., 2005). Десятидневный возраст у крыс соответствует препубертатному периоду постнатального онтогенеза у человека. Этот период характеризуется низким уровнем половых гормонов в сыворотке крови (Гриффин Дж., Охеда С., 2008). В этом возрасте наблюдается интенсивное созревание иммунной системы и повышение функциональной активности клеток, обеспечивающих реакции врожденного и адаптивного иммунитета (Ярилин А.А., 2010). Половое созревание у крыс наступает в возрасте 5-6 недель после рождения и характеризуется высокой функциональной активностью иммунной системы (Suckow M.A. et al., 2005). Методы исследования Разведение животных и получение потомства. Для получения новорожденных и десятидневных крыс использовали 15 половозрелых животных (10 самок и 5 самцов). Продолжительность беременности у самок составляла 21-23 сут. Потомство одной самки было представлено 6-8 особями. Определение фазы эстрального цикла. Фазу эстрального цикла у половозрелых самок определяли по влагалищным мазкам, которые фиксировали в жидкости Лейшмана и окрашивали по Романовскому-Гимзе. В мазках оценивали соотношение различных клеточных элементов (лейкоцитов, эпителиальных клеток, содержащих ядра, и безъядерных чешуек). По данным цитологического исследования влагалищных мазков отбирали самок с устойчивым 4-суточным эстральным циклом, а из них – самок в фазе проэструса. По данным B.F. Bebo и соавт. (2001) фаза проэструса характеризуется более высоким уровнем эстрогенов и прогестинов в сыворотке крови по сравнению с другими фазами эстрального цикла. Гистологические методы. Тимус и селезенку фиксировали в жидкости Буэна в течение 24 ч, проводили по спиртам восходящей концентрации и хлороформу, заливали в парафин, после чего изготавливали гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимические методы. Для выявления Т-зависимой зоны селезенки проводили иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов органа. Демаскировку антигенов осуществляли путем кипячения срезов в цитратном буфере (рН=6,0) в микроволновой печи. Использовали моноклональные антитела кролика к CD3 крысы (маркеру Т-лимфоцитов) в 7 титре 1:100 («Abcam»). Срезы инкубировали с первыми антителами в течение 18 ч во влажной камере при температуре 4°С. В качестве вторых антител использовали полимерную систему иммуногистохимического окрашивания (Universal Immuno-peroxidase Polymer, goat anti-mouse and goat anti-rabbit, «Histofine»). Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали набор DAB-3S kit («Histofine»). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Морфометрические методы. На гистологических препаратах тимуса и селезенки под световым микроскопом оценивали объемную долю структурно-функциональных зон методом точечного счета (Автандилов Г.Г., 1973). Ширину субкапсулярной зоны тимуса измеряли в микрометрах в программе Adobe Photoshop CS4 на изображениях, снятых при ув. 640. Метод проточной цитофлуориметрии. Проводили исследование субпопуляционного состава лимфоцитов и определение фагоцитарной активности гранулоцитов периферической крови методом проточной цитофлуориметрии на приборе Cytomics FC 500 («Beckman Coulter»). В качестве антикоагулянтов при заборе крови использовали ЭДТА (5 мг/мл) или гепарин (50 ЕД/мл). Для анализа основных субпопуляций лимфоцитов использовали антитела фирмы «eBioscience», конъюгированные с FITC (fluorescein isothiocyanate) или РЕ (phycoerythrin): anti-Rat CD3 (маркер Т-лимфоцитов); anti-Rat CD45R (маркер В-лимфоцитов); anti-Rat CD4 (маркер Т-хелперов); anti-Rat CD8а (маркер цитотоксических Т-лимфоцитов); аnti-Rat Foxp3 (маркер регуляторных Т-лимфоцитов); anti-Rat CD25 (маркер активированных Т-лимфоцитов). Проводили подсчет абсолютного и относительного количества лимфоцитов различных субпопуляций и иммунорегуляторного индекса (соотношения CD4/CD8). Процентное содержание Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов вычисляли по отношению к абсолютному количеству лимфоцитов; процентное содержание Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов – по отношению к абсолютному количеству Т-лимфоцитов; процентное содержание активированных и регуляторных Т-лимфоцитов – по отношению к абсолютному количеству Т-хелперов. Кроме того, в периферической крови у новорожденных самцов и самок оценивали абсолютное и относительное количество незрелых CD4+CD8+ Т-лимфоцитов. Для оценки фагоцитарной активности гранулоцитов использовали набор FagoFlowEx Kit («EXBIO Diagnostics»). Образцом отрицательного контроля служила цельная гепаринизированная кровь; в качестве стимулированного образца использовали кровь с добавлением суспензии Escherichia coli. В каждый из образцов добавляли дигидрородамин 123 (DHR123) и регистрировали флуоресценцию родамина 123, который образуется при окислении DHR123 в процессе респираторного взрыва в активированных гранулоцитах. Определяли среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) в контрольном и стимулированном образцах. Вычисляли индекс стимуляции (отношение СИФ активированных гранулоцитов стимулированного образца к СИФ нестимулированных гранулоцитов образца отрицательного контроля). 