Повалко Наталия Борисовна - Медико
реклама
На правах рукописи Повалко Наталия Борисовна АТРОФИЯ ЗРИТЕЛЬНЫХ НЕРВОВ ЛЕБЕРА (АЗНЛ): МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И КЛИНИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ У РОССИЙСКИХ БОЛЬНЫХ 03.00.15 – Генетика 14.00.13. – Нервные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2006 Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук (директор – академик РАМН Гинтер Е.К.) Научные руководители: кандидат медицинских наук Захарова Екатерина Юрьевна доктор медицинских наук Руденская Галина Евгеньевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наукпрофессор Иллариошкин Сергей Николаевич кандидат биологических наук Петрова Ника Валентиновна Ведущая организация: ГУ высшего профессионального оразования Российский государственный медицинский университет Защита диссертации состоится « » 2006 года в часов на заседании диссертационного Совета Д.001.016.01 в ГУ Медико-генетический Научный Центр РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН. Автореферат разослан «____» _____________ 2006г. Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор 2 Курило Л.Ф. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования Атрофия зрительных нервов Лебера (АЗНЛ; в англоязычной литературе LHON: Leber hereditaty нейроофтальмологическое optic neuropathy), заболевание MIM 53500, митохондриальной — природы, проявляющееся быстрой, обычно необратимой, потерей зрения и поражающее преимущественно молодых мужчин. АЗНЛ распространена повсеместно и составляет значимую долю в структуре слепоты, особенно у лиц молодого возраста. Если такие митохондриальные болезни, как синдромы MELAS, MERRF, NARP, выделены сравнительно недавно, то АЗНЛ известна со второй половины XIX века (T. Leber, 1871). Уже в первых описаниях было отмечено наследование по материнской линии, в начале 1970-х годов предположена связь с мутациями митохондриальной ДНК (мтДНК), что подтвердилось в конце 1980-х годов: АЗНЛ стала первой нозологической формой, при которой была обнаружена патогенная точковая мутации мтДНК (Wallace et al., 1988). В последующем была установлена связь подавляющего большинства случаев заболевания с тремя первичными мутациями мтДНК (G11778A, G3460A, T14484C), появилась возможность ДНКдиагностики (Brown et al.,1992, Johns et al., 1993, Mackey and Howell 1992; Huoponen et al., 1992, Majander et al., 1991; Paulus et al.,1993). При АЗНЛ она является единственным надежным диагностическим методом, поскольку в отличие от ряда других митохондриальных болезней АЗНЛ не имеет патоморфологических и биохимических маркеров, а клиническая картина заболевания требует дифференциальной диагностики с рядом неврологических и офтальмологических болезней, особенно в несемейных случаях. Практическое значение молекулярно-генетических исследований АЗНЛ обусловлено ее достаточно высокой распространенностью (не менее 3—4 случаев на 100 тыс. 3 чел.), тяжестью (практически все больные — инвалиды I группы по зрению) и отсутствием эффективного лечения. Наряду с общими признаками, характерными для митохондриальной патологии (цитоплазматический тип наследования, связь с мутациями генов мтДНК, поражение органа зрения), АЗНЛ имеет ряд отличий: помимо отсутствия биохимических и патоморфологических маркеров, для АЗНЛ характерна выраженная неравномерность поражения полов и моносистемность поражения в большинстве случаев. Хотя причина большинства случаев АЗНЛ установлена, многие проблемы ее генетики и патогенеза требуют дальнейшего изучения: причины ограниченной пенетрантности первичных мутаций, особенно у женщин; зависимость различных характеристик болезни от вида первичной мутации; этиология случаев без известных первичных мутаций; феномен гетероплазмии; роль так называемых «вторичных» мутаций мтДНК; влияние внешних провоцирующих факторов и др. Эти проблемы усугубляют сложность медикогенетического консультирования. Их изучение важно не только с точки зрения самой болезни. АЗНЛ является информативной моделью в исследованиях митохондриальной патологии в целом, а также патофизиологических механизмов поражения глазного нерва, с этими исследованиями связывают разработку новых подходов к лечению. Таким образом, клинико-молекулярно-генетические исследования АЗНЛ имеют теоретическую важность и практическое значение. Российскими учеными в сотрудничестве с исследователями из США ведется молекулярно-генетическое изучение АЗНЛ в сибирских семьях (Володько и соавт., 2006; Zhadanov et al., 2006; Zhadanov et al., молекулярно-генетический 2005). и Комплексные исследования, клинико-генеалогический анализ российских семьях из разных регионов, раньше не проводились. 4 включающие АЗНЛ в Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является молекулярно-генетический и клиникогенеалогический анализ АЗНЛ у российских больных и отработка протокола диагностики этого заболевания. В соответствии с этой целью решали следующие задачи: 1.Определение спектра приводящих к АЗНЛ первичных мутаций мтДНК в выборке российских семей; 2.Определение частоты основных вторичных мутаций мтДНК в семьях с АЗНЛ; 3.