Начало формы АЙТАШЕВА З АДФ

АЙТАШЕВА З
АДФ-РИБОЗИЛИРУЮЩИЙ БЕЛКОВЫЙ ФАКТОР ПЫЛЬЦЫ, КОТОРЫЙ СТИМУЛИРУЕТ
ГТФазу
(Институт молекулярной биологии и биохимии
им. М.А. Айтхожина НАН РК)
Среди потенциальных лигандов рецепторной киназы пыльцы [1] экспериментально
показано наличие серин-треониновой протеин-киназы [2]. Поскольку большинство
эукариотических протеин-киназ обладают АТФ-связывающей способностью (примерно 4500
из 6400 по данным анализа программы InterPro), то поиск нуклеотид-связывающих лигандов
мужского гаметофита вполне закономерен. С этой целью в работе использовался
дигибридный анализ, как описано ранее [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис.1 представлена нуклеотидная последовательность гена (390 нт) и первичная
структура дедуцированного белка (130 АК-остатков), впоследствии обозначенного как ARFGAP (от ADP-ribosylation factor - GTPase-activator protein). Аналогично дополнительной
рецепторной киназе KIN1 [2], данный белок был впервые обнаружен при анализе фрагментов кДНК для домена CD3 рецепторной киназы пыльцы LePRK3. При дальнейшем сравнении с базой данных для арабидопсиса белок ARF-GAP оказался гомологичным белковому
фактору, который стимулирует ГТФазу и обладает АДФ-рибозилирующей активностью. Как
свидетельствует рисунок, N-концевой участок полипептида, как и многие другие GAP-белки
(от GTPase-activator protein), содержит несколько остатков Arg, в т.ч. и в районах т.н.
«аргининовых пальцев» [3, 4]. Последние функционируют во время специфической реакции
гидролиза ГТФ. В данном случае такими консервативными Arg-остатками могут служить
пары R-4 и R-44 или R-14 и R-54 (рис.1). Анализ мотивов в составе белок ARF-GAP показал
также, что т.н. “цинковый палец” (АК 3-73) белка находится в составе более обширного АДФ
- рибозилирующего фрагмента (АК 4-115). Кроме того аминокислотная последователь-ность
рассматриваемого белка содержит мотивы белка RIP (от retrovirus-interacting protein, АК 1349; 53-74) для ядерного экспорта определенного типа РНК, HIV1-РНК. Подобные белки были
ранее выявлены для многих факторов транскрипции GATA-типа. В составе белка ARF-GAP
томата отличимы и родопсиновые фрагменты (родопсин 1, АК 26-50 и родопсин 4, АК 51-72),
которые почти совпадают с зоной RIP-белка. Таким образом, родоп-синовые мотивы
характерны для белков KPP1, KIN1 и ARF-GAP. Среди многих возможных сайтов
фосфорилирования белка ARF-GAP стоит указать на Т-57, который способен
взаимодействовать с несколькими типами протеин-киназ, например, CaMII, p70s6k и PKA.
Различным семействам низкомолекулярных эукариотических ARF-полипептидов сейчас
предписывается участие в сигнальных реакциях [5, 6]. В подавляющем большинстве
случаев после связывания ARF с ГТФ комплекс [ARF-GTP] переходит в мембраноассоциированное состояние. После дальнейшего гидролиза ГТФ гуанидинфосфат
обнаруживается в виде комплекса [ARF-GDP].
Гибридизация РНК из различных органов томата с радиоактивным фрагментом кДНК для
белка ARF-GAP (рис. 2) указала на присутствие транскрипта, кодирующего белок ARF-GAP,
который состоит из 1550 нт и специфичен для пыльцы. Согласно данным реакции обратной
транскрипции -ПЦР (РОТ-ПЦР), транскрипты для белка ARF-GAP аккумулируются в составе
пыльцы и пестиков (данные не приводятся). Таким образом, подобно белкам другим
потенциальным лигандам рецепторных киназ пыльцы томата, например KPP1 и KIN1, белок
ARF-GAP характерен для репродуктивных, но не вегетативных, органов.