8 Культуральные методы. С целью исследования уровня продукции цитокинов из селезенки крыс выделяли клетки с помощью стеклянного гомогенизатора Поттера. Суспензию клеток готовили на полной ростовой среде (RPMI 1640 с добавлением 5% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки, 2 ммоль/л глутамина и 50 мкг/мл гентамицина). Для индукции синтеза и секреции цитокинов суспензию клеток селезенки в концентрации 1×106/мл культивировали в течение 24 ч в 1 мл полной ростовой среды с добавлением конканавалина А (5 мкг/мл) в 24-луночных культуральных планшетах при температуре 37°С в СО2-инкубаторе (5% СО2). По окончании инкубации отбирали супернатанты, которые хранили при температуре -70°С в течение 2 мес. Метод иммуноферментного анализа. В культуральной жидкости клеток селезенки с помощью наборов фирмы «Bender MedSystems» определяли концентрации интерлейкинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6), интерферона гамма (ИНФ-γ), фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α). В сыворотке крови определяли концентрации эстрадиола («Cusabio»), прогестерона («DBC»), тестостерона («DBC»), кортикостерона («IBL»). Измерения проводили с использованием микропланшетного иммуноферментного анализатора Anthos Reader 2010 («Anthos Labtec»). Статистические методы. Цифровые данные проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова в программе Statistica 7.0. Сравнение данных, подчиняющихся нормальному распределению, проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента; в противном случае использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для значений измеряемых показателей вычисляли медиану и интерквартильный размах (Med; 25%-75%) или среднее арифметическое и стандартную ошибку среднего (М±SE). Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Результаты исследования и их обсуждение Сравнительная характеристика морфофункционального состояния иммунной системы у новорожденных самцов и самок крыс Вистар При исследовании уровня стероидных гормонов было показано, что у новорожденных самок по сравнению с самцами в 1,5 раза выше содержание эстрадиола в сыворотке крови (рис. 1). По уровню прогестерона, тестостерона и кортикостерона статистически значимых половых различий выявлено не было. Половые различия уровня эстрадиола у крыс Вистар в неонатальном периоде развития могут быть обусловлены различной активностью фермента ароматазы, осуществляющего превращение андрогенов в эстрогены (Берштейн Л.М., 1998). Показано, что активность ароматазы в яичниках у новорожденных самок крыс значительно выше, чем в семенниках у самцов (Weniger J.P., 1989). По данным морфологического исследования в тимусе у новорожденных самцов и самок крыс Вистар преобладало корковое вещество, которое было представлено рыхло расположенными лимфобластами, а также лимфоцитами и 9 эпителиальными ретикулярными клетками. На всем протяжении коркового слоя обнаруживались многочисленные делящиеся клетки; субкапсулярная зона не выявлялась. Границы между корковым и мозговым веществом были нечеткими. 40 * 35 30 пг/мл 25 20 15 10 5 0 Самцы Самки Рис. 1. Содержание эстрадиола в сыворотке крови у новорожденных самцов и самок крыс Вистар (Med; 25%-75%). * – различия между группами статистически значимы В селезенке у новорожденных самцов и самок крыс Вистар белая пульпа была представлена слабо выраженной зоной периартериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ-зоной). При иммуногистохимическом окрашивании антителами к CD3 Т-лимфоциты ПАЛМ-зоны располагались вокруг центральных артерий в 2-3 ряда. Лимфоидные узелки в селезенке самцов и самок не выявлялись. По данным морфометрического исследования у новорожденных самок по сравнению с самцами был выше индекс отношения объемной доли коркового вещества тимуса к мозговому (рис. 2), что указывает на более интенсивную пролиферацию лимфобластов в корковом слое тимуса. По морфометрическим показателям структурно-функциональных зон селезенки между группами самцов и самок статистически значимых различий выявлено не было. Данные о половых различиях морфофункционального состояния тимуса и селезенки у крыс в неонатальном периоде развития в литературе отсутствуют. Исследования