ОЦЕНКА ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ЧАСТОТ И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ БИОХИМИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
реклама
1 На правах рукописи ОЦЕНКА ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ЧАСТОТ И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ БИОХИМИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ Захарова Екатерина Юрьевна 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, Ижевская Вера Леонидовна Официальные оппоненты: Демикова Наталия Сергеевна, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научноисследовательский институт педиатрии и детской хирургии Минздрава России», руководитель Центра мониторинга врожденных пороков развития Куцев Сергей Иванович, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией мутагенеза Жученко Людмила Александровна, доктор медицинских наук, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства здравоохранения Московской области, заведующая медикогенетическим отделением диагностики, мониторинга и регистра врожденных пороков развития у детей Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт медицинской генетики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Защита состоится «___» _______ 2012 г. в ___ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1. Автореферат разослан «______»___________________ 2012 г. Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Наследственные болезни обмена веществ (НБО) - обширный и во многом уникальный класс моногенных болезней человека. На сегодняшний день к этому классу относят около 500 заболеваний, входящих в 22 подкласса в зависимости от пораженного метаболического пути (Темин П.А., 2001; Краснопольская К.Д., 2005; Clarke J.T.R., 2004). Отдельные нозологические формы НБО встречаются крайне редко, но результаты ряда исследований позволяют считать, что их суммарная частота, которая оценивалась изначально как 1:5000, занижена, и реальные значения этого показателя достигают 1:600 - 1:1000 живых новорожденных (Новиков П.В., 2006; Fernandes J., 2006). Данные по эпидемиологии большинства НБО недостаточны и разрозненны, в основном они базируются на ретроспективном анализе выявленных случаев (Krasnopolskaya K.D., 1993; Poorthuis B.J. et al. 1999; Dionisi-Vici C.et al. 2002). При этом даже приблизительная оценка относительной частоты групп НБО и отдельных нозологических форм позволяет более обосновано планировать организацию лабораторий по диагностике, создавать программы селективного и массового скрининга на эти заболевания. В диагностике НБО ведущая роль принадлежит биохимическим методам, в последние годы все более широко применяются методы ДНК-анализа для подтверждающей постнатальной и пренатальной диагностики. В сфере лабораторной диагностики НБО актуальны разработка и оптимизация протоколов, как биохимического (определение активности ферментов или анализ метаболитов) так и молекулярно-генетического обследования пациентов. При этом оценка чувствительности и специфичности методов, границ нормальных и патологических значений, осложняются малочисленностью выборок, что связанно с низкой частотой отдельных нозологических форм НБО. Одной из актуальных задач в области НБО является совершенствование неонатального скрининга. Во многих странах Европы и США массовый скрининг новорожденных включает обследование на несколько десятков НБО методом тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) (Schulze A., 2003, Wilcken B., 2003). В Российской Федерации для внедрения МС/МС в качестве основного 4 метода обследования новорожденных необходима предварительная работа по количественной оценке измеряемых соединений, составлению алгоритмов подтверждающей диагностики для каждой нозологической формы и разработке организационных принципов такого рода скринирования. В Российской Федерации до настоящего времени не решены некоторые проблемы подтверждающей диагностики заболеваний, включенных в программу массового обследования новорожденных в настоящее время. В первую очередь это касается подтверждающей диагностики галактоземии. Неонатальный скрининг на галактоземию проводится с 2006 г. В основе тестирования лежит определение концентрации тотальной галактозы в пятнах высушенной крови; при положительном результате (>7,2 мг/дл) проводят повторное определение уровня галактозы. Данный подход не является высокоспецифичным, поскольку известно много состояний, при которых возможно повышение уровня галактозы у новорожденного: транзиторная галактоземия, тяжелое поражение печени как наследственной, так и экзогенной природы, другие формы галактоземии. Поэтому, разработка протокола подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 является важной и актуальной задачей, стоящей перед программой массового скрининга (Кузьмичева Н.А., 2007; Lee J.Y., 2005). Подтверждающая ДНК-диагностика наследственных заболеваний довольно важна, а для некоторых болезней, в том числе и относящихся к НБО, она является наиболее предпочтительным подходом. Безусловна приоритетность молекулярно-генетических методов при установлении гетерозиготного носительства, а также в пренатальной диагностике заболеваний, при которых мутантный фермент не экспрессируется в клетках ворсин хориона. Для разработки эффективных протоколов ДНК-диагностики отдельных нозологических форм необходимы данные о частоте и спектре мутаций. Однако исследования, посвященные анализу частоты и спектра мутаций при НБО в Российской Федерации, носят ограниченный характер, что связано в большинстве случаев с ограниченным числом пациентов с этими редкими заболеваниями. Низкая частота, выраженный клинический полиморфизм, генетическая гетерогенность и биохимический полиморфизм, а также наличие гено- и фенокопий затрудняют диагностику НБО, как на клиническом, так и на лабораторном уровне. Однако совершенствование методов лечения этих 5 заболеваний, которое наблюдается в последние годы, требует особого внимания к классу этих наследственных заболеваний, поскольку от ранней диагностики во многом зависит и эффективность проводимой терапии (Wolf B et al., 1991; 2010; Desnick R.J., 2004; Moser H.W., 2004; Weisstein J.S., 2004; Nenad Blau, 2006). Цель исследования: Изучение относительных частот и спектра семи групп наследственных болезней обмена веществ. Оптимизация методов их биохимической и молекулярно-генетической диагностики для усовершенствования на этой основе программ массового и селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ. Задачи исследования: 1. Оценить спектр и относительные частоты наиболее распространенных подклассов наследственных болезней обмена веществ (лизосомных болезней накопления, митохондриальных заболеваний, нарушений обмена