В настоящее время изучаются несколько групп белков ARF-GAP, вступающих в комплексы с паксиллином и др. цитоскелетными белками, а также различными сигнальными пептидами эукариот [7]. Установлено [5-7], что животные ARF-белки принадлежат семейству RasГТФаз, контролируют мембранный транспорт и функции актинового цитоскелета.
Хотя Ras-белки в растениях не найдены, в геноме арабидопсиса зарегистрировано не
менее 11 различных уникальных rop-ГТФаз из семейства низкомолекулярных Rho-ГТФаз.
Установлено, что именно эти белки арабидопсиса контролируют актин-зависимое
прорастание пыльцы и защитную реакцию на перекисное окисление [8]. В частности, вклад
белка.
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность гена и соответствующая первичная структура
белка ARF-GAP из пыльцы томата.
Показаны родопсиновый мотив (сплошной линией), «цинковый палец» (АК 3 - 73),
характерный для АДФ-рибози-лирующих факторов (жирным шрифтом), и ключевой сайт
предполагаемого фосфорилирования Т-57 (точкой).
Рис. 2. Блот-гибридизация РНК томата с 32Р-радиоактивным фрагментом кДНК для АДФрибозилирующего белка пыльцы. Электрофорез в 1,5%-м агарозном геле с
формальдегидом.
Дорожки: 1, 11 - маркерная ДНК (1 - ?-HindIII, 11 - ?X174-HaeIII), 2 - 10 -РНК из различных
органов томата (2 - РНК семян, 3 - корней, 4 - гипокотилей, 5 - семядолей, 6 - листьев, 7 микроспор, 8 - зрелой пыльцы, 9 - чашелистиков и 10 - пестиков).
GAP в увеличение пыльцевых трубок проявился в виде чрезмерной экспрессии гена
RopGAP1. При этом функционирование данного гена вызывало модификации актина и рост
пыльцевых трубок [9]. В связи с тем, что трансгенные линии арабидопсиса по гену rop2
подтверждали общее стимуляторное влияние гена на развитие зародыша, проростка,
боковых корней и побегов, равно как и на филотаксис и закладку боковых органов, а часть
мутантов проявляла чувствительность одновременно к нескольким гормонам (ИУК, АБК и
брассинолиды), то rop-ГТФазы арабидопсиса были отнесены к универсальным
молекулярным переключателям процессов роста, развития и адаптации к стрессу [8].
Теперь принято считать, что участие белка ARF-GAP в модификациях актина опосредуется
ионами Са2+, актин-связывающими производными фосфолипидов и др. эффекторными
белками [10]. Также показано, что белок ARF-GAP арабидопсиса стимулирует активность
фосфолипазы D и образование продукта данной ферментной реакции, т.е. фосфатидной
кислоты (PA) - центрального звена липидного обмена [11]. Следует добавить, что эукариоты
содержат т.н. ARL (от ARF-like), или ARF-подобные белки [12]. Это означает, что семейство
ARF-белков по возрастающей численности и многообразию функций конкурирует с
рецепторными киназами сигнальной трансдукции. В любом случае для функции белка ARFGAP необходимы регулируемое связывание и гидролиз ГТФ. Интеграция белка ARF-GAP
при переходе из цитоплазмы в аппарат Гольджи стимулируется дополнительной реакцией
связывания между каким-то иным лигандом и рецепторным белком. В последствии белок
ARF-GAP переходит из аппарата Гольджи в эндоплазматическую сеть [13, 14]. Поэтому
компартментация и взаимодействие ARF-GAP с родственными ГТФазами может оказаться
дополнительным способом регуляции рассматриваемого белка. В то же время GAP-белки
обычно содержат набор вариабельных мотивов, благодаря которым белок участвует в
регуляции других рецепторов, помимо основного [15].
Вероятность фосфорилирования внеклеточного белка GAP-зависимой протеин-киназой
Erk1 [16] позволяет впоследствии исследовать участие цитоплазматического белка ARFGAP во взаимодействии ECD- и CD-доменов, а также собственного взаимодействия белка
ARF-GAP с прочими лигандами, обслуживающими разные домены рецепторной киназы
пыльцы.