гистофизиологических особенностей органов иммунной системы у новорожденных детей представлены единичными работами, в которых показано, что масса и размеры тимуса и селезенки у мальчиков и девочек не различаются (Megremis S.D. et al., 2004; Azad R. et al., 2011). При исследовании цитокинового профиля новорожденных крыс Вистар было показано, что у самок по сравнению с самцами выше уровень продукции клетками селезенки Тх1-цитокинов ИЛ-2 (в 30 раз) и ИНФ-γ (в 50 раз), а также провоспалительного цитокина ФНО-α (в 15 раз) (рис. 3). В литературе отсутствуют данные о половых различиях цитокинового профиля у крыс в неонатальном периоде развития. В исследовании на свиньях J. de Groot и соавт. (2005) показали, что по сравнению с самцами у новорожденных самок выше уровень продукции Тх1-цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-γ Т-лимфоцитами периферической крови, стимулированными фитогемагглютинином. Более 10 высокий уровень продукции цитокинов, опосредующих реакции клеточного иммунного ответа, указывает на повышенную функциональную активность иммунной системы у новорожденных самок и может быть обусловлен иммуностимулирующим влиянием высоких концентраций эстрогенов. 3 * 2,5 усл. ед. 2 1,5 1 0,5 0 Самцы Самки Рис. 2. Индекс отношения объемной доли коркового вещества тимуса к мозговому у новорожденных самцов и самок крыс Вистар (M±SE). * – различия между группами статистически значимы ИЛ-2 ИНФ-γ 7000 70 6000 4000 3000 40 30 2000 20 1000 10 0 0 Самцы * 50 пг/мл пг/мл 60 * 5000 Самки Самцы Самки ФНО-α 250 пг/мл 200 * 150 100 50 0 Самцы Самки Рис. 3. Уровень продукции цитокинов клетками селезенки у новорожденных самцов и самок крыс Вистар (Med; 25%-75%). * – различия между группами статистически значимы По данным иммунофенотипического анализа основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови у новорожденных крыс Вистар было выявлено, что у самок по сравнению с самцами выше показатели абсолютного 11 и относительного количества лимфоцитов таких субпопуляций, как Т-хелперы, В-лимфоциты, незрелые CD4+CD8+ Т-клетки, активированные и регуляторные Т-лимфоциты (табл. 1, рис. 4). Данные о половых различиях количественного состава основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови у новорожденных крыс в литературе отсутствуют. Показано, что по сравнению с мальчиками у новорожденных девочек выше абсолютное и относительное количество Т-хелперов в крови (Bartlett J.A. et al., 2001). Более высокие показатели числа лимфоцитов основных субпопуляций у самок могут быть связаны со стимулирующим влиянием эстрадиола на процессы пролиферации, дифференцировки, миграции и активации клеток иммунной системы (Fish E.N., 2008; Gilliver S.C., 2010). Таблица 1 Абсолютное количество лимфоцитов основных субпопуляций в периферической крови у новорожденных самцов и самок крыс Вистар (M±SE) Показатель Самцы Самки р 0,030±0,006 0,070±0,008 p=0,03 0,11±0,01 0,27±0,02 p=0,02 0,040±0,005 0,080±0,007 p=0,04 Активированные Т-клетки (тыс./мл) 1,70±0,15 8,53±0,77 p=0,01 Регуляторные Т-клетки (тыс./мл) 1,57±0,13 8,10±0,73 p=0,01 Т-хелперы (млн/мл) В-лимфоциты (млн/мл) CD4+CD8+ Т-клетки (млн/мл) 20 18 * 16 * 14 % 12 * 10 * * 8 Самцы Самки 6 4 2 0 Т-хелперы CD4(+)CD8(+) лимфоциты В-лимфоциты Т-лимфоциты активированные Т-лимфоциты регуляторные Рис. 4. Относительное количество лимфоцитов основных субпопуляций в периферической крови у новорожденных самцов и самок крыс Вистар (M±SE). * – различия между группами статистически значимы 12 Таким образом, показано, что иммунная система новорожденных самок характеризуется морфологическими и функциональными признаками более высокой активности по сравнению с самцами: более выраженным корковым слоем тимуса, увеличением продукции ИЛ-2, ИНФ-γ и ФНО-α клетками селезенки, повышением абсолютного и относительного количества Т-хелперов, незрелых (CD4+CD8+), активированных и регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови. Сравнительная характеристика морфофункционального состояния иммунной системы у десятидневных самцов и самок крыс Вистар По сравнению с новорожденными крысами у десятидневных животных наблюдалось снижение уровня эстрадиола в сыворотке крови (в 2 раза); содержание прогестерона и тестостерона у новорожденных и десятидневных крыс обоего пола статистически значимо не различалось. По сравнению с самцами у десятидневных самок концентрация эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови была в 1,5 раза выше (рис. 5), что обусловлено появлением растущих фолликулов в яичниках и началом синтеза половых стероидов клетками фолликулярного эпителия в этот период постнатального развития. По уровню тестостерона