аминокислот, органических кислот, дефектов митохондриального βокисления, пероксисомных болезней, нарушений обмена углеводов) в выборке больных из Российской Федерации и обосновать необходимость оптимизации методов их лабораторной диагностики; 2. Оценить частоту заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в Центральном федеральном округе Российской Федерации на основании анализа числа новых случаев заболеваний; 3. Разработать биохимические методы подтверждающей диагностики пероксисомных болезней, и наиболее распространенных органических ацидурий методами газовой хроматографии – масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии – тандемной массспектрометрии; 4. Определить вклад наиболее распространенных мутаций для 14 форм наследственных болезней обмена веществ и разработать методы подтверждающей ДНК-диагностики этих заболеваний; 5. Изучить с помощью селективного скрининга вклад заболеваний из подклассов органических ацидурий, дефектов митохондриального βокисления и аминоацидопатий в структуру патологии нервной системы у детей раннего возраста; 6 6. Разработать алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 для совершенствования программы массового скрининга новорожденных в Российской Федерации. Научная новизна результатов исследования Впервые проведена оценка спектра и относительной частоты отдельных подклассов наследственных болезней обмена веществ (НБО) в Российской Федерации. Показано, что две группы заболеваний – лизосомные болезни накопления (ЛБН) и митохондриальные заболевания (МБ) являются наиболее представленными и многочисленными по числу нозологических форм. Установлено, что наиболее частой формой ЛБН является болезнь Гоше, а самыми распространенными группами - мукополисахаридозы и липидозы. Впервые определены частоты двадцати нозологических форм и суммарная частота ЛБН в Центральном Федеральном округе Российской Федерации. Определен удельный вес (2,3%) трех групп НБО (аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального β-окисления) в структуре заболеваний, сопровождающихся психо-неврологическими нарушениями у детей раннего возраста (от 0 до 5 лет). Впервые в России для 14 разных форм НБО (синдром Ли, атрофия зрительных нервов Лебера, синдром Альперса, галактоземия тип 1, тирозинемия тип 1, глутаровая ацидурия тип 1, недостаточность биотинидазы, недостаточность трифункционального белка, гликогеноз тип 1а, гликогеноз тип 1в, болезнь Баллера тип 2, болезнь Краббе, алькаптонурия, лейкоэнцефалопатия с поражением ствола и высоким уровнем лактата при МР-спектроскопии) показано наличие мажорных мутаций в соответствующих генах и определены их относительные частоты. Для диагностики галактоземии тип 1 был создан биочип, который позволяет определять 14 мутаций и полиморфизмов в гене GALT, для диагностики тирозинемии тип 1 - биочип, позволяющий выявлять 5 мутаций в гене FAH. Практическая значимость Разработан алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 с учетом биохимических и молекулярно-генетических данных, для использования 7 в программах массового скрининга новорожденных на данное заболевание. Определены отрезные точки и активности галактозо-1-фосфат уридилтрансферазы (Г-1-ФУТ) в пятнах высушенной крови и цельной крови, показано, что на значение активности фермента Г-1-ФУТ существенное влияние оказывают варианты носительства галактоземии тип 1 и полиморфные варианты гена (вариант Дуарте). Показана необходимость изменения отрезной точки при определении тотальной галактозы для снижения числа ложноположительных результатов тестирования при неонатальном скрининге. Разработаны методы определения уровня очень длинноцепочечных жирных кислот (ОДЦЖК) в плазме крови для биохимической диагностики пероксисомных заболеваний, микрометоды определении глутаровой, оротовой кислот и сукцинилацетона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии для подтверждающей диагностики глутаровой ацидурии тип 1, нарушений цикла мочевины и тирозинемии тип 1. Составлены таблицы для подтверждающей диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального β-окисления, которые включают определение органических кислот мочи методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии, исследование активности ферментов и ДНК-диагностику. Результаты данного исследования создают базу для совершенствования диагностики НБО, что имеет принципиальное значение для медикогенетического консультирования отягощенных семей и применения эффективных методов терапии, которые уже разработаны для некоторых заболеваний из этого класса. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Наиболее частыми и многочисленными по числу форм НБО, выявленных за период 2004-2009гг являются лизосомные болезни накопления (ЛБН) и митохондриальные болезни (МБ). 2. Наиболее представленными в подклассе ЛБН являются мукополисахаридозы и липидозы, среди нозологических форм 8 преобладает болезнь Гоше. В подклассе МБ превалируют заболевания, обусловленные мутациями мтДНК, среди нозологических форм – атрофия зрительных нервов Лебера. 3. Суммарная частота ЛБН в ЦФО Российской Федерации, рассчитанная по числу новых случаев заболевания на 100 000 новорожденных, составляет 5,22 или 1:19937. 4. Три группы НБО (аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального β-окисления) имеют удельный вес 2,3% в структуре заболеваний, сопровождающихся психо-неврологическими нарушениями у детей раннего возраста (от 0 до 5 лет). 5. Разработанный алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 позволяет с высокой достоверностью выявлять пациентов с данным заболеванием. На значение активности фермента Г-1-ФУТ существенное влияние оказывают носительство мутаций в гене GALT и полиморфные варианты гена (вариант Дуарте). Оптимальные отрезные точки активности Г-1-ФУТ для пятен крови и для цельной крови, различаются по своим абсолютным значениям, а также по чувствительности и специфичности 6. Разработаны биохимические тесты подтверждающей диагностики пероксисомных болезней, микрометоды определения глутаровой, оротовой кислот и сукцинилацетона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии 7. Для 14 форм НБО показано наличие мажорных мутаций, что позволяет применять простые методы ДНК-анализа для подтверждающей диагностики этих заболеваний. Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (г. Москва, 2003 г.), II Украинском конгрессе с международным участием «Метаболические наследственные заболевания» (г. Харьков, 2005), V (г. Уфа, 2005) и VI (г. Ростов-на-Дону, 2010) съездах Российского общества медицинских генетиков, IX Всероссийском съезде 9 неврологов (г. Ярославль, 2006), 8 конференции с международным участием «Генетика и патология» (г.