Анализ генеалогических характеристик и факторов, влияющих на пенетрантность первичных мутаций; 4.Анализ основных клинических характеристик АЗНЛ, а также частоты и спектра сопутствующих внеглазных проявлений. Научная новизна результатов Впервые на репрезентативной многонациональной выборке российских семей установлено соотношение трех первичных мутаций мтДНК, приводящих к АЗНЛ, определены частота и спектр основных вторичных мутаций, доля случаев с гетероплазмией. Отмечена возможность развития болезни при небольшом содержании мутантной мтДНК (40% в клетках крови) при наличии внешнего провоцирующего фактора (прием нейротоксичного препарата). Определены частота и спектр сопутствующих неврологических симптомов при АЗНЛ. В семье с первичной мутацией T14484C обнаружена ранее не описанная мутация в гене АТФ-азы 6, возможно модифицирующая клиническую картину; впервые при данной мутации описано сочетание АЗНЛ с сахарным диабетом типа I. 5 Практическая значимость результатов Определен спектр клинических симптомов, особенности течения, возраст манифестации заболевания, которые могут помочь практикующим врачамгенетикам, невропатологам и офтальмологам заподозрить данное заболевание. Отработан протокол диагностики АЗНЛ на основании клинических и молекулярно-генетических данных, позволяющий проводить дифференциальную диагностику между АЗНЛ и другими заболеваниями, сопровождающимися поражением зрительных нервов. Внедрение в практику Результаты диссертационной работы используются в повседневной клинической и научной практике сотрудниками научно-консультационного отдела ГУ МГНЦ РАМН, НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росздрава, НИИ нейрохирургии РАМН, НИИ неврологии РАМН, Научного центра здоровья детей РАМН, Российской детской клинической больницы. Положения, выносимые на защиту 1. Относительные частоты встречаемости и спектр мутаций мтДНК у больных АЗНЛ из различных регионов России сходны с таковыми в выборке из различных популяций мира, существенно преобладает мутация G11778A, второй по частоте является мутация G3460А, наиболее редкой — мутация T14484C. 2. У российских больных АЗНЛ первичным мутациям сопутствуют вторичные мутации мтДНК T4216C, G13708A, G15257A и G15812A в разных сочетаниях. 3. Обнаружена новая мутация в гене АТФазы 6, которая в сочетании с первичной мутацией Т14484С, возможно, модифицирует клинический фенотип. 6 Выявлена возможность манифестации заболевания при небольшом содержании мутантной мтДНК в клетках крови. 4. Выявленная неполная пенетрантность первичных мутаций, преимущественно определяется полом. Зависимость пенетрантности от пола определяет значительное преобладание мужчин среди больных. Показаны достоверные различия в возрасте начала заболевания у мужчин и женщин. 5. Начальный период болезни типичен и сходен вне зависимости от пола, возраста больных и первичной мутации. В хронической стадии болезни у 14,6% обследованных больных отмечено частичное восстановление зрения (мутации Т14484С, G11778A, G3460A). Публикации По основным положениям диссертации опубликовано 11 научных работ (4 статьи и 7 тезисов). Апробация работы Результаты исследования были представлены на отечественных и международных конференциях: 1. Всероссийской научно-практической конференции "Современные достижения клинической генетики", Москва, 26-27 ноября 2003; 2. Научно-практической конференции «Вопросы офтальмогенетики», Москва, 16 ноября 2005; 3. IX Всероссийском съезде неврологов, Ярославль, 2006; 4. Конференции молодых ученых и аспирантов по молекулярной биологии и генетики. Киев, Украина, 25-27 Сентября 2003. (Conference for young scientist, PhD students on molecular biology and genetics. 2003, September 25-27, Kiev, Ukraine); 7 5. 6ом Европейском съезде по митохондриальной патологии. Наймеген, Нидерланды, 1-4 Июля, 2004. (6th European meeting on mitochondrial pathology 1 July-4 July 2004, Nijmegen, The Netherlands); 6. 7 ом съезде Европейского сообщества нейро-офтальмологов, Москва, Россия, 26-29 Июня, 2005 (7th Meeting of European Neuro-Ophthalmology Society, June 26-29 2005, Moscow, Russia); 7. XVIII Всемирном конгрессе по неврологии, 5-11 Ноября 2005, Сидней, Австралия. (XVIII World Congress of Neurology 5-11 November 2005, Sydney, Australia). Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложения. Диссертация содержит 16 таблиц и 9 рисунков. Библиографический указатель содержит 223 источника, из них 10 отечественных и 213 зарубежных. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований. Характеристика больных Выборка пробандов и семей с верифицированной АЗНЛ формировалась в 2001—2006 г.