и кортикостерона статистически значимых половых различий выявлено не было. Прогестерон 25 * * 20 нг/мл пг/мл Эстрадиол 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 15 10 5 0 Самцы Самцы Самки Самки Рис. 5. Содержание эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови у десятидневных самцов и самок крыс Вистар (Med; 25%-75%). * – различия между группами статистически значимы По данным морфологического исследования в тимусе у десятидневных самцов и самок преобладало корковое вещество, которое было представлено плотно расположенными лимфоцитами и эпителиальными ретикулярными клетками. Субкапсулярная зона тимуса у самцов и самок была образована 8-12 рядами лимфобластов, среди которых выявлялись единичные делящиеся клетки. Границы между корковым и мозговым веществом были четкими. В мозговом веществе тимуса обнаруживались единичные тельца Гассаля, состоящие из 3-5 эпителиальных ретикулярных клеток. 13 В селезенке у десятидневных самцов и самок белая пульпа была представлена хорошо выраженной ПАЛМ-зоной. При иммуногистохимическом окрашивании антителами к CD3 Т-лимфоциты ПАЛМ-зоны располагались вокруг центральных артерий в 5-6 рядов. Лимфоидные узелки в селезенке самцов и самок не выявлялись. При морфометрическом исследовании органов иммунной системы было выявлено, что у самок по сравнению с самцами выше индекс отношения объемной доли коркового вещества тимуса к мозговому (рис. 6), что указывает на более интенсивную пролиферацию лимфобластов в субкапсулярной зоне тимуса. По морфометрическим показателям структурно-функциональных зон селезенки между группами десятидневных самцов и самок не было выявлено статистически значимых половых различий. Данные литературы о половых различиях морфофункционального состояния тимуса и селезенки у животных и человека в препубертатном периоде немногочисленны. Г.В. Ковалевский (1996) показал, что у самцов и самок крыс-альбиносов в возрасте 1-2 недель соотношение объемной доли коркового и мозгового вещества тимуса статистически значимо не различается. E. Yekeler и соавт. (2004) не выявили половых различий по показателям массы и размеров тимуса и селезенки у детей в препубертатном периоде развития. 8 * 7 усл. ед. 6 5 4 3 2 1 0 Самцы Самки Рис. 6. Индекс отношения объемной доли коркового вещества тимуса к мозговому у десятидневных самцов и самок крыс Вистар (M±SE). * – различия между группами статистически значимы При исследовании цитокинового профиля и иммунофенотипическом анализе основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови не было выявлено статистически значимых различий между группами десятидневных самцов и самок по всем изучаемым показателям, что может быть обусловлено низким содержанием половых гормонов в сыворотке крови у животных в этот период постнатального развития. Таким образом, у десятидневных крыс Вистар на фоне низкого уровня половых гормонов в сыворотке крови выявлены половые различия только по показателю объемной доли коркового вещества тимуса, который выше у самок, чем у самцов. По показателям уровня продукции цитокинов клетками 14 селезенки, а также абсолютного и относительного числа Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических, активированных и регуляторных Т-лимфоцитов периферической крови половых различий у крыс Вистар в этот период постнатального развития не обнаружено. Сравнительная характеристика морфофункционального состояния иммунной системы у половозрелых самцов и самок крыс Вистар При исследовании уровня стероидных гормонов было показано, что у половозрелых самок в фазе проэструса по сравнению с самцами выше уровень эстрадиола и прогестерона и ниже уровень тестостерона в сыворотке крови, что согласуется с данными литературы (Розен В.Б., 1994; Берштейн Л.М., 1998; Гриффин Дж., Охеда С., 2008). Кроме того, нами было выявлено, что у самок выше уровень кортикостерона в сыворотке крови (рис. 7). Эти результаты согласуются с данными H.C. Atkinson и B.J. Waddell (1997), которые показали, что у самок крыс-альбиносов по сравнению с самцами наблюдается более высокий уровень кортикостерона, что обусловлено активацией его синтеза на фоне повышенной продукции эстрогенов. По данным A.S. Tait и соавт. (2008) глюкокортикоиды оказывают супрессивное, а эстрогены – стимулирующее влияние на функционирование иммунной системы. Высокий уровень кортикостерона у самок способствует формированию толерантности к собственным антигенам и подавлению иммунного ответа, опосредованного аутореактивными Т-клетками (Miyaura H., Iwata M., 2002). 