Томск, 2007), II Всероссийском Конгрессе "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии" (г. Москва,2008), XII Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (г. Москва, 2008), Annual Symposium of Society for the Study of Inborn Errors of Metabolism (SSIEM) (Амстердам, 2004; Гамбург,2007; Лиссабон, 2008), European Conference of Human genetics, 2007, European Meeting on Mitochondrial Pathology (EUROMIT) (Ниймиген, 2004), 7th Meeting European Neuroophthalmology Society, (Moscow, 2005). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ФГБУ «МГНЦ» РАМН 15 февраля 2012 года. Внедрение в практику здравоохранения. Материалы диссертации внедрены в практическую работу ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства здравоохранения РФ, основные положения работы по подтверждающей диагностике галактоземии вошли в методические рекомендации, утвержденные Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации в 2006 г. и применяются в медико-генетических учреждениях и центрах неонатального скрининга. Получен патент «Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей». Материалы диссертации применяются в учебном процессе на кафедре медицинской генетики с курсом пренатальной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также при подготовке клинических ординаторов в ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН. Личное участие диссертанта. Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора. Автором были сформулированы цель и задачи исследования, разработаны методические подходы к диагностике различных классов НБО. 10 Сбор первичных данных и проведение лабораторных исследований проведены лично автором или при его непосредственном участии, обработка, анализ и обобщение полученных результатов при написании и оформлении рукописи выполнены лично автором. Публикации. По теме диссертации опубликовано 64 научные работы, в том числе 43 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, методические рекомендации для врачей, патент «Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей» № 2423521 от 27.10.2009, 1 руководство для врачей, 2 главы в «Педиатрия: национальное руководство», 1 глава в «Неврология: национальное руководство», 3 главы в «Наследственные болезни: национальное руководство», 1 глава в «Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство». Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 254 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав с описанием методики и результатов исследования, заключения, выводов, библиографии из 288 источников ( в том числе 30 на русском и 258 на иностранном языках) и 4 приложений. Работа содержит 40 рисунков и 52 таблицы. 11 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика выборок и материала для исследований. В основу работы положены результаты исследований, проведенных в лаборатории наследственных болезней обмена веществ в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (лаб.НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН). Для оценки нозологической структуры группы ЛБН, проведен анализ 902 случаев ЛБН, которые были диагностированы в лаборатории с 1992 - 2009гг. Характеристика относительной частоты подклассов НБО проведена на выборке из 370 пациентов, выявленных при обследовании 9875 пациентов, направленных с подозрением на НБО научно-консультативного отдела ФГБУ «МГНЦ» РАМН, отделений неврологии и эндокринологии ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства Здравоохранения РФ, Клиники нервных болезней им. А.Я.Кожевникова Московского Государственного Медицинского Университета им. И.М. Сеченова, ФГБУ «Эндокринологический научный центр Министерства Здравоохранения РФ», ФГБУ «Научный Центр здоровья детей и подростков» РАМН, ФГБУ "Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России", региональных медико-генетических консультаций. Частота ЛБН в Центральном Федеральном округе России, рассчитана по числу новых случаев заболеваний диагностированных в лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН за период 2000-2009гг. Данные по числу живых новорожденных за этот период по регионам Российской федерации получены по данным Росстата на сайте: (http://www.gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat/). Для расчета частоты применен метод, описанный Poorthuis B.J. с соавт. (1999). Частота рассчитывалась как общее число диагностированных пациентов по отношению к общему числу новорожденных в этот же период (при этом период рождения являлся интервалом между годом рождения старшего пациента и годом рождения младшего пациента в выборке). Если за указанный период был выявлен только один пациент, то учитывалось общее число новорожденных за эти годы. 12 Образцы пятен крови (n=113), а также данные по концентрации тотальной галактозы в крови у новорожденных с подозрением на галактоземию предоставлены Московским центром неонатального скрининга. Для селективного скрининга на НБО методом МС/МС проанализированы 500 образцов пятен новорожденных из Московского Центра неонатального скрининга и 5205 пациентов из психо-неврологических отделений крупных детских клинических стационаров: ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства Здравоохранения РФ, ФГБУ «Научный Центр здоровья детей и подростков» РАМН. Для отбора пациентов на селективный скрининг применены общепринятые критерии, разработанные ранее (Краснопольская К.Д., 2000). Материалом для биохимической диагностики являлись плазма гепаринизированной венозной крови и/или образцы утренней мочи. В качестве материала для молекулярно-генетических исследований использованы образцы ДНК, выделенные из цельной крови или пятен высушенной крови на фильтрах. Экспериментальные методы. Анализ аминокислот и ацилкарнитинов проведен на квадрупольном тандемном масс-спектрометре PE Sciex API 2000 (PE Sciex, Онтарио, Канада) с положительной ионизацией в электроспрее. Пробоподготовка для анализа аминокислот и ацилкарнитинов методом МС/МС проведена с помощью набора «NeoGram Amino Acids and Acylcarnitines Tandem Mass Spectrometry Kit» (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Wallac OY, Finland). Газовая хроматография – масс-спектрометрия выполнена на приборе HP5972A, колонка HP-5MS (30м*0,25мм*4 мкм). Концентрация органических кислот в моче определяли в виде триметилсилиловых эфиров. Для определения активности фермента Г-1-ФУТ использован модифицированный флюориметрический тест Бутлера (Beutler E., 1968). Для молекулярно-генетического анализа геномную ДНК из цельной крови и пятен крови на фильтрах выделяли, используя набор реактивов Diatom DNA Prep (ООО Биоком, Россия) по методике, рекомендованной изготовителем. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере “МС2” (АО “ДНКТехнология”, Москва). 