г. по мере обращения больных с подозрением на АЗНЛ и их молекулярно-генетического направлены из обследования. медицинских учреждений: Большинство НИИ глазных больных болезней были им. Гельмгольца Росздрава, НИИ нейрохирургии РАМН, НИИ неврологии РАМН, Научного центра здоровья детей РАМН, Российской детской клинической больницы и др. Одна семья обратилась самостоятельно по вопросу прогноза 8 потомства пробанда. В результате молекулярно-генетического обследования первичные мутации мтДНК обнаружены в 44 неродственных семьях у 51 больного и 16 здоровых родственников. Эта выборка семей, а также 8 больных, у которых не было обнаружено ни одной из первичных мутаций, является клиническим материалом работы. Большинство семей (n=33) обследовано в научно-консультативном отделе МГНЦ РАМН. Обследование включало в себя сбор семейных данных и клинического анамнеза, неврологический осмотр, а также анализ офтальмологических данных и результатов инструментальных исследований. В анализ молекулярно-генетических характеристик включены 44 семьи, в клинический анализ — 41, в генеалогический — 40. Подавляющее большинство семей (n=42) — российские, одна семья живет в Молдавии, одна — в Азербайджане. Российские семьи имеют широкую географию проживания: Москва и Московская обл. (n=16), другие центральные (n=4) и западные (n=2) области европейской части, южно-европейский регион, включая Северный Кавказ (n=4), Волго-Вятский регион и Поволжье (n=9), Урал (n=1), Западная (n=2) и Восточная (n=2) Сибирь, Дальний Восток (n=2). По этнической принадлежности семьи распределились следующим образом: 34 русских, 2 украинские, белорусская, немецкая, татарская, черкесская, чеченская, калмыцкая, армянская и азербайджанская (в смешанных семьях учтена этническая принадлежность матери). Среди 51 обследованных больных 42 мужчины и 9 женщин. Возраст больных на момент обследования — 9—68 лет. Молекулярно-генетические методы исследования Биологическим материалом исследования являлись образцы ДНК, выделенной из крови больных с подозрением на АЗНЛ и некоторых членов их семей. Выделение ДНК из цельной крови выполняли с помощью набора реагентов для выделения ДНК Diatom TM DNA Prep 220 (Россия) в соответствии с 9 протоколом производителя. Для всех образцов, используя стандартные методы ПЦР-анализа и последующего рестрикционного анализа, был проведен скрининг на три первичные мутации мтДНК G11778A, G3460A, T14484C. В образцах мтДНК больных АЗНЛ и 100 здоровых взрослых лиц обоего пола теми же методами проводился поиск четырех вторичных мутаций мтДНК T4216C, G13708A, G15257A и G15812A. Для выявления дополнительных генетических факторов, приведших к высокой пенетрантности заболевания в одной из семей с первичной мутацией Т14484С, было выполнено прямое нерадиоактивное секвенирование полного митохондриального генома с использованием 8канального автоматического секвенатора CEQ 8000 (Beckman Coulter, Inc.). Для 26 семей было проведено определение гаплогрупп мтДНК (Torroni A et al., 1997; Herrnstadt C et al., 2002). Результаты проведенных исследований Молекулярно-генетическая характеристика выборки обследованных больных Объем выборки, сформировавшейся за 5 лет (2001— I квартал 2006 г.г.) без активного «набора материала», ее неоднородный этнический состав и разнообразие мест проживания семей косвенно свидетельствуют о повсеместном и достаточно широком распространении АЗНЛ в России. В выборке 44 семей представлены все основные первичные мутации в неравном соотношении. Существенно преобладает мутация G11778А, обнаруженная в 34 семьях: 29 русских, украинской, татарской, чеченской, черкесской и азербайджанской. Мутация G3460А найдена в 7 семьях: 4 русских, украинской, немецкой и армянской, мутация T14484C — в 3 семьях: белорусской, калмыцкой и русской. Таким образом, соотношение первичных мутаций в группе российских семей 10 следующее: G11778А — 77,3 %, G3460А — 15,9%, T14484C — 6,8 % (рисунок 1). Такая структура согласуется с данными литературы: мутация G11778A существенно преобладает повсеместно, вклад мутаций G3460А и T14484С относительно невелик, но G3460А в среднем встречается несколько чаще. Доля мутации G11778A выше в Японии, Китае, Корее (по обобщенным данным, 87— 100%), чем в Западное Европе и Северной Америке (65—75%) (Brown et al, 1997; Feng et al, 2001; Huoponen, 2001; Matsumoto et al, 1999; Wallace et al, 1999; Yen et al, 2002). Наши цифры можно назвать пограничными между западными и восточноазиатскими. Рисунок 1. Частоты мутаций у российских больных АЗНЛ T14484C 6,8 % G3460A 15,9 % G11778A 77,3 % Во всех семьях помимо первичных мутаций методами секвенирования или ПЦР-ПДРФ-анализа проводили поиск вторичных мутаций мтДНК. У 59,1% семей при всех трех первичных мутациях были обнаружены наиболее часто встречающиеся «вторичные» мутации T4216C, G13708A, G15257A, G15812A в различных комбинациях. В выборке больных АЗНЛ структура вторичных мутаций следующая: T4216C—43,2 %, G13708A—43,2 %, G15257A—22,7%, G15812A—4,6%. В случае мутации G3460A среди 8 пациентов из 7 неродственных семей была обнаружена только одна вторичная мутация Т4216С у 2 неродственных больных. В группе больных с первичной мутацией G11778A в 23 семьях вторичные мутации обнаружены в различных сочетаниях, в 11 семьях выявлена только первичная мутация. Из трех семей, имеющих мутацию мтДНК 11 Т14484С, в одной семье, эта мутация обнаружена в сочетании со всеми 4 вторичными мутациями. В двух других семьях обнаружена только мутация Т14484С и ни одна из вторичных мутаций. В контрольной группе вторичные мутации имеют следующее распределение: T4216C—12,0%, G13708A—12,0%, G15257A—3%, G15812A— 1%. Структура вторичных мутаций в российской популяции отличается от средних мировых данных: мутации G13708A, G15257A и G15812A у россиян оказались более частыми (табл. 1). Таблица 1. Частота вторичных мутаций в группе больных АЗНЛ, в контрольной группе и усредненные европейские данные Т4216С(%) G13708A(%) G15257A(%) G15812A(%) Больные АЗНЛ (n=44) 43,2 43,2 22,7 4,6 Контрольная группа (n=100) 12,0 12,0 3,0 1,0 Собственные данные Усредненные европейские данные (данные литературы) Больные АЗНЛ 40 30 9 н.