Приложение 1 Научно-техническое обоснование космического эксперимента «РЕГЕНЕРАЦИЯ-1» 1. Сущность исследуемой проблемы. Краткая история и состояние вопроса. Выяснение значимости силы тяжести в различных жизненных процессах у земных организмов – парадигма космической биологии. Одной из таких задач является изучение восстановления органов и тканей после их повреждения либо полной утраты в условиях воздействия факторов космического полета. Очевидно, данная проблема имеет непосредственное отношение и к космоплаванию. Увеличение продолжительности пилотируемых полетов и объема работ, усложнение операторских задач, несомненно, повышают риск несчастного случая и получения различного рода травм, требующих хирургического вмешательства. По этой причине информация по регенерации поврежденных органов и тканей в космическом полете, добытая в модельных опытах на животных, окажется полезной в системе мер по медицинскому обеспечению полетов. Имеющиеся на сегодня экспериментальные данные о влиянии невесомости на восстановительный морфогенез немногочисленны и противоречивы. Согласно [2, 3, 10] экспозиция в невесомости сопровождалась ускорением регенерации ампутированных конечностей, хвоста, сетчатки и хрусталика глаз у тритонов Pleurodeles waltlii. По данным [1], напротив, регенерация удаленных конечностей у тритонов заметно отставало от наземного контроля (регенерировавшие кости имели атипичную пластинчатую структуру). Следует особо подчеркнуть, что в этих экспериментах, поставленных на автоматических космических аппаратах «Бион» и «Фотон», продолжительность орбитальных полетов не превышала 16 суток. О характере регенерации судили по прошествии достаточно длительного времени после возвращения животных на Землю. Можно упомянуть еще об одном эксперименте. У двух крыс линии Вистар 14-суточное пребывание в невесомости привело к задержке посттравматической регенерации в виде уменьшения размеров костной мозоли и снижения прочности консолидации костных обломков диафиза малоберцовой кости, подвернутой оперативному перелому за 2 суток до запуска биоспутника по сравнению с животными наземной контрольной группы [8]. Ранее нами на МКС были проведены исследования по изучению регенерации органа зрения (глазных щупалец) на наземной легочной улитке Helix lucorum и целого организма из отдельных фрагментов тела на пресноводной планарии Girardia tigrina. (Планария Girardia tigrina – бесполая раса: при достижении животными определенных размеров задняя часть тела постепенно отшнуровывается и затем полностью отрывается от ее передней части. В течение нескольких суток из передней и задней частей тела регенерируют две планарии. Планарию размером всего 1012 мм можно расчленить на множество фрагментов и всего за одну неделю появляется такое же 2 число особей благодаря наличию в них популяций стволовых клеток [11, 13, 18-20]. Согласно литературным данным у наземных гастропод после удаления глазных пузырьков в течение 2-3 мес имеет место структурно-функциональное восстановление вышеуказанной структуры. Правда, регенерировавший глаз заметно уступает интактному глазу по своим размерам и содержит меньшее число клеток в сетчатке [9, 12, 14-17]). Результаты исследований показали сохранность высокой регенерационной способности в орбитальном полете: из отдельных фрагментов планарий регенерировали полноценные особи. У улиток в 20-70 % случаях взамен ампутированных глазных щупалец образовались новые глазные щупальца с функционирующими глазами [4-6; см. также итоговый отчет по КЭ «Регенерация». Регистр. № 0-3244. ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Москва, 2010]. Основной вывод из этой работы состоял в том, что отсутствие силы тяжести не является лимитирующим фактором для реализации механизмов регенерации. В ряде случаев регенерировавшие щупальца полетных улиток были искривлены, имели характерные выросты, как правило, отсутствующие у животных наземного контроля. У одной улитки обнаружились два глаза в регенерировавшем щупальце. У планарий, перед полетом подвергнутых продольному рассечению тела, прирастала недостающая половина. Вместе с тем их тело было явно искривлено по сравнению с контрольными объектами (рис. 1-3). Рис. 1. Регенерация глазных щупалец в 163-суточном КЭ. а – интактное глазное щупальце, б – регенерировавшее глазное щупальце без глазного яблока, в-м – регенерировавшие глазные щупальца с глазными яблоками, з – правое интактное, левое регенерировавшее глазное щупальце, н – улитка с глазными щупальцами спустя 776 суток после отсечения верхней части левого глазного щупальца. Стрелки – граница отсечения глазных щупалец и отрастания регенератов. 3 Рис. 2. Планария G. tigrina в интактном состоянии, ее головной, туловищный и хвостовой участки непосредственно после оперативного вмешательства за 12 ч перед стартом ПКК «Союз» и их регенерация орбитальном в 10-суточном полете (последовательность на МКС фотографий слева направо). 1 2 3 4 Рис. 5 Рис. 3. Регенерация планарии после продольного рассечения тела. 1 – планария в интактном состоянии, 2 и 3 – рассеченные половины планарии за 14 ч перед стартом ПКК «Союз», 4 – регенерировавшая планария из правой половины. Снимок спустя 8 ч после завершения 11суточного орбитального полета. Возникновение аномалий в регенерировавших образованиях в орбитальном полете диктует необходимость постановки нового КЭ («РЕГЕНЕРАЦИЯ-1») для углубленного изучения и выяснения возможных причин этого феномена (невесомость, повышенная весомость, радиация, вибрации). Методы исследования. Выполнение КЭ «Регенерация-1» предусматривает проведение комплексных исследований: морфологических, с использованием световой и электронной микроскопии – для выявления морфологических особенностей регенерировавших структур и электрофизиологических – для оценки их функционального состояния. Предполетная подготовка КЭ. Предварительно отобранные улитки, прошедшие карантинный срок, разделяются на полетную и две контрольные группы – синхронную и 4 виварийную. За 7-10 суток перед началом КЭ прекращается кормление животных полетной и синхронной контрольной групп. За 4-5 суток перед стартом животные полетной группы доставлятся на техническую позицию г. Байконур. За 12-14 ч перед стартом улиток взвешиваются на электронных весах «Accula3 V-1 mg», измеряется диаметр раковины штангенциркулем и полученные значения заносятся в протокольную тетрадь. Глазными ножницами ампутирутся дистальные кончики глазных щупалец вместе с глазными пузырьками с одной стороны, в ряде случаев одно или оба щупальца у основания. У планарий туловище рассекается на две продольные половины. После указанных процедур улитки укладываются в инкубационный контейнер «Улитка», фрагменты планарий (от 8 до 15) – в инкубационные капсулы, заполненные на 1/3 дистиллированной водой и на 2/3 артезианской водой «Малютка». Контейнеры закрываются крышкой и помещаются в транспортировочные чехлы (рис. 1, 2). За 12-14 ч перед стартом контейнеры с биообъектами после обработки 3-процентным раствором перекиси водорода размещаются в гермоотсек ТГК «Прогресс М», либо на борт ТПК «Союз ТМА». Прооперированные улитки и фрагменты планарий синхронных контрольных групп находятся в аналогичных «полетным» контейнерах и при температуре, близкой к бортовой. Кроме того, они подвергаются ударным воздействиям и динамическим нагрузкам, имитирующим факторы выведения космических аппаратов на орбиту и возвращения на Землю. Улитки виварийной контрольной группы содержатся при комнатной температуре (20-22ºС) и имеют свободный доступ к корму и воде. В интактном состоянии и после соответствующего оперативного вмешательства производится фото- и видеосъемка планарий и глазных щупалец улиток. Их изображения перед полетом, а также полученного материала после полета создаются с помощью специальной установки, состоящей из микроскопа МБС-9, оборудованного видеокамерой CCD Color Camera CV-7017H (Sony, Japan), устройства для видеозахвата AverTV Cardbus Plus (AverMedia, Taivan) и ноутбука Aspire 1662WLMi Acer (Taivan). После заверения КЭ для регистрации электроретинограммы (ЭРГ) и импульсной электрической активности зрительного нерва улиток используется полуинтактный препарат: улитки извлекаются из раковины, туловище разрезается по средней линии, глазные щупальца вскрываются и обнажается зрительный нерв. Для отведения ЭРГ к поверхности обнаженных глаз прикладываются стеклянные микроэлектроды диаметром кончика 70-80 мкм. Электроды заполняются агар-агаром, приготовленном на 1-молярном растворе NaCI. Для отведения импульсной электрической активности зрительного нерва используются металлические электроды толщиной 80 мкм. Индифферентный электрод в виде серебряной пластинки располагается на туловище улитки. Для предотвращения высыхания глаза постоянно орошаются физиологическим раствором со скоростью 10 мл/ч. Перед каждым глазом на расстоянии 1 см располагаются светодиоды белого свечения HB5-439AWD (диаметр светодиода 5 мм, угол свечения 22 град., сила света 7 Кд), соединенные с электрическим 5 стимулятором MSE-3R (Nihon Kohden). Применяются одиночные и парные световые стимулы различной яркости и продолжительности. Запись ЭРГ через усилитель постоянного тока (ЭРГ) и переменного тока (импульсной электрической активности зрительного нерва) производится на 4канальный чернильный самописец. Для проведения морфологических исследований регенераты фиксируются в жидкости Карнуа и в глутаральдегиде и после соответствующих процедур заключаются соответственно в парафин и смолу для световой и электронной микроскопии. Вышеуказанные процедуры проводятся на улитках в день их возвращения на Землю. Аналогичные полетным исследования проводили на животных контрольных групп, а также на центрифуге и в клиностате. Состояние повышенной силы тяжести величиной до 5 ед и продолжительностью до 1 мес создается на центрифуге БМЦ-ЭМИБ (СССР). Контейнеры с биообъектами размещаются в металлических стаканах центрифуги внутренним диаметром 65 мм и высотой 90 мм и в стакане, расположенном на оси центрифуги. Контейнеры с биообъектами закрепляются на горизонтальную ось клиностата и подвергаются непрерывному вращению продолжительностью до 1 мес со скоростью один оборот в течение 15-20 минут. Необходимые средства для проведения КЭ: 1. РС МКС, позволяющий в полной мере решить научные задачи КЭ «РЕГЕНЕРАЦИЯ-1». 2. Наземный лабораторный комплекс (инкубационные контейнеры, электрофизиологическая установка, оптический микроскоп, трансмиссионный и сканирующий электронные микроскопы, центрифуга, клиностат, радиация, вибростенд). 2. Необходимость проведения КЭ в условиях космического пространства в составе РС МКС В соответствии с целью и задачами КЭ может быть выполнен только в условиях космического пространства в составе РС МКС, при активном участии экипажа в его реализации. Участие экипажа в КЭ необходимо для выбора оптимального места размещения контейнеров с биообъектами РС МКС, для регулярного отслеживания температуры в зоне расположения контейнеров с биообъектами и передачи информации на Землю. 3. Описание КЭ 3.1 Порядок проведения КЭ Российский экипаж переносит аппаратуру «Статокония» и «Регенерация» на РС МКС, размещает её в служебном модуле на панели № 406, фотографирует и докладывает на Землю о выполнении работ. В течение всего полета происходит регистрация значений температуры температурным датчиком и радиационного фона дозиметрическим датчиком, расположенными в близости от аппаратуры. После окончания эксперимента аппаратура «Статокония» и 6 «Регенерация» демонтируется с места экспонирования и переносится в спускаемый аппарат для возвращения на Землю. 3.2 Принципиальные требования к условиям выполнения КЭ. Точное выполнение циклограммы. Отслеживание температуры в указанные в циклограмме сроки и передача информации на Землю. 