70 * 60 нг/мл 50 40 30 20 10 0 Самцы Самки Рис. 7. Содержание кортикостерона в сыворотке крови у половозрелых самцов и самок крыс Вистар (Med; 25%-75%). * – различия между группами статистически значимы По данным морфологического исследования в тимусе у половозрелых самцов и самок соотношение коркового и мозгового вещества составляло 1:1. Корковое вещество было представлено плотно расположенными лимфоцитами и эпителиальными ретикулярными клетками. Субкапсулярная зона тимуса у самцов и самок была образована 4-8 рядами лимфобластов, среди которых выявлялись единичные делящиеся клетки. Границы между корковым и 15 мозговым веществом были четкими. В мозговом веществе обнаруживались многочисленные тельца Гассаля из 3-5 эпителиальных ретикулярных клеток, а также единичные тимические тельца с накоплением кератогиалина. В селезенке у половозрелых самцов и самок преобладала белая пульпа, представленная хорошо выраженной ПАЛМ-зоной и лимфоидными узелками с небольшими герминативными центрами, в которых выявлялись лимфобласты и ретикулярные клетки. При иммуногистохимическом окрашивании антителами к CD3 Т-лимфоциты ПАЛМ-зоны располагались вокруг центральных артерий в 15-20 рядов; отдельные диффузно распределенные Т-клетки выявлялись в лимфоидных узелках селезенки. При морфометрическом исследовании органов иммунной системы было показано, что у самок по сравнению с самцами ниже индекс отношения объемной доли коркового вещества тимуса к мозговому и выше показатель ширины субкапсулярной зоны тимуса (рис. 8). По морфометрическим показателям структурно-функциональных зон селезенки статистически значимых различий между группами половозрелых самцов и самок выявлено не было. Снижение объемной доли коркового вещества тимуса у самок в фазе проэструса может быть обусловлено усилением миграции Т-лимфоцитов из тимуса под влиянием эстрогенов. По данным J. Gui и соавт. (2012) эстрогены ускоряют дифференцировку и созревание тимоцитов, а также повышают проницаемость кровеносных сосудов тимуса. Расширение субкапсулярной зоны тимуса у самок по сравнению с самцами может быть связано с повышенным уровнем прогестерона в сыворотке крови. Этот стероидный гормон обладает способностью к высокоаффинному связыванию с глюкокортикоидными рецепторами, которые экспрессируются популяцией кортизон-чувствительных Т-лимфоцитов субкапсулярной зоны тимуса (Bamberger C.M. et al., 1999). R.W. McMurray и соавт. (2000) показали, что прогестерон in vitro подавляет апоптотическую гибель тимоцитов, индуцируемую глюкокортикоидными гормонами. Таким образом, расширение субкапсулярной зоны тимуса у самок по сравнению с самцами может быть обусловлено антиапоптотическим эффектом прогестерона. В исследованиях in vitro показано, что эстрогены, прогестины и андрогены снижают интенсивность пролиферации лимфоцитов селезенки (Bouman A. et al., 2005; Fish E.N., 2008; De Leόn-Nava M.A. et al., 2009). Такое однонаправленное влияние половых гормонов может обусловливать отсутствие половых различий по показателям объемной плотности функциональных зон селезенки у половозрелых крыс Вистар. При анализе цитокинового профиля половозрелых крыс Вистар было обнаружено, что по сравнению с самцами у самок в 2 раза выше уровень продукции клетками селезенки провоспалительного цитокина ФНО-α (рис. 9). Работы, посвященные изучению половых различий цитокинового профиля у лиц репродуктивного возраста и половозрелых животных, немногочисленны. A. Bouman и соавт. (2004) не выявили половых различий по уровню продукции провоспалительных цитокинов лимфоцитами периферической крови у мужчин 16 и женщин. В исследовании H. Ramseier и соавт. (1993) было показано, что у самок крыс Long Evans по сравнению с самцами выше уровень продукции ИЛ-2 лимфоцитами селезенки. M.A. De Leόn-Nava и соавт. (2009) выявили, что у самок мышей линии Balb/c по сравнению с самцами выше уровень продукции клетками селезенки ИНФ-γ и ниже уровень продукции ИЛ-4. Выявленные нами половые различия по показателю уровня продукции ФНО-α указывают на активацию провоспалительных реакций у самок, что может быть обусловлено иммуностимулирующим влиянием эстрогенов. Ширина субкапсулярной зоны Индекс отношения объемной доли коркового вещества к мозговому 40 1,4 1,2 30 * 25 мкм 1 усл. ед. * 35 0,8 20 0,6 15 0,4 10 0,2 5 0 0 Самцы Самки Самцы Самки Рис. 8. Морфометрические показатели тимуса у половозрелых самцов и самок крыс Вистар (M±SE). * – различия между группами статистически значимы 700 * 600 пг/мл 500 400 300 200 100 0 Самцы Самки Рис. 9. Уровень продукции ФНО-α клетками селезенки у половозрелых самцов и самок крыс Вистар (Med; 25%-75%). * – различия между группами статистически значимы При иммунофенотипическом анализе субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у половозрелых крыс Вистар было показано, что