д. Контрольная группа 13 6 0,3 0,1 н.д.- нет данных Была проведена оценка статистической значимости различий по частоте встречаемости вторичных мутаций (Т4216С, G13708A, G15257A, G15812A) в группе российских больных и контрольной группе. Во всех случаях наблюдается статистически достоверное превышение (на уровне значимости p 0,05) частоты вторичных мутаций в группе больных по сравнению с контрольной группой. Относительно роли вторичных мутаций высказываются разные мнения. Некоторые авторы считают, что вторичные мутации могут быть причиной АЗНЛ в отсутствие первичной мутации (Johns DR, Neufeld MJ,1991). Более обоснованным представляется мнение о модифицирующем влиянии тех или иных вторичных мутаций на клинические характеристики АЗНЛ, чему есть немало свидетельств (Brown MD et al.,1992; Brown MD et al.,1995; Howell N et al., 1995; Oostra RJ et al., 1994). Наши результаты не позволяют подтвердить либо 12 опровергнуть эти данные: основные клинические характеристики АЗНЛ у больных не различались при наличии или отсутствии исследовавшихся нами вторичных мутаций. Однако наш материал для такого сравнения не столь велик, из многих известных вторичных мутаций исследовались только основные, а особенности клинической картины не анализировались углубленно (на уровне инструментальных исследований и т.п.). Очевидно, роль вторичных мутаций требует дополнительных исследований. При определении гаплогрупп мтДНК у 26 неродственных семей выявлено, что они принадлежат к 6 европейским гаплогруппам: мтДНК 14 семей относятся к гаплогруппе J, 5 — к гаплогруппе U, 3 — к гаплогруппе T, 2 — к гаплогруппе W, 1 — к гаплогруппе X и 1 — к гаплогруппе V. В подгруппе пациентов с первичной мутацией G11778A показано наличие нескольких гаплогрупп мтДНК, но преобладающей является гаплогруппа J — 13 семей (59,1 %), совокупная доля остальных гаплогрупп 40,9 % (гаплогруппа U — 5 семей, гаплогруппа T — 1, гаплогруппа W — 2, гаплогруппа V — 1 семья). Эти данные косвенно указывают на отсутствие связи между возникновением заболевания и принадлежностью мтДНК к определенной гаплогруппе. В семье Кир-вых с первичной мутацией T14484С в результате прямого нерадиоактивного секвенирования с подтверждением методом ПЦР-ПДРФ, помимо нескольких известных вторичных мутаций (Т4216С, G13708A, G15257A, G15812A) и 28 описанных непатогенных полиморфизмов, была обнаружена ранее не описанная мутация A9016G в гене АТФ-азы 6, ведущая к замене изолейцина на валин (рис. 2). Другая ранее не описанная мутация в этом гене (T9101C) была найдена у больного из Финляндии (Lamminen et al., 1995). В отличие от нашего наблюдения, этот больной не имел ни одной из первичных мутаций, и авторы расценили найденную мутацию в гене АТФ-азы 6 как причину АЗНЛ. Наша находка, конечно же, не является первопричиной заболевания, но возможно оказывает модифицирующее действие на течение болезни. 13 а) б) в) Пациент Homo sapiens Bos Taurus Canis familiaris Gorilla gorilla Mus musculus Sus scrofa IQPMALAVRLTANVTAGHLLMHLIGSATLAMSTINLPSTL IQPMALAVRLTAN I TAGHLLMHLIGSATLAMSTINLPSTL IQPMALAVRLTAN I TAGHLL I HLIGGATLALMSISTTTAL IQPMALAVRLTAN I TAGHLL I HLIGGATLALINISATTAF IQPMALAVRLTAN I TAGHLLMHLIGSATLAMSTTNLPSTL IQPMALAVRLTAN I TAGHLLMHLIGGATLVLMNISPPTAT IQPVALAVRLTAN I TAGHLLIHLIGGATLALLNINTMTAF Рисунок 2. а). Мутация А9016G (8% ПААГ) (слева направо): 1- ПЦР-продукт, 2контроль, 3-пробанд, 4- больная мать пробанда, М- маркер молекулярного веса 100 b.p. б). Сиквенс участка гена митохондриальной АТФазы6. Мутация A9016G. в). Аминокислотная последовательность митохондриальной АТФазы6 у различных биологических видов. 14 Клинико-генеалогические характеристики семей с АЗНЛ Из 40 семей с достоверными генеалогическими сведениями в 14 (35 %) пробанд является единственным больным, в 26 (65 %) болезнь носит семейный характер: в родословных имеются от 1 до 5 секундарных случаев в 1— 3 поколениях. Семейными являются 63,3% наблюдений с мутацией G11778А, 71,4% с мутацией G3460А, и одно из трех с мутацией T14484C (табл. 2). Помимо 51 обследованных больных (42 мужчин и 9 женщин) получены сведения о 37 родственниках (32 мужчине и 5 женщинах) с аналогичным заболеванием. Таким образом, с учетом секундарных случаев, количество больных в выборке составило 88 человек — 74 мужчины и 14 женщин. Выраженное преобладание мужчин прослеживается в подгруппах больных со всеми мутациями (табл. 2). В общей группе и подгруппе с мутацией G11778А это преобладание статистически значимо (χ2= 42,42; р= 00,00), в двух других подгруппах не достигает уровня значимости из-за количества наблюдений. Во всех семейных случаях наследование соответствует митохондриальному (по материнской