13 Для каждой пары праймеров подобраны условия, отличающиеся необходимой температурой отжига и концентрацией MgCl2. Анализ частых мутаций проводили методами ПЦР, рестрикционного анализа, гельэлектрофореза, используя олигонуклеотидный праймеры, последовательности которых подобраны на основании нуклеотидной последовательности генов, опубликованных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Поиск мутаций в генах проведен методом автоматического секвенирования фрагментов ДНК согласно протоколу фирмы производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Статистическая обработка результатов исследований Оценка статистической значимости результатов проведена с использованием методов параметрической и непараметрической статистики для множественных сравнений. Анализу данных предшествовала проверка распределений значений показателей на соответствие их критериям «нормальности». В случае нормального распределения применен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA или ANOVA для повторных измерений, в противном случае – критерий Крускала-Уоллиса и/или критерий Ньюмана-Кейлса. Обработка результатов осуществлена с помощью программного обеспечения Excel 2000, Statistica 6.0 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Спектр и относительные частоты отдельных подклассов НБО В общей совокупности в лаборатории НБО проводится диагностика 157 различных форм заболеваний, что составляет около 30% от всех известных НБО. За период 2004-2009гг обследовано 9875 пациентов с подозрением на НБО, выявлено 48 различных нозологических форм из 10 различных подклассов НБО у 370 пациентов. Результаты проведенного анализа показали, что наиболее распространенными формами НБО в обследуемой выборке являются ЛБН (n=177 – 48%) и МБ (n=69 – 19%), которые в совокупности составляют более половины всех случаев (рис. 1). 14 Болезни, связанные с нарушением обмена аминокислот, органических кислот и дефектами митохондриального β-окисления составляют 2%, 7%, 4%, соответственно (в расчет не включены случаи фенилкетонурии). По данным зарубежных лабораторий относительные доли заболеваний этих классов более существенны, чем в нашей выборке, что указывает на необходимость совершенствования методов их диагностики. Рис 1. Относительные частоты отдельных подклассов НБО в исследуемой выборке. Примечание: МБ-митохондриальные болезни, ОА- органические ацидурии, ААаминоацидопатии, УГ-нарушения обмена углеводов, ЛБН-лизосомные болезни накопления, ПБ-пероксисомные болезни,в-окисление- дефекты митохондриального βокисления жирных кислот Анализ нозологической структуры наиболее представленных подклассов НБО Для оценки нозологической структуры группы ЛБН, проведен анализ 902 случаев ЛБН, которые были диагностированы в лаборатории с 1992 гг- 2009гг. За этот период было установлено 25 различных форм ЛБН. Проведенный анализ показывает, что самыми частыми являются мукополисахаридозы и липидозы (сфинголипидозы и ганглиозидозы), которые составляют существенную долю всех диагностированных случаев ЛБН. В группе 15 сфинголипидозов самой частой формой заболевания является болезнь Гоше (рис. 2). Сходная тенденция наблюдается и в других странах Европы – Чехии, Австралии и Германии. Для оценки нозологической структуры группы МБ, проведен анализ 176 случаев МБ, которые диагностированы в лаборатории с 2004 -2009гг. Выбранный временной интервал соответствует началу диагностики данных заболеваний в лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН. В группе МБ наиболее часто встречаются заболевания, связанные с мутациями мтДНК, среди них превалируют мутации, приводящие к синдрому Лебера (n=62). Рис. 2. Относительная частота нозологических форм в выборке больных с ЛБН Примечание: Б.Гоше- болезнь Гоше, МЛД- метахроматическая лейкодистрофия, МПСмукополисахаридоз, НЦЛ2- нейрональный цероидный липофусциноз тип 2, МЛII/IIIмуколипидоз II/III типа, Б.Краббе- болезнь Краббе В нашем исследовании было зарегистрировано большое число случаев (n=34), связанных с мутациями гена SURF1, что приводит к недостаточности цитохром с оксидазы (IV комплекса дыхательной цепи митохондрий). Мутации 16 этого гена являются причиной одной из частых форм МБ, дебютирующих в детском возрасте - синдрома Ли. Частота заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в России (Центральный федеральный округ) ЛБН - одна из наиболее многообразных и хорошо изученных групп НБО, которая включает более 45 различных нозологических форм. Подтверждающей лабораторной диагностикой ЛБН лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН занимается с 1982 года и является единственной в РФ лабораторией, осуществляющей точную диагностику большинства ЛБН. В лабораторию поступают образцы из всех регионов РФ, но в настоящем исследовании учтены только больные, проживающие в Центральном Федеральном округе (ЦФО), которым был установлен диагноз в лаборатории в период с 2000 по 2009гг (табл. 1). Это связанно с географической близостью к г. Москве и достаточно высоким уровнем медико-генетической помощи в данном регионе. Суммарная частота заболеваний группы ЛБН определена в разных странах Европы и составляет от 7,6 до 25 на 100 000 новорожденных (Meikle P.J. et al., 1999; Poorthuis B.J. et al., 1999; Applegarth D.A. et al., 2000; Dionisi-Vici С. et al., 2002; Pinto R. et al., 2004). В РФ подобные исследования не проводились. Проведенный анализ показывает, что суммарная частота ЛБН в РФ (ЦФО) составляет 5,22 : 100 000 новорожденных (1:19937), в других странах Европы значение примерно в 2-3 раза выше, однако следует учитывать, что все эти заболевания чрезвычайно редкие и случайная вариация в оценке их частоты очень высока, что отражает минимальное и максимальное пороговое значение при 95% доверительном интервале а также различные подходы к расчету. Наибольшая частота показана для следующих нозологических форм: болезнь Гоше -0,93 (95% ДИ 0,790-1,070), МПС I типа - 0,82 (95% ДИ 0,5521,089), МПС II типа -0,74 (95% ДИ 0,478-1,075), GM1-ганглиозидоз -0,58 (95% ДИ 0,117-1,052). Следует отметить, что в отличие от других стран в РФ диагностированы лишь единичные случаи болезни Ниманна-Пика тип С (n=3), болезни Помпе (n=5), что в совокупности также влияет на общую частоту ЛБН. В группе МПС наблюдается меньшее число случаев МПС III типа, по сравнению с другими странами. 