3.3 Технические особенности НА. Техническими особенностями НА являются: контейнер «Улитка» с сепараторнофильтрационным устройством и контейнер «Планария» с тройным уровнем защиты. 4. Новизна, оценка качественного уровня по сравнению аналогичными отечественными и зарубежными исследованиями Новизна КЭ состоит в установлении возможных причин возникновения аномальных форм регенератов в орбитальном полете на РС МКС с использованием адекватных задачам методов исследований. Аналогичные отечественные и зарубежные исследования отсутствуют. 5. Ожидаемые результаты и их предполагаемое использование 5.1 Основные результаты КЭ. 5.1.1 Сведения о регенерации поврежденных частей тела у животных организмов в условиях орбитального полета. 5.1.2 Результаты КЭ позволят определить возможные причины появления аномалий восстановительного морфогенеза в процессе регенерации поврежденных частей тела у животных организмов в условиях орбитального полета. 5.2 Предполагаемые результаты. Экспериментальные данные, полученные при решении поставленных в КЭ задач, могут быть учтены при разработке стратегии медицинского обеспечения длительных космических полетов. 6. Обоснование технической возможности создания НА с заданными характеристиками Будут использованы уже имеющиеся разработки, эксплуатируемые на РС МКС при проведении КЭ «РЕГЕНЕРАЦИЯ» (инкубационные контейнеры «Улитка» и «Планария»). 7. Характеристики рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ Риск и дискомфорт при проведении КЭ отсутствуют. 7 Список цитируемой литературы 1. Бесова Н.В., Савельев С.В., Черников В.П. // Бюл. экспер. биол. 1993. Т. 116, № 7. С.90-92. 2. Григорян Э.Н., Антон Г. Дж., Миташов В.И. В сб. Материалы XII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине. 10-14 июня 2002. М. 2002. С. 123-124. 3. Григорян Э.Н., Ойгенблик Э.А., Тучкова С.Я, Мальчевская И.Е., Миташов В.И. В кн.: Результаты исследований на биоспутниках. М., Наука. 1992. С. 345-350. 4. Горгиладзе Г.И. Доклады академии наук. 2008, Т. 421 № 1, С. 131–134. 5. Горгиладзе Г.И., Короткова Е.В., Тихонравова Н.М., Новоженова Ю.В. Материалы XIII конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина». К 45-летию первого полета человека в космос. 13-16 июня 2006 г., Москва, Россия. Москва, 2006. С. 81-82. 6. Горгиладзе Г.И., Короткова Е.В., Тихонравова Н.М. Материалы 5-го Международного аэрокосмического конгресса. 27-31 августа 2006 г., Россия. Москва, 2006. С. 75-76. 7. Горгиладзе Г.И., Короткова Е.В., Кузнецова Е.Е., Мухамедиева Л.Н., Бегров В.В., Пепеляев Ю.В.. Авиакосмическая и экологическая медицина. 2010. Т. 44. № 3. С. 61-64. 8. Дурнова Г.Н., Бурковская Т.Е., Воротникова Е.В. // Космическая биол. 1991. Т. 25, №5. С. 29-33. 9. Тартаковская О.С. Влияние экологических факторов (плотность популяции, световой режим) и возраста на регенерацию периферического отдела зрительного аппарата брюхоногого моллюска Achatina fulica. Автореф. дисс. уч. ст. канд. биол. наук. Калининград, 2003. 10. Тучкова С.Я, Брушлинская Н.В., Григорян Э.Н., Миташов В.И. // Изв. РАН. Сер. биол. 1994. №6. С. 859-867. 11. Agata K. // Current Opinion in Genetics and Development. 2003. V. 13. № 5. P. 492-496. 12. Berg E., von, Schneider G.// Naturwissenschaften. 1967. 54 Jahrgang. H. 22. S. 591-592. 13. Brøndsted H.V. Planarian Regeneranion. Pergamon Press, New York, 1969, 276 p. 14. Eakin R.M. Ferlatte M. // J. Exp. Zool. 1973. V. 184. № 1. P.81-95. 15. Flores D.V., Pellegrino de Iraldi A. // Z. Zellforsch. 1973. V . 142. № 1. P. 63-68. 16. Flores D.V., Salas P.J.I., Saavedra J.P. // J. Neurobiology. 1983. V. 14. № 3. P. 167-176. 17. Gillary H.L. // Vision Res. 1970. V. 10. P. 977-991. 18. Sánchez Alvarado A. // Cell. 2006. V. 124. № 2. P. 241-245. 19. Sánchez Alvarado A. // Comptes Rendus Biologies. 2007. V. 330. № 6/7. P. 498-503. 20. Sánchez Alvarado A., H. Kang. // Exp. Cell Res. 2005. V. 306. № 2. P. 299-308. Научный руководитель и ответственный исполнитель Вед. научн. сотр. д.б.н. проф. Г.И. Горгиладзе