линии), но почти все родословные демонстрируют неоднократные «пропуски» заболевания, то есть существенно сниженную пенетрантность, особенно у женщин (рис. 3); 16 родословных, где имеются больные мужчины в двух и более поколениях, и нет больных женщин, имитируют Х-сцепленное рецессивное наследование. Рисунок 3. Примеры родословных с АЗНЛ. 15 Мы провели расчет пенетрантности мутаций на основе 25 семейного наблюдения: 19 с мутацией G11778А, 5 с мутацией G3460А и единственного с мутацией T14484C. В этих родословных проанализированы лишь звенья с «пропусками» заболевания у мужчин старше 25 лет и женщин старше 45 лет (с учетом среднего возраста манифестации у мужчин и женщин). Полученные показатели приведены в таблице 2. Как видно из таблицы, пенетрантность мутаций G11778A и G3460A лишь немного превышает 50%. Такие цифры преимущественно обусловлены низкой пенетрантностью у женщин (27,1% и 10%, соответственно), хотя и у мужчин пенетрантность не является полной (83,3% и 90,9 %, соответственно). В единственном семейном наблюдении с мутацией T14484C пенетрантность оказалась несколько более высокой, но с теми же межполовыми различиями. Неравномерное поражение полов отражает гораздо более низкую пенетрантность первичных мутаций мтДНК у женщин по сравнению с мужчинами, хотя и у мужчин она снижена. Рассчитанная нами в подгруппе семейных наблюдений пенетрантность составила 54,2 %, в том числе 86,2 % у мужчин и 24,6 % у женщин. Более чем троекратная разница между показателями пенетрантности у мужчин и женщин соответствует данным других исследований, но сами цифры, особенно пенетрантность у мужчин, оказались существенно выше, чем в других исследованиях (Newman N et al., 1991; Puomila A et al.,2005.; Man et al., 2003; Phasukkijwatana N et al., 2006). Отчасти это может быть связано с методическими различиями. Так, например, финское популяционное исследование основано на широком проведении ДНК-диагностики в семьях и позволяет учесть большое количество здоровых носителей мутации, включая ветви родословных, где вообще нет больных; соответственно показатели пенетрантности оказываются низкими. В нашем исследовании, 16 напротив, молекулярно-генетическое обследование здоровых членов семей было ограниченным, а в расчет пенетрантности включены только семейные случаи, что завысило показатели. Кроме того, авторы по-разному учитывают фактор возраста начала, что тоже отражается на результатах. Связи пенетрантности с видом мутации мы не отметили, возможно, из-за объема выборки. Табл. 2. Генетические характеристики АЗНЛ Мутация G11778А Доля мутации в выборке, % Семейные случаи % Соотношение полов (м:ж) Пенетрантность % В том числе у мужчин у женщин Гетероплазмия Семьи % Больные % Все лица с мутацией % Суммарно G3460А T14484С 77,3 63,3 5,0 53,3 83,3 27,1 15,9 71,4 5,5 52,4 90,9 10,0 6,8 (1/3) 7,0 75,0 100,0 33,3 56,8 5,2 54,2 86,2 24,6 — — — 14,3 12,5 23,1 — — — 2,3 1,96 4,5 Возраст начала АЗНЛ. Возраст начала у обследованных больных колеблется от 9 до 48 лет. В эти же возрастные рамки укладывается начало болезни почти у всех родственников, о которых получены клинические сведения; лишь две женщины из разных семей заболели на 6-м десятилетии жизни. Распределение больных по возрасту начала представлено на рис. 4. 17 Рисунок 4. Распределение больных по возрасту начала заболевания количество больных, чел 25 20 15 мужчины 10 женщины 5 0 9--15 16-20 21-25 26-30 31-40 > 40 возраст,годы Как показывает рисунок, в большинстве случаев болезнь началась в 16—25 лет, что прослеживается при всех мутациях. Наглядны межполовые различия по возрасту начала. Случаев позднего начала у мужчин почти нет (единственный случай позднего начала заболевания — в 45-47 лет), тогда как распределение женщин по возрасту начала сдвинуто к старшему возрасту: почти у половины женщин болезнь началась после 40 лет, а у двух из них — после 50. С целью проверки этого утверждения была проведена оценка статистической достоверности различий в возрасте начала заболевания между мужчинами и женщинами. Проверка согласия распределения значений возраста в исследуемых группах, проведенная с использованием статистики Колмогорова-Смирнова, не подтвердила правомочность аппроксимации этих распределений нормальным законом. В силу этого, оценка различий проводилась с использованием рангового метода – критерия Вальда-Волфовитца . Результаты представлены в таблице 3, где: N1-количество мужчин в группе больных АЗНЛ; N2-количество женщин в группе больных АЗНЛ; Таблица 3. N1 N2 Среднее значение Среднее значение 18 Значение статистики Уровень значимости возраста среди возраста среди Вальдамужчин женщин Волфовитца 63 12 22,521,46 37,678,96 4,79 p<0,01 Приведенные в табл. 3 данные показывают, что наблюдается статистически достоверное (на уровне значимости p<0,01) превышение возраста начала заболевания среди женщин по сравнению с мужчинами. Внешнесредовые воздействия В анамнезе у части наших пациентов отмечены те или иные неблагоприятные воздействия (хронические интоксикации, острые инфекционные заболевания, черепно-мозговые травмы), но малое число наблюдений, отсутствие контрольных групп и надежных