17 Таблица 1. Частота некоторых форм ЛБН на 100 000 новорожденных. РФ (ЦФО) Чехия Германия Австралия Нидерланды МПС I 0,82 0,72 0,69 1,14 1,19 МПС II 0,74 0,83 0,64 0,74 0,67 МПС III 0,37 0,91 1,57 1,42 0,89 МПС IVA 0,030 0,71 - 0,59 0,22 МПС VI 0,15 0,05 0,23 0,43 0,15 МСН 0,030 0,26 - 0,07 0,05 МПС (общее) 2,11 3,72 3,53 4,44 4,5 Болезнь Гоше 0,93 1,13 - 1,75 1,16 GM1ганглиозидоз 0,58 0,26 - 0,26 0,41 МЛД 0,36 0,69 - 1,09 1,42 Болезнь Краббе 0,25 0,4 - 0,71 1,35 Сфинголипидозы 2,57 5,0 - 6,6 6,2 ЛБН (общее) 5,22 12,25 - 12,9 14,0 Заболевание Оптимизация программ биохимического скрининга на НБО За последние годы произошли существенные методические и технические изменения в области биохимического селективного и массового скрининга на НБО. Методические рекомендации по выявлению НБО с помощью простых качественных и полуколичественных тестов, изданные в 1984 году, не обновлялись, приведенные в рекомендациях тесты имеют высокий процент ложноположительных результатов и, в совокупности обеспечивают предположительное выявление около 20 форм НБО. На необходимость совершенствования методов диагностики трех групп заболеваний, относящихся к нарушениям обмена аминокислот, органических кислот и дефектов митохондриального β-окисления указывает их низкий удельный вес в общей структуре НБО, что было показано в нашем исследовании. Одной из современных широко применяемых технологий для массового и селективного скрининга на НБО является МС/МС, которая включает 18 определение концентрации аминокислот и ацилкарнитинов с целью выявления нарушений обмена аминокислот, органических кислот и дефектов митохондриального β-окисления (всего более 100 различных нозологических форм). Для внедрения технологии МС/МС для обследования на НБО определены референсные значения метаболитов и их соотношения в 3 возрастных группах: новорожденные, дети в возрасте от 8 дней до 6 мес. и в возрасте от 6 мес. до 5 лет. Выбор групп обусловлен тем, что именно в этих возрастных периодах по данным литературы дебютирует большинство выявляемых этим методом заболеваний. Для определения референсных значений метаболитов проведено исследование 3572 образцов пятен высушенной крови. Оценка межгрупповых различий с использованием непараметрического критерия Ньюмана-Кейлса показала, что по многим исследуемым метаболитам новорожденные и дети других возрастных групп достоверно отличаются друг от друга (р<0,01), что говорит о необходимости применения своих референсных значений для каждой возрастной группы. В качестве возрастных референсных границ предложено использовать значения концентраций метаболитов, соответствующие 0,5% (Q0,5) и 99,5% (Q99,5) персентилям. В литературе данные для разных возрастных групп не приводится, поскольку МС/МС применяется в основном для массового скрининга новорожденных. Полученные результаты по концентрации метаболитов у новорожденных согласуются с данными литературы. Выявленные после проведения МС/МС отклонения в концентрации метаболитов, в подавляющем большинстве случаев требуют проведения подтверждающей диагностики. Для каждого заболевания были составлены дифференциально-диагностические таблицы, которые включали определение органических кислот мочи методом, исследование активности ферментов и ДНК-диагностику (табл. 2). Таблица 2. Дифференциальная диагностика органических ацидурий и аминоацидопатий (фрагмент таблицы). Заболевание (основной маркер при МС/МС анализе) Глутаровая Др. маркеры (МС/МС анализ) С5DC/С5ОН, Дифф. Дополнительное диагностика исследование ГА2 ОКМ Основные биохимические маркеры Глутаровая кислота 19 Заболевание Др. (основной маркеры маркер при (МС/МС МС/МС анализ) анализе) ацидемия тип 1 С5DC/С8, (С5DC) С5DC/С16 Изовалериановая C5/C0 ацидурия (C5) C5/C2 C5/C3 Недостаточность C5/C0 2-метилC5/C2 бутирил-КоА C5/C3 дегидрогеназы (С5) Тирозинемия Met, тип 1( Tyr) Tyr/Cit Метилмалоновая C3/C2 ацидурия C3/C16 (С3) C3/Met Дифф. Дополнительное диагностика исследование 2МБД ОКМ ИВА ОКМ Заболевания печени ПА Аминокислоты плазмы, ОКМ ОКМ Недостаточность биотинидазы ( С5ОН) С3, С5ОН/С8 НСГ, 3МКК, 3МГГ, БКТ, 3Г3МГ Активность биотинидазы ОКМ Недостаточность орнитин транскарбамилазы (Cit) нет АГС, КФС, у недоношенных детей ОКМ Основные биохимические маркеры изовалерилглицин, 3-ОН-изовалериановая кислота 2метилбутирилглицин Сукцинилацетон Метилмалоновая, 3ОН- изовалериановая 3-ОН-пропионовая кислоты, тиглилглицин метилцитрат 3-ОНизовалериановая 3ОН-пропионовая кислоты, тиглилглицин, метилцитрат, лактат, 3метилкротонилглицин оротовая кислота Примечание: 2МБД- недостаточность 2-метил-бутирил-КоА дегидрогеназы, 3Г3МГНедостаточность 3-гидрокси-3-метил-глутарил-КоА-лиазы,3МГГ- Недостаточность 3метилглутаконил-КоА-гидратазы, 3МКК- Недостаточность 3-метилкротонил-КоАкарбоксилазы, АГСнедостаточность N-ацетилглютамат-синтазы,БКТНедостаточность β-кетотиолазы, ГА2-глутаровая ацидурия тип 2,ИВАизовалериановая ацидурия, КФС- Недостаточность карбамилфосфат синтазы, НСГнедостаточность синтетазы голокарбоксилаз, ОКМ –органические кислоты мочи ОТК- Недостаточность орнитин транскарбамилазы, ПА- пропионовая ацидурия. 20 Разработка биохимических методов подтверждающей диагностики НБО С целью повышения эффективности диагностики 4 редких форм НБО для которых существует один наиболее значимый дополнительный биохимический маркер (табл.2), разработаны высокочувствительные микрометоды определения некоторых органических кислот методом ВЭЖХ-МС/МС. Для дифференциальной диагностики тирозинемии тип 1 разработан метод определения сукцинилацетона в моче, который сохраняет линейность в пределах от 0,5 до 1200 мM/л (0,1 – 360 мM/М креатинина), предел обнаружения составил 0,25 мM/л (0,05 мM/М креатинина). Концентрация сукцинилацетона в моче в контрольной выборке (n=102) варьировала от 0 до 1,2 мM/M креатинина, в то время как, у больных тирозинемией тип 1 (n=8) концентрация сукцинилацетона составила от 20 до 254 мM/M креатинина. Данный тест можно применять для контроля лечения тирозинемии тип 1. Для дифференциальной диагностики дефектов цикла мочевины разработан метод определения оротовой кислоты в моче, который сохраняет линейность в пределах от 1 до 1000 мМ/М креатинина, предел обнаружения 0,1 мМ/М креатинина. Концентрация оротовой кислоты в контрольных образцах мочи составляла от 1 до 6 мМ/М креатинина (n=47), в моче пациентов с недостаточностью орнитинтранскарбамилазы – 560 и 1090 мМ/М креатинина. Для диагностики глутаровой ацидурии тип 1 разработан метод определения глутаровой кислоты в моче, метод сохраняет линейность в пределах от 4 до 4000 мМ/М креатинина, предел обнаружения 1 мМ/М креатинина. Концентрация глутаровой кислоты в контрольных образцах мочи составляла 10 - 130 мМ/М креатинина (n=47), в моче пациентов с глутаровой ацидурией тип 1 850 -2060 мМ/М креатинина (n=12). Уникальность разработанных методов состоит в том, что они позволяют определять концентрацию вышеуказанных метаболитов в пятнах высушенной мочи, существенно сокращают временные затраты на пробоподготовку и проведение анализа. Анализ соотношений метаболитов позволил определить новые диагностические значимые параметры для недостаточности длинноцепочечной 21 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы (ДЦГАД) и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы (СЦАД), (С18ОН+С18:1ОН+С16ОН)/С0 и (С6+С8+С10:1)/(С16+С18+С18:1) соответственно, применение которых повышает чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность метода МС/МС для диагностики этих заболеваний. Показано, что данные соотношения особенно важны при низких концентрациях свободного карнитина в крови, что нередко наблюдается у пациентов с данными заболеваниями. Одним из важнейших маркеров пероксисомных болезней (ПБ) является уровень ОДЦЖК в плазме крови или мембранах эритроцитов, который не является возраст-зависимым параметром в отличие от уровня плазмалогенов и фитановой кислоты. При диагностике определяются количества докозановой (С22), тетракозановой (С24), гексакозановой кислот (С26), а также соотношения С24/С22 и С26/С22 (Aubourg Р.