у самок по сравнению с самцами выше показатели абсолютного и относительного количества Т-хелперов и активированных Т-лимфоцитов в периферической крови, а также выше индекс стимуляции гранулоцитов, отражающий фагоцитарную активность этих клеток (табл. 2, рис. 10-11). По данным S.S. Uppal и соавт. (2003) у женщин относительное и абсолютное число Т-хелперов в периферической крови выше, чем у мужчин. В исследовании на приматах выявлено, что у самок процентное содержание Т-хелперов выше по 17 сравнению с самцами (Qiu C.L. et al., 2008). Более высокие показатели относительного и абсолютного количества Т-хелперов в периферической крови у особей женского пола могут быть связаны со стимулирующим влиянием эстрадиола на процессы дифференцировки и миграции иммунокомпетентных клеток. Данные о половых различиях абсолютного и относительного количества активированных Т-лимфоцитов у крыс в литературе не представлены. В исследовании на мышах P. Tai и соавт. (2008) показали, что введение эстрогенов приводит к увеличению относительного и абсолютного числа активированных Т-лимфоцитов в селезенке, лимфатических узлах и крови. В исследованиях in vitro выявлено, что андрогены уменьшают продукцию нейтрофилами активных форм кислорода, снижая фагоцитарную активность этих клеток (Molloy E.J. et al., 2003; Aldebert D. et al., 2011), поэтому высокие концентрации андрогенов могут обусловливать снижение индекса стимуляции гранулоцитов периферической крови у половозрелых самцов по сравнению с самками. Таблица 2 Абсолютное количество Т-хелперов и активированных Т-лимфоцитов в периферической крови у половозрелых самцов и самок крыс Вистар (M±SE) Показатель Т-хелперы (млн/мл) Активированные Т-клетки (тыс./мл) 35 Самцы Самки р 1,13±0,12 1,58±0,11 p=0,03 63,06±10,64 119,53±10,12 p=0,01 * 30 25 20 % Самцы Самки 15 * 10 5 0 Т-хелперы Т-лимфоциты активированные Рис. 10. Относительное количество Т-хелперов и активированных Т-лимфоцитов в периферической крови у половозрелых самцов и самок крыс Вистар (M±SE). * – различия между группами статистически значимы 18 7 * 6 усл. ед. 5 4 3 2 1 0 Самцы Самки Рис. 11. Индекс стимуляции гранулоцитов периферической крови у половозрелых самцов и самок крыс Вистар (M±SE). * – различия между группами статистически значимы Таким образом, показано, что иммунная система половозрелых самок в фазе проэструса характеризуется морфологическими и функциональными признаками более высокой активности по сравнению с самцами: расширением субкапсулярной зоны тимуса, увеличением уровня продукции ФНО-α клетками селезенки, повышением абсолютного и относительного количества Т-хелперов и активированных Т-лимфоцитов в периферической крови и увеличением фагоцитарной активности гранулоцитов. Возрастные изменения морфофункционального состояния иммунной системы у самцов и самок крыс Вистар Нами были изучены возрастные изменения морфофункционального состояния органов иммунной системы, уровня продукции цитокинов клетками селезенки и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у самцов и самок крыс Вистар. При морфологическом и морфометрическом исследовании тимуса было показано, что у самцов и самок крыс Вистар с возрастом снижается объемная доля коркового вещества, уменьшается ширина субкапсулярной зоны и увеличивается количество тимических телец в мозговом веществе. D. Quaglino и соавт. (1998) при изучении возрастных гистофизиологических особенностей тимуса у самцов крыс Sprague-Dawley обнаружили, что в течение первых двух недель после рождения происходят фенотипические изменения тимоцитов. В этот период в тимусе наблюдается повышение количества CD4+CD8+ Т-лимфоцитов и увеличение митотической активности лимфобластов. Во время полового созревания в тимусе самцов и самок отмечается сужение коркового слоя тимуса, что обусловлено снижением пролиферации предшественников Т-лимфоцитов, причем у самок этот процесс выражен сильнее по сравнению с самцами (Gui J. et al., 2012). Количество лимфобластов в субкапсулярной зоне тимуса уменьшается с возрастом, хотя поступление в тимус предшественников Т-лимфоцитов с дальнейшей их 19 дифференцировкой сохраняется в течение всей жизни (Ивановская Т.