сведений о членах семей не позволяют судить о роли этих факторов в развитии АЗНЛ. Только в одном из наших наблюдений представляется несомненным развитие болезни под действием внешнего провоцирующего фактора — противотуберкулезного препарата комбутола (комбинированный препарат на основе этамбутола с добавлением изониазида). Способность этих препаратов вызывать нейропатию зрительных нервов хорошо известна: оба препарата оказывают токсическое действие на митохондрии и тем самым нарушают окислительное фосфорилирование и снижают порог экспрессии фенотипа. Больная Ш-ко, заболевшая в 34 года во время лечения этим препаратом, имеет мутацию в положении G3460A в состоянии гетероплазмии с клоном мутантной мтДНК всего 40%. В литературе известны три случая АЗНЛ, спровоцированной этими препаратами. Наше наблюдение дополняет эту небольшую группу и показывает, что при наличии такого провоцирующего фактора болезнь может развиться даже при 40%-й гетероплазмии, причем у женщины. 19 В большинстве же наблюдений заболевание начиналось резко без какихлибо провоцирующих факторов. Дебют и течение АЗНЛ Почти у всех обследованных болезнь развилась остро или подостро. Период снижения зрения продолжался от нескольких дней до 4—6 мес., в большинстве случаев составляя 2—3 мес. Следует отметить, что часть больных обследована в первые месяцы болезни, и у некоторых снижение зрения на момент обследования еще продолжалось. У 9 больных поражение обоих глаз произошло одновременно, у остальных больных — с интервалом от 1—3 нед. до 4—6 мес., чаще — 1—2 мес. Офтальмологическая картина в острый период соответствовала картине ретробульбарного неврита с многочисленными центральными скотомами. Острота зрения почти во всех случаях упала до сотых долей. В большинстве — ниже 0,05. У 29,2 % больных острота зрения снизилась до 0,05—0,09, и лишь 4,2 % больных по завершении острого периода сохраняли остроту зрения 0,1 (таблица 4) Таблица 4. Степень снижения зрения у больных АЗНЛ Мутация Острота зрения в остром периоде 0 — 0,04 G11778A G3460A T14484C Всего 24 (66,7%) 4 (50 %) 4 32 (66,7 %) 0,05—0,09 11 (30,6%) 3 (37,5 %) — 14 (29,2 %) 0,1—0,2 1 (2,8 %) 1 (12,5%) — 2 (4,2 %) Положительная динамика: в первые 6 мес. на 2-3-м году 1 3 1 1 1 — 3 4 Связи степени и темпов снижения зрения с полом больных, а также с возрастом начала болезни не установлено: у женщин с поздним началом болезни поражение было не менее тяжелым. 20 Большинство наших наблюдений не позволяет оценить долгосрочное течение: у 22 больных давность болезни не превышает года, а у 15 из них — 6 мес. В нашей выборке в ряде наблюдений отмечена более или менее существенная положительная динамика зрения по мере течения болезни. У одного больного с мутацией Т14484С зрение восстановилось с 0,01 до 0,4-0,6 через 4 месяца после начала заболевания. У 2 больных положительная динамика отмечена в первые полгода болезни. У 4 больных наблюдалось некоторое улучшение зрения на 2—3-м году болезни. В остальных случаях резкое снижение зрения было стойким, в частности, в двух случаях из трех при мутации T14484C, считающейся относительно благоприятной в плане восстановления. Все больные, за исключением совсем недавно заболевших, являются инвалидами по зрению, но некоторые продолжают работать или учиться. В семье Суг-вых трое больных: обследованные нами монозиготные близнецы 34 лет и умерший брат бабушки по линии матери. Вит. Суг-в заболел в 25 лет в период службы в армии. При обращении к врачу было зарегистрировано снижение зрения OD, спустя 2—3 нед. — также OS. Острота зрения быстро достигла 0,01—0,02 и на протяжении 9 лет остается неизменной, операция (рассечение спаек оптохиазмальной области) не дала эффекта. Второй близнец, Вал. Суг-в, заболел в 33 года, до болезни работал шофером. Без явных провоцирующих моментов, внезапно заметил ухудшение зрения. Как и у брата, первым пострадал правый глаз; острота зрения снизилась до 0,01—0,02. Оба соматически здоровы, не имеют вредных привычек. МРТ головного мозга не изменена. Являются инвалидами I гр. 21 У обоих близнецов и здоровой 53-летней матери найдена мутация мтДНК G11778A в состоянии гомоплазмии. Монозиготность пары, предварительно диагностированная методом сходства и подобия, подтверждена ДНК-анализом, проведенным в лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН (руководитель — д.б.н., проф. А.В.Поляков). В семье Ш-ко двое больных: 10-летний пробанд и его мать 43 лет. Мальчик заболел в 9 лет потеря без видимых провоцирующих моментов. У матери зрения (на оба глаза одновременно) произошла в 34 года в период реконвалесценции после первичного легочного туберкулеза, на фоне лечения комбутолом (изониазид + этамбутол). Зрение снижалось в течение года и достигло 0,04—0,05 без существенного улучшения в последующем. Офтальмологическая картина у пробанда и матери типична для острой и хронической стадий АЗНЛ, соответственно. Сопутствующих расстройств нет, МРТ не изменена. При ДНК-диагностике обнаружена мутация мтДНК G3460A: у пробанда — в состоянии гомоплазмии, у матери — в состоянии гетероплазмии с клоном мутантной мтДНК 40%. Такая же гетероплазмия выявлена у здоровых 