А., 1985). Проведено исследование концентрации ОДЦЖК у пациентов с перокисомными заболеваниями методом ГХ-МС. Наблюдаются статистически достоверные (р< 0.05) различия между средними значениями отношения концентраций С26/С22 в контрольной группе и группах больных с разным фенотипом Х-АЛД и НБП (табл. 3). При этом не выявлены статистически значимые различия в средних значениях отношений концентраций С 26/С22 между группами пациентов с различным фенотипом Х-АЛД (церебральная форма, адреномиелоневропатия, изолированная надпочечниковая недостаточность). Таблица 3. Показатели метаболизма ОДЦЖК в норме и при пероксисомных болезнях Группы обследованных Контроль: Собственные данные(n=114) Moser H.W.,1999 (n=6875) Х-АЛД: Собственные данные (n=62) Moser H.W.,1999 (n=372) Биохимические показатели С26, нмоль/мл С24/С22 С26/С22 (М ± SD) (М ± SD) (М ± SD) 1,10 ± 0,53 0,87 ± 0,42 0,76 ± 0,12 0,73 ± 0,16 0,021 ± 0,008 0,006 ± 0,008 3,56 ± 1,29 3,06 ± 1,06 1.42 ± 0,18 1,43 ± 0,37 0,077 ± 0,039 0,020 ± 0,01 22 Группы обследованных НБП Собственные данные (n=10) Биохимические показатели С26, нмоль/мл С24/С22 С26/С22 (М ± SD) (М ± SD) (М ± SD) 5,45± 3,37 1,71± 0,61 0,34± 0,22 Оптимизация подтверждающих молекулярно-генетических методов диагностики НБО Для большинства НБО в качестве основных подтверждающих тестов применяются биохимические, но для некоторых заболеваний требуется проведение ДНК-диагностики. Данные исследования особенно актуальны в тех случаях, когда семья планирует проведение пренатальной диагностики. С целью совершенствования программ подтверждающей диагностики проведен анализ 37 редких форм НБО, относящихся к разным подклассам: аминоацидопатии (n=7), органические ацидурии (n=4), нарушения углеводного обмена (n=4), МБ (n=5), дефекты митохондриального β-окисления (n=4), ЛБН (n=5), другие НБО (n=5). Для 14 разных форм НБО определены частоты наиболее распространенных по данным литературы мутаций в рамках данного исследования (табл.4). Таблица 4. Частые мутации при 14 формах НБО Заболевания (ген) Число Частые мутации у пациентов из РФ пациентов (% мутантных аллелей) Синдром Ли (SURF1) 27 с.311_321del10insAT (6%),с.845delCT (65%) Атрофия зрительных нервов Лебера (мтДНК) 62 G11778А (77,3%), G3460А (15,9%) T14484C (6,8%) Лейкоэнцефалопатия с поражением ствола, мозжечка и высоким уровнем лактата при МРспектроскопии (DARS2) 30 с.228-20_21delTTinsC (46,7%) с.492+2T>C (25%) с.455G>T (15%) Синдром Альперса (POLG) 24 Ala467Thr (25%),Gly848Ser (42%) Gly268Ala (25%) Галактоземия тип 1(GALT) 25 Gln188Arg (57%),Lys285Asn (15%) Тирозинемия тип 1 (FAH) 12 Pro342Leu (25%),Arg174Term (8%),IVS 23 Заболевания Число Частые мутации у пациентов из РФ (ген) пациентов (% мутантных аллелей) 12+5 G->A (21%), IVS6-1 G->T (21%) Глутаровая ацидурия тип 1(GCDH) 21 Arg 402Trp (50%) Недостаточность биотинидазы (BD) 21 G98d7i ns3 (85%) Недостаточность ТФБ (HADHA) 12 Glu474Gln (83%) Гликогеноз тип 1а(G6PC) 10 Arg83Cys (30%) Гликогеноз тип 1b(G6PT) 12 1042delC (75%) Болезнь Баллера тип 2 (ABCB11) 10 Asp482Gly (33%) Болезнь Краббе (GALC) 20 Del ~30 000 (37%),Ile177Thr (22%) Алькаптонурия (HGD) 12 Gly161Arg (50%) Тестирование на данные мутации является высокоинформативным. Были разработаны простые ДНК-тесты (ПЦР-ПДРФ-анализ, SSCP-анализ) для выявления 23 из 26 мутаций. Для диагностики галактоземии тип 1 был создан биочип, который позволяет определять несколько мутаций и полиморфизмов в гене GALT: Phe95Leu, IVS3-2A->C, IVS4-27 G->C, Met142Lys, Met142Val, Gln188Arg, Lys285Asn, Trp316Term, Asn314Asp, Arg333Trp, Arg333Gln, Arg333Gly, Glu352Gln, Leu358Pro, одновременно, характеризуется низкой себестоимостью, малым временем получения результата. Для диагностики тирозинемии разработан биочип, позволяющий выявлять следующие мутации в гене FAH: Pro342Leu, Arg174Term, IVS 12+5 G->A, IVS6-1 G->T, IVS7-1 G->А. В целом, данные по частотам наиболее распространенных мутаций сходны с другими странами Европы, из выявленных особенностей следует отметить превалирование мутации с.845delCT у пациентов с синдромом Ли в нашей выборке по сравнению с данными других стран. В ходе работы при болезни Краббе в 22% аллелей выявлена не описанная ранее мутация р.Ile177Thr. Эта мутация затрагивает эволюционно-консервативную область белка. В результате исследования 200 контрольных образцов эта мутация не была обнаружена. Эти данные являются убедительными доказательствами ее патогенности. Высокая частота данного аллеля, вероятно, является особенностью российской популяции. Мутация р.Ile177Thr в сочетании с любым другим аллелем приводит к формированию поздней младенческой формы болезни (Zakharova E., 2008). 24 Селективный скрининг на НБО С целью определения вклада трех групп НБО, относящихся к нарушениям обмена аминокислот, органических кислот и дефектов митохондриального βокисления в структуру психоневрологических заболеваний у детей, с января 2004 по октябрь 2011 года обследовано 5205 пациентов в возрасте от 8 дней до 5 лет из отделений психоневрологии различных детских стационаров и специализированных клиник Российской Федерации. После проведения МС/МС и дополнительных исследований, которые включали определение концентрации ацилкарнитинов в плазме крови, определение органических кислот мочи методом ГХ-МС и ДНК-диагностики, диагноз НБО подтвержден у 119 пациентов (2,3%), из них аминоацидопатии выявлены у 39 пациентов, органические ацидурии – у 62, дефектами митохондриального β-окисления – у 18. Выявлено 15 пациентов с фенилкетонурией (ФКУ) из разных регионов РФ, который были пропущены при проведении массового скрининга новорожденных. Наиболее частыми формами НБО были недостаточность биотинидазы (n= 24 из 22 семей) и глутаровая ацидурия тип 1 (n=16 из 15 семей), болезнь с запахом кленового сиропа мочи (n=10 из 8 семей), недостаточность митохондриального трифункционального белка (n=12), что указывает на необходимость селективного скрининга на эти заболевания среди данного контингента больных. Проведенный анализ клинических проявлений, данных лабораторных исследований 119 пациентов позволяют сделать вывод, что в подавляющем большинстве случаев заболевания из данных групп манифестируют остро (85%), у 75% выявляют нарушения в кислотно-щелочном состоянии крови. Многие пациенты (64%) в дополнение к неврологической симптоматике имеют изменения в биохимическом и общем анализе крови (анемию, повышение активности печеночных трансаминаз и изменение уровня глюкозы). Хроническим характером течения без острых эпизодов декомпенсации наблюдался у всех пациентов с ФКУ и 4-х пациентов с изовалериановой ацидурией. На основании полученных результатов сформулированы рекомендации по проведению селективного скрининга на НБО среди пациентов отделений психоневрологического профиля. 