Е. и др., 1996). Возрастные изменения селезенки у самцов и самок крыс Вистар характеризуются увеличением объемной доли ПАЛМ-зоны и формированием лимфоидных узелков. По данным A. Veerman (1975) в селезенке крыс на 14-е сутки после рождения четко определяется зона периартериальных лимфоидных муфт, представленная Т-лимфоцитами, а на 20-е выявляются первичные лимфоидные узелки, содержащие в основном В-лимфоциты. При исследовании цитокинового профиля было показано, что у самцов и самок крыс Вистар с возрастом наблюдается повышение уровня продукции клетками селезенки Тх1-цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-γ, Тх2-цитокина ИЛ-4 и провоспалительного цитокина ФНО-α. Уровень продукции провоспалительного цитокина ИЛ-6 у десятидневных самцов и самок был выше по сравнению с новорожденными крысами, тогда как у половозрелых животных наблюдалось снижение этого показателя. Работы, посвященные исследованию возрастных изменений цитокинового профиля у животных и человека, немногочисленны. Показано, что у мужчин и женщин репродуктивного возраста по сравнению с детьми выше уровень продукции ИЛ-2, ИЛ-4, ИНФ-γ и ФНО-α Т-лимфоцитами периферической крови (Hoffmann F. et al., 2005; Wiegering V. et al., 2009). По данным J. de Groot и соавт. (2005) у самцов и самок свиней возрастные изменения цитокинового профиля связаны с увеличением уровня продукции лимфоцитами Тх1-цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-γ, а также Тх2-цитокина ИЛ-4. Провоспалительный цитокин ИЛ-6 оказывает стимулирующее влияние на процессы пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов, связанные с созреванием Т-клеточного звена иммунитета (Ярилин А.А., 2010), что может обусловливать повышение уровня продукции этого цитокина у десятидневных крыс по сравнению с новорожденными и половозрелыми животными. Кроме того, в этом периоде постнатального развития наблюдается становление кишечной микробиоты, которая стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов клетками селезенки (Nicaise P. et al., 1999). При анализе субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови нами было выявлено, что у самцов и самок крыс Вистар с возрастом увеличивается абсолютное число лимфоцитов всех исследуемых субпопуляций. Возрастные изменения относительного количества лимфоцитов основных субпопуляций связаны с повышением числа Т- и В-лимфоцитов и снижением числа Т-хелперов и регуляторных Т-лимфоцитов. Относительное количество активированных Т-лимфоцитов периферической крови у самцов и самок с возрастом статистически значимо не изменяется. В исследовании на человеке U. Sack и соавт. (2007) показали, что в периферической крови у мальчиков и девочек в возрасте до 2-х лет наблюдается высокое абсолютное количество Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, однако такое численное превосходство сопровождается функциональной незрелостью иммунокомпетентных клеток. С возрастом абсолютное количество лимфоцитов основных субпопуляций снижается параллельно с повышением их функциональной активности 20 (Чередеев А.Н. и др., 1999; Wiegering V. et al., 2009). Нами было показано, что у самцов и самок крыс Вистар абсолютное количество лимфоцитов всех исследуемых субпопуляций повышается с возрастом, что может быть обусловлено видовыми особенностями созревания иммунной системы. По сравнению с детьми у мужчин и женщин репродуктивного возраста ниже относительное количество Т-хелперов и регуляторных Т-лимфоцитов (M’Rabet L. et al., 2008; Clinton C., 2010) и выше количество Т-лимфоцитов (Ikincioğullari A. et al., 2004), что согласуется с данными, полученными нами на крысах Вистар. По данным G. Chirico (2005) относительное количество активированных Т-лимфоцитов в периферической крови у новорожденных мальчиков и девочек ниже, чем у детей старшего возраста и взрослых. Нами было обнаружено, что относительное число активированных Т-лимфоцитов у самцов и самок крыс Вистар с возрастом практически не изменяется. Выводы 1. По данным морфологического и морфометрического исследования органов иммунной системы, определения уровня продукции цитокинов клетками селезенки и анализа субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови половые различия морфофункционального состояния иммунной системы у крыс Вистар наиболее выражены в неонатальном периоде и в периоде половой зрелости; в препубертатном периоде половые различия минимальны. 2. В тимусе у новорожденных (1-2 сут постнатального развития) самцов и самок крыс Вистар преобладает корковый слой, равномерно заселенный лимфобластами; субкапсулярная зона не выявляется. По сравнению с самцами у новорожденных самок выше показатель объемной доли коркового вещества тимуса. В селезенке новорожденных крыс Вистар обоего пола отсутствуют лимфоидные узелки; показатели объемной доли ПАЛМ-зоны, выявляемой при иммуногистохимическом исследовании с антителами к CD3, у самцов и самок статистически значимо не различаются. 