23летней сестры и двухлетней племянницы пробанда. Сопутствующие внеглазные проявления Поражение нервной системы Из 40 неврологически осмотренных больных у 12 (30%) при осмотре и/или по медицинским документам отмечены нарушения в неврологическом статусе; в подгруппе с мутацией G11778A доля таких больных оставила 38%. В таблице 5 представлена частота отдельных неврологических симптомов. Таблица 5. Структура неврологических симптомов у больных АЗНЛ Характер симптомов Частота (%), n=40 Пирамидные симптомы 7 (17,5%) Снижение/отсутствие брюшных рефлексов 6 (15,0%) Расстройства чувствительности (включая субъективные) 3 (7,5%) 22 Тремор 5 (12,5%) Атаксия 3 (7,5%) Периферические вегетативно-трофические расстройства 2 (5,0%) Как видно из таблицы, выявленные неврологические расстройства достаточно разнообразны и относительно нередки (особенно пирамидные симптомы и тремор). Вместе с тем у всех больных они нетяжелы. Из 12 больных с неврологическими симптомами 11 имеют мутацию G11778A, но это преобладание соответствует доле данной мутации в выборке и не указывает на ее избирательную ассоциацию с неврологическими симптомами. В 34 случаях проанализированы данные КТ и/или МРТ головного мозга (по снимкам или описаниям). У 28 больных патологии не отмечено, у 6 (17,6%) найдены те или иные изменения МРТ (табл.6); в подгруппе больных с мутацией G11778A эта цифра составила 22,2%. Среди нескольких случаев с изменениями МРТ обращает на себя внимание очаговое поражение белого вещества головного мозга у одного больного: случаи АЗНЛ с изменениями белого вещества описаны в литературе. Другие выявленные изменения, включая кисту прозрачной перегородки у двух неродственных больных, скорее всего они независимы от АЗНЛ. Таблица 6. Изменения МРТ головного мозга у больных АЗНЛ Больной Б-в, 16 л. В-на 48 л. Гал-н, 19 л. Тер-в, 25 л. Ш-ков 20 л. Изменения КТ/МРТ Киста прозрачной перегородки Синдром «пустого турецкого седла», умеренное расширение субарахноидальных пространств В белом веществе левого полушария, субкортикально в проекции центральной извилины неоднородный очаг гиперинтенсивного Т-сигнала размером 7 мм, овальной формы, с четкими контурами Расширение субарахноидальных пространств Умеренное расширение субарахноидальных пространств и боковых желудочков 23 Ях-в, 28 л. Киста прозрачной перегородки Примечание: все больные имеют мутацию G11778A Другие сопутствующие проявления Представляет интерес случай сочетания АЗНЛ с сахарным диабетом типа I у пробанда из семьи Кир-вых. Д. Кир-в 35 лет болен с 18 лет, когда без явных провоцирующих моментов быстро снизилось зрение: вначале OD, через 1—2 мес. также OS. За 6 мес. острота зрения OU упала до 0,01—0,03 и в последующем не изменилась. Почти одновременно с АЗНЛ остро развился сахарный диабет типа I, манифестным проявлением была диабетическая кома. Изменений в неврологическом статусе нет, КТ головного мозга без изменений (обследован в начале болезни). Мать заболела в 46 лет, зрение быстро снизилось до 0,02—0,03: через 4 мес. после начала болезни стала инвалидом I гр. В последующие 12 лет состояние стабильное, но адаптирована к дефекту зрения хуже сына. Диабета нет, имеется эутиреоидный зоб. Изменений в неврологическом статусе не отмечено, КТ/МРТ не проводилась. У 4 больных родственников АЗНЛ начиналась в 18—30 лет, степень снижения зрения у всех была выраженной, инвалидизирующей, без восстановления; ни один не страдал сахарным диабетом. При молекулярно-генетическом исследовании у пробанда и матери обнаружены первичная мутация мтДНК T14484C, вторичные мутации Т4216С, G13708A, G15257A, G15812A, а также новая, ранее не описанная мутация A9016G в гене АТФ-азы 6. Разносторонняя связь митохондриальных болезней с сахарным диабетом хорошо известна. митохондриальным С одной стороны, наследованием, существует обусловленный сахарный точковыми диабет с мутациями мтДНК, с другой — сахарный диабет наблюдается при ряде митохондриальных болезней, связанных с мутациями как мтДНК (синдромы Вольфрама, Кирнса— 24 Сейра, MELAS), так и ядерной ДНК (болезнь Фридрейха, семейный шейный липоматоз). Однако при АЗНЛ сахарный диабет крайне редок. В литературе нам встретилось лишь три случая такого сочетания (Cole et al., 2000; DuBois L., Feldon S, 1992; Newman N et al., 1991), причем в одном из них речь идет о позднем сахарном диабете типа II; все трое неродственных больных имели мутацию G11778A. Наше наблюдение является первым случаем сахарного диабета при АЗНЛ, вызванной мутацией T14484C. В этой семье найдена также мутация A9016G в гене АТФ-азы 6, с которой, возможно, связана эта и другие особенности АЗНЛ в этой семье. Костных деформаций, встречающихся при АЗНЛ, у обследованных нами больных не найдено. Также не наблюдалось нарушений сердечной проводимости (хотя не все обследованы кардиологически). Из редких сопутствующих признаков можно отметить одностороннюю депигментацию брови и ресниц у одного больного, в связи с чем в начале болезни подозревали синдром Харады (редкая нейроинфекция с очаговой депигментацией). У 16 здоровых родственников, имеющих первичные мутации, отсутствуют заболевания и признаки, которые можно