25 Неонатальный скрининг на галактоземию В процедуру подтверждающей диагностики галактоземии нами было включено определения активности фермента Г-1-ФУТ в пятнах высушенной крови и в цельной крови, а также ДНК-диагностика с целью выявления наиболее распространенных мутаций в гене GALT и полиморфного варианта Дуарте, приводящего к снижению активности фермента. На первом этапе работы определена активность фермента Г-1-ФУТ в пятнах высушенной крови и цельной гепаринизированной крови в контроле (n=166), у пациентов с классической галактоземией (n=15) и у гетерозиготных носителей (n=65) (рис. 3). Рис.3 Активность галактозо-1-фосфат уридилтрансферазы в контроле, у гетерозиготных носителей заболевания и пациентов с галактоземией тип 1. Оценка межгрупповых различий с использованием непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Ньюмана-Кейлса показала, что активность Г-1ФУТ, измеренная в цельной крови, достоверно различается в сравниваемых группах. Для определения отрезной точки использован метод ROC-анализа. Из данных ROC-анализа следует, что оптимальной отрезной точкой (cut- 26 offопт=max(Sek+Spk)), обеспечивающей максимум чувствительности и специфичности метода для пятен крови, является точка, соответствующая активности Г-1-ФУТ < 2,5 Е/гHb (чувствительность – 100%, специфичность – 92%). Оптимальной отрезной точкой для цельной крови является точка, соответствующая активности Г-1-ФУТ < 1,3 Е/гHb (чувствительность – 100%, специфичность – 100%). Из данных ROC-анализа следует, что для подтверждающей диагностики классической галактоземии оптимальным является определение активности Г-1-ФУТ в цельной крови, так как данный метод является более чувствительным и специфичным, по сравнению с определением Г-1-ФУТ в высушенных пятнах крови. С целью применения ДНК-диагностики в качестве одного из подтверждающих тестов проведен анализ частоты и спектра мутаций у 43 пациентов с галактоземией тип 1 из европейской части России. В результате работы определено 77 мутантных аллелей, что составляет 89,5%. 4 мутации не удалось обнаружить из-за отсутствия достаточного количества биологического материала пациентов. Мутация р.Gln188Arg (Q188R) является наиболее распространенной среди российских пациентов с галактоземией тип I. Две ранее не описанные мутации p.Glu352Gln (E352Q) и p.Leu358Pro (L358P) обнаружены у трех пациентов из исследуемой выборки: у двух в сочетании с мутацией Q188R (E352Q/Q188R и L358P/Q188R) и у одного в сочетании друг с другом (E352Q/ L358P). Среди редких мутаций, обнаруженных у пациентов, пять уже были описаны ранее (IVS3+2a->g, p.Phe95Leu, p.Met142Lys, p.Trp316Term, p.Arg333Trp), а две описаны впервые (p. Leu 264 Pro, p.Tyr286Term). Подтверждающая диагностика галактоземии тип 1 должна включать как определение активности фермента, так и скрининг на наиболее частые мутации и вариант Дуарте. Исходя из полученных данных на первом этапе наиболее целесообразно проведение ДНК-диагностики следующих мутаций в гене GALT: р.Gln188Arg, p.Lys285Asn, IVS3-2a->c, p.Met142Lys, p.Leu358Pro, составляющие в совокупности 82,1% мутантных аллелей и p.Asn314Asp (N314D, вариант Дуарте). На основании полученных данных, предлагается следующий алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 (рис. 4). 27 Повышение тотальной галактозы на неонатальном скрининге Определение активности Г-1ФУТ, тест на частые мутации в гене GALT, вариант Дуарте Активность Г-1-ФУТ ниже отрезной точки Две частые мутации 1частая мутация Активность Г-1-ФУТ выше отрезной точки Нет частых мутаций 1 частая мутация Нет частых мутаций Полный анализ гена Найдены две мутации Классическая галактоземия подтверждена Найдена одна мутация Гетерозиготное носительство галактоземии, вариант Дуарте, вариант Дуарте/галактоземия Классическая галактоземия исключена Рис. 4. Алгоритм подтверждающей диагностики галатоземии тип 1 Применение алгоритма подтверждающей диагностики для массового скрининга Данный раздел работы проводился совместно с Московским центром неонатального скрининга. За период с ноября 2006 по декабрь 2008 года в г.Москве обследовано 216938 новорожденных на галактоземию. После 28 определения концентрации тотальной галактозы было выявлено 127 новорожденных с положительными результатами ретеста. В 98 случаях активность Г-1-ФУТ оказалась выше отрезной точки, таким образом, диагноз галактоземии тип 1 был исключен. Из них при ДНК-тестировании на частые мутации выявлено 15 случаев с генотипом галактоземия/Дуарте (G/D) и 12 случаев с генотипом галактоземия/нормальный аллель (G/N). Диагноз галактоземии подтвержден в 4 случаях. У одного пациента определение активности фермента не проводилось, и диагноз галактоземии подтвержден методами ДНК анализа (генотип Q188R/Q188R). У 3 других пациентов выявлена низкая активность фермента (0,54; 0,20 и 0,04 Е/гHb) и установлены генотипы (Q188R/L358P; Q188R/Q188R и Q188R/Q188R, соответственно). Результаты представлены в таблице 5. Таблица 5. Результаты скрининга на галактоземию в г.Москве Всего проскринировано новорожденных в г.