LITERATURE
1. Muschietti J., Eyal Y., McCormick S. Pollen tube localization implies a role in pollen-pistil
interactions for the tomato receptor-like protein kinases LePRK1 and LePRK2 // Plant Cell.
-1998. -V.10. -P.319-330.
2. Айташева З. Сигнальные механизмы прорастания пыльцы высших растений.
Алматы, 2002. -192с.
3. Scheffzek K., Ahmadian M.R., Wittinghofer A. GTPase-activating proteins: helping hands
to complement an active site // Trends Biochem. Sci. -1998. -V.23. -P.257-262.
4. Paulin F.E.M., Campbell L.E., O’Brien K., Loughlin J., Proud C.G. Eukaryotic translation
initiation factor 5 (eIF5)acts as a classical GTPase-activator protein // Curr. Biol. -2001. V.11. -P.55-59.
5. Moss J., Vaughan M. Molecules in the ARF orbit // J. Biol. Chem. 1998. V.34. P.2143121434.
6. Randazzo P.A., Nie Zhongzhen, Miura K., Hsu V.W. Molecular aspects of the cellular
activities of ADP-Ribosylation factors // Science’s STKE. -2000. -№59. -Ref. 1.
7. Turner C.E., West K.A., Brown M.C. Paxillin- ARF GAP signalling and the cytoskeleton //
Curr. Op. Cell Biol. -2001. -V.13, №5. -P.593-599.
8. Li H., Shen J.J., Zheng Z.L., Lin Y., Yang Z. The rop gtpase switch controls multiple
developmental processes in Arabidopsis // Plant Physiol. -2001. -V.126. -P.670-684.
9. Yang Fu, Wu Guang, Yang Zhenbiao. RopGTPase-dependent dynamics of tip-localized Factin controls tip growth in pollen tubes // Plant Biology Meeting 2001. -USA. -Abs. #62.
10. Palanivelu R., and Preuss D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip
growth mechanisms // Trends in Cell Biol. -2000. -V.10. -P.517-524.
11. Jensen R.B., Lykke-Andersen K., Frandsen G.I., Nielsen H.B., Haseloff J., Jespersen
H.M., Mundy J., Skriver K. Promiscous and specific phospholipid binding by domains in
ZAC, a membrane-associated Arabidopsis protein with an ARF GAP zinc finger and a C2
domain. Plant Mol. Biol. 2000. V.44. P.799-814.
12. Van Valkenburgh H., Shern J.F., Sharer J.F., Zhu X., Kahn R.A. ADF- ribosylation factors
(ARFs) and ARF-like 1 (ARL1) have both specific and shared effectors // J. Biol. Chem.
2001. V.276. P.22826-22837.
13. Majoul I., Straub M., Hell S.W., Duden R., Soelling H.-D. KDEL-cargo regulates
interactions between proteins involved in COPI vesicle traffic: measurements in living cells
using FRET // Dev. Cell. 2001. V.1. Р.139-153.
14. Morinaga N., Kaihou Y., Vitale N., Moss J., Noda M. Involvement of ADP- ribosylation
factor 1 in cholera toxin-indiced morphological changes of chinese hamster ovary cells // J.
Biol. Chem. 2001. V.276. P.22838-22843.
15. Druey K.M. Bridging with GAPS. Receptor communication through RGS proteins //
Science’s STKE. -2001. -№104. -ref.14. (stke. sciencemag. org/cgi/ content/full/
OC_sigtrans; 2001. 104-re. 14).
16. Айташева З., Танг В.-Х., МакКормик Ш. Лейцин-богатый белок 2 пыльцы томата // См.
Вестник КазНУ, сер. экол. (настоящий выпуск).
***
Ќосгибридтік талдау арќылы томат ?сімдігініњ г?л тозањындаѓы рецепторлыќ киназаѓа
жоѓары ќосымшылыѓын к?рсететін белоктыњ ќ?рамы мен нышандары аныќталѓан. Б?л
белоктыњ тозањ т?тігініњ ?сіп-?нуіне ?сер еткені болжамдалады.
***
Structure and motifs of pollen protein revealing, by the data of two-hybrid analysis, high affinity
to the cytoplasmic domain of tomato pollen receptor kinase, is demonstrated. It is supposed that
the protein may take part in pollen tube growth.