3. По сравнению с самцами иммунная система новорожденных самок крыс Вистар характеризуется признаками более высокой функциональной активности: увеличением уровня продукции клетками селезенки Тх1-цитокинов ИЛ-2 (в 30 раз) и ИНФ-γ (в 50 раз) и провоспалительного цитокина ФНО-α (в 15 раз), а также повышением абсолютного и относительного количества Т-хелперов, незрелых (CD4+CD8+), активированных и регуляторных Т-клеток в периферической крови. Выявленные особенности функционального состояния иммунной системы у самок обусловлены, очевидно, более высоким уровнем эстрадиола в сыворотке крови по сравнению с самцами. 4. В препубертатном периоде развития (10 сут после рождения) у крыс Вистар на фоне низкого содержания стероидных гормонов в сыворотке крови выявлены половые различия по показателю объемной доли коркового вещества тимуса, который был выше у самок. По показателям абсолютного и относительного количества лимфоцитов основных субпопуляций и уровня 21 продукции цитокинов клетками селезенки статистически значимых половых различий не обнаружено. 5. В периоде половой зрелости иммунная система самок крыс Вистар в фазе проэструса по сравнению с самцами характеризуется морфологическими и функциональными признаками более высокой активности: расширением субкапсулярной зоны тимуса, увеличением уровня продукции ФНО-α клетками селезенки, повышением абсолютного и относительного количества Т-хелперов и активированных Т-лимфоцитов в периферической крови и увеличением показателя фагоцитарной активности гранулоцитов. 6. Возрастные изменения морфофункционального состояния иммунной системы у самцов и самок крыс Вистар сходны и характеризуются: – снижением объемной доли коркового вещества и уменьшением ширины субкапсулярной зоны тимуса; – формированием лимфоидных узелков и увеличением объемной доли ПАЛМ-зоны селезенки; – повышением уровня продукции клетками селезенки Тх1-цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-γ, Тх2-цитокина ИЛ-4 и провоспалительного цитокина ФНО-α; – увеличением абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических, активированных и регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови; – повышением относительного числа Т- и В-лимфоцитов и снижением процентного содержания Т-хелперов и регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови; – увеличением фагоцитарной активности гранулоцитов периферической крови. 7. Уровень продукции клетками селезенки провоспалительного цитокина ИЛ-6, оказывающего стимулирующее влияние на процессы пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов, у самцов и самок крыс Вистар в препубертатном периоде развития выше, чем у новорожденных и половозрелых животных. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Косырева А.М., Симонова Е.Ю., Макарова О.В. Морфофункциональная характеристика иммунной системы самцов и самок крыс Вистар. // Иммунология. – 2011. – №2. – С. 81-84. 2. Симонова Е.Ю. Сравнительная характеристика морфофункционального состояния органов иммунной системы и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови самцов и самок крыс Вистар. // Морфологические ведомости. – 2012. – №1. – С. 60-66. 3. Симонова Е.Ю., Косырева А.М. Половые различия субпопуляционного состава лимфоцитов и фагоцитарной активности гранулоцитов периферической крови у крыс Вистар. // Иммунология. – 2012. – №3. – С. 120-123. 22 4. Косырева А.М., Симонова Е.Ю., Макарова О.В. Морфофункциональные изменения органов иммунной системы самок крыс Вистар в разные фазы эстрального цикла и при кастрации. // Морфология. – 2010. – №4. – С. 101. 5. Косырева А.М., Хомякова Т.И., Макарова О.В., Козловский Ю.Е., Чертович Н.Ф., Симонова Е.Ю. Половые гистофизиологические различия иммунной системы, микробиома и уровня эндотоксина крыс Вистар. // Научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». – М.: МДВ, 2010. – С. 106-108. 6. Симонова Е.Ю. Сравнительная характеристика морфофункционального состояния иммунной системы самцов и самок крыс Вистар. // Бюллетень Северного государственного медицинского университета. – 2011. – №1. – С. 208-209. 7. Симонова Е.Ю., Косырева А.М., Пономаренко Е.А. Половые различия морфофункционального состояния органов иммунной системы и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у крыс Вистар. // Сборник научных трудов научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». – М., 2012. – С. 133-136. 8. Симонова Е.Ю. Половые различия уровня стероидных гормонов и морфофункционального состояния иммунной системы у новорожденных крыс Вистар. // ХХ Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». – М.: МАКС Пресс, 2013. – С. 155. 9. Симонова Е.Ю. Сравнительная морфофункциональная характеристика иммунной системы у новорожденных самцов и самок крыс Вистар. // Бюллетень Северного государственного медицинского университета. – 2013. – №1. – С. 122-123. Соискатель Е.Ю. Симонова 23