было расценить как внеглазные симптомы АЗНЛ. В помощь практическому здравоохранению нами предлагается протокол клинической и лабораторной диагностики. Его разработка базировалась на собственных данных и анализе литературных источников. Использование этого протокола позволяет избежать применения необоснованного гормональными препаратами, а также хирургического вмешательства. ВЫВОДЫ 25 лечения 1. Установлено, что наиболее часто в российских семьях с АЗНЛ встречается мутация G11778A (77,3 % семей), второй по частоте является мутация G3460А (15,9 %), наиболее редкой — мутация T14484C (6,8 %), что согласуется со средними мировыми данными. В 97,7% мутации обнаружены в гомоплазмическом состоянии. Гетероплазмия (40 % мутантной мтДНК в клетках крови) выявлена в одной семье (2,3 %), где сочетаются случаи АЗНЛ с гомо- и гетероплазмией. 2. В 59,1 % семей первичным мутациям сопутствуют вторичные мутации мтДНК T4216C, G13708A, G15257A и G15812A в разных комбинациях; частота данных мутаций в группе пациентов достоверно отличается от контроля. 3. Проведено определение гаплогруппы мтДНК в 26 семьях и выявлено 6 разных европейских гаплогрупп (J, U, W, T, V, X), среди которых преобладает гаплогруппа J — 53,8 % (14 семей). Не установлено четкой связи между мутацией G11778A и определенной гаплогруппой мтДНК. 4. Найдена ранее не описанная мутация A9016G в гене АТФ-азы 6, затрагивающая эволюционно консервативную область, в семье с первичной мутацией T14484C помимо вторичных мутаций. 5. Установлено, что неполная пенетрантность первичных мутаций, преимущественно определяется полом: суммарная пенетрантность мутаций в семейных случаях составила 54,2%, в том числе, 86,2% у мужчин и 24,6% у женщин. Зависимость пенетрантности от пола определяет значительное преобладание мужчин среди больных (м:ж=5,2). Показаны достоверные различия в возрасте начала заболевания у мужчин и женщин: средний возраст начала составил 23 года у мужчин и 38 лет у женщин 6. Клинические проявления в остром периоде АЗНЛ не зависят от пола, возраста больных и первичной мутации. В 14,6% случаев частичное восстановление зрения 26 в хронической стадии болезни наблюдалось при наличии любой из первичных мутаций мтДНК Т14484С, G11778A, G3460A. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Povalko N.B., Rudenskaia G.E., Karlova I.Z., Zakharova E.Y. " Prevalence of G11778A mutation causing Leber’s Hereditary optic neuropathy in Russia", conference for young scientist, PhD students on molecular biology and genetics. 2003, September 25-27, Kiev, Ukraine, Abstract’s book, p.253. 2. Руденская Г.Е, Повалко Н.Б., Захарова Е.Ю., Окунева Е.Г. Семейные случаи атрофии зрительных нервов Лебера. Материалы Всероссийской научно- практической конференции "Современные достижения клинической генетики", Москва 26-27 ноября, Медицинская генетика, 2003, 10, с.439. 3. Povalko N., Zakharova E., Akita Y., Nishioka J., Koga Y. Entire mtDNA sequence analysis in Russian LHON family. 6th European meeting on mitochondrial pathology 1 July-4 July 2004, Nijmegen, The Netherlands. Biochimica et Biophysica acta EUROMIT 6 Abstract book, p.93. 4. Povalko N., Zakharova E., Rudenskaia G., Akita Y., Hirata K., Toyojiro M., Koga Y. A new sequence variant in mitochondrial DNA associated with high penetrance of Russian Leber hereditary optic neuropathy. Mitochondrion, 2005, 5(3), p.194-199. 5. Povalko N., Zakharova E., Rudenskaia G., Akita Y., Hirata K., Toyojiro M., Koga Y. A new sequence variant in mitochondrial DNA associated with high penetrance of Russian Leber hereditary optic neuropathy. 7th Meeting of European NeuroOphthalmology Society, June 26-29, 2005, Moscow, Russia. Abstracts, p.30. 6. Захарова Е.Ю., Повалко Н.Б. Болезни дыхательной цепи митохондрий: диагностические критерии. В сборнике Молекулярно-биологические технологии в 27 медицинской практике. Под ред. А.Б.Масленникова.-вып.8-Новосибирск: Альфа Виста, 2005, с.85-90. 7. Повалко Н.Б., Захарова Е.Ю., Карлова И.З., Руденская Г.Е. Атрофия зрительных нервов Лебера в российских семьях: ДНК-диагностика и клиникогенетические характеристики. Материалы научно-практической конференции «Вопросы офтальмогенетики», 2005, Москва, с.119-126. 8. Povalko N., Akita Y., Koga Y. A new sequence variant in mitochondrial DNA associated with high penetrance of Russian Leber hereditary optic neuropathy. XVIII World Congress of Neurology, Journal of the Neurological Sciences, v.238, suppl.1, 2005, S 171. 9. Захарова Е.Ю., Повалко Н.Б., Руденская Г.Е., Покровская А.Я., Николаева Е.А. Анализ мутаций при митохондриальных заболеваниях у российских больных. Материалы IX Всероссийского съезда неврологов. Ярославль, 2006, с.92. 10. Povalko N., Zakharova E., Rudenskaya G. Pathogenic mitochondrial mutations in Russian families with Leber’s hereditary optic neuropathy. European Human Genetics Conference’s Abstracts, European Journal of Human Genetics, v. 14, suppl. 1 , 2006, p.142. 11. Н.Б.Повалко, Е.Ю.Захарова, Г.Е.Руденская. Мутации мтДНК при атрофии зрительных нервов Лебера в российских семьях. Медицинская генетика, 2006, т.5, № 8, с. 24-29. Соискатель Повалко Н.Б. 28