Москве 216938 Положительный ретест 127 Пришло на подтверждающую диагностику 113 Диагноз классическая галактоземия подтвержден 4 Диагноз классическая галактоземия исключен 70 Выявлено гетерозиготное носительство заболевания 10 Выявлен генотип Дуарте/галактоземия 26 Проведен полный анализ гена GALT(активность Г-1-ФУТ ниже отрезной точки, при ДНК-тестировании не выявлено частых мутаций), диагноз классическая галактоземия исключен 3 В оставшихся 11 случаях активность Г-1-ФУТ оказалась ниже отрезной точки, из них, при ДНК-тестировании на частые мутации в 8 случаях выявлена одна частая мутация, в 3 случаях частых мутаций не идентифицировано. При проведении секвенирования других изменений в гене не выявлено. Таким образом, диагноз классической галактоземии подтвержден не был. Всего при проведении ДНК-диагностики выявлено 26 случаев с генотипом G/D, 10 случаев с генотипом G/N и 6 случаев с генотипом D/D (средняя 29 активность Г-1-ФУТ в цельной крови 1,85 + 0,55; 3,55 + 0,77 и 3,78 + 1,45 Е/гHb, соответственно). Также с помощью критерия Ньюмана-Кейлса проведена оценка межгрупповых различий (группы разделялись по генотипу) по уровню тотальной галактозы, полученной при скрининге, и по активности Г-1-ФУТ, измеренной при подтверждающей диагностике. На основании полученных данных установлено, что по уровню тотальной галактозы достоверно отличается от других групп только группа новорожденных с генотипом галактоземия/галактоземия (G/G), остальные группы не имеют статистически достоверных различий. По активности Г-1-ФУТ все группы достоверно различаются между собой, за исключением групп G/N и D/D, которые не имеют статистически достоверных различий между собой. Высокая частота встречаемости генотипа G/D среди новорожденных с повышенным уровнем галактозы, а также статистически достоверные отличия пациентов с этим генотипом по активности Г-1-ФУТ, свидетельствует о влиянии данного генотипа на метаболизм галактозы и на активность Г-1-ФУТ. Концентрация тотальной галактозы в крови у новорожденных с установленным генотипом. При проведении неонатального скрининга в Российской Федерации принят пороговый уровень галактозы в сухих пятнах крови 7,2 мг/дл. Исследование, проведенное в рамках программы массового скрининга в г.Москве показывает, что на подтверждающую диагностику галактоземии поступает большое число пациентов (31,8%), у которых выявляют либо гетерозиготное носительство мутантного аллеля (8,8%) или вариант галактоземии-Дуарте (23%). При этом пациенты, имеющие данные генотипы, не нуждаются в назначении диеты, а семья подвергается необоснованному стрессу. В табл. 6 приведены среднее значение и стандартное отклонение для 6 групп: пациентов с классической галактоземией (G/G), галактоземией Дуарте (G/D), носителей мутантного аллеля галактоземии (G/N), носителей (D/N) и гомозигот по варианту Дуарте (D/D) и новорожденных у которых не было выявлено изменений в гене GALT и был нормальный уровень фермента, но уровень галактозы был выше отрезной точки (N/N). 30 Таблица 6. Средние значения уровня галактозы у пациентов положительными результатами скрининга на галактоземию Генотип Число обследованных G/G 25 Ср.зн. уровня галактозы (мг/дл) 69,30 G/D 47 9,84 5,35 1,53 G/N 30 10,92 4,87 1,74 D/D 10 11,20 3,23 2,00 D/N 24 12,29 11,32 4,53 N/N 37 9,71 1,95 0,63 Стандартное отклонение Доверительный интервал среднего 19,3 7,5 с Проведенный ROC-анализ показывает, что отрезная точка, соответствующая максимальной чувствительности и специфичности относится к уровню галактозы– 20-25 мг/дл. Повышение отрезной точки при проведении ретеста до концентрации 20 мг/дл позволяет увеличить положительную прогностическую ценность (ППЦ) до 78%, специфичность до 95% (табл. 7). Таблица 7. Чувствительность, специфичность и положительная прогностическая ценность уровня тотальной галактозы у новорожденных. Концентрация галактозы мг/дл ≤ 10 ИО ЛО ИП ЛП Чув-ть (%) Сп-ть (%) ППЦ (%) 80 0 25 68 100 54 27 ≤15 125 0 25 23 100 84 52 ≤ 20 141 0 25 7 100 95 78 ≤ 25 142 0 25 6 100 96 81 ≤ 30 146 1 24 2 96 99 96 ≤ 35 147 1 24 1 96 99 96 ≤40 147 2 23 1 92 99 96 Примечание: ИО – истинноотрицательные, ЛО – ложноотрицательные, ИП – истинноположительные, ЛП – ложноположительные, ППЦ – положительная прогностическая ценность. 31 Таким образом, на основании проведенного анализа по определению уровня галактозы, в образцах, полученных в центре неонатального скрининга г. Москвы, а также результатов обследования больных с галактоземией из других регионов Российской Федерации, можно сделать заключение о необходимости изменения порогового значения уровня галактозы при проведении неонатального скрининга до более высоких цифр. Однако для установления более точного значения отрезной точки необходимо проведения обобщенного анализа результатов массового скрининга на галактоземию во всех регионах РФ. Заключение Основной целью настоящей работы являлись изучение относительных частот и спектра семи групп наследственных болезней обмена веществ, а также оптимизация методов их биохимической и молекулярно-генетической диагностики для усовершенствования программ массового и селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ. В исследовании обобщен многолетний опыт работы лаборатории наследственных болезней обмена веществ ФГБУ «МГНЦ» РАМН, проведен анализ относительных частот отдельных подклассов НБО на репрезентативной выборке пациентов и определены частоты отдельных нозологических форм из подкласса ЛБН на основании учета числа новых случаев заболевания за 10-летний период. С целью совершенствования уже существующих программ массового скрининга в ходе исследования разработан алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1, который позволяет снизить число ложноположительных результатов при проведении тестирования. Проведенный селективный скрининг на НБО методом тандемной массспектрометрии в отделениях психоневрологии позволил определить вклад этих групп болезней в общую структуру патологии нервной системы у детей раннего возраста, доказана необходимость обследований пациентов на эти заболевания, учитывая, что некоторые из них поддаются эффективному лечению. В ходе селективного скрининга диагноз НБО подтвержден у 119 пациентов, 5 нозологических форм впервые диагностированы в практике отечественной медицины. 32 В работе изучена частота наиболее распространенных мутаций при 14 формах НБО и разработаны простые ДНК-тесты для их выявления. В ближайшем будущем следует ожидать расширения программ массового тестирования на наследственные болезни обмена веществ, что невозможно проводить без создания протоколов и алгоритмов подтверждающей диагностики. Полученные результаты создают базу для оптимизации программ селективного и массового скрининга на эти заболевания. ВЫВОДЫ 1. Определены спектр и относительные частоты 7 групп НБО в выборке российских больных (n=370) за период 2004-2009гг. Наиболее представленными группами в выборке больных, обследованных в МГНЦ РАМН, являются лизосомные болезни накопления (48%) и митохондриальные заболевания (18%). Число пациентов с нарушениями межуточного метаболизма – аминоацидопатиями (без ФКУ), органическими ацидуриями и дефектами митохондриального β-окисления - значительно ниже, и составляет 2%, 7% и 4%, соответственно. 2. Определены спектр и относительные частоты отдельных форм болезней в группе лизосомных болезней накопления и митохондриальных болезней. Наиболее частыми в группе лизосомных болезней накопления (n= 902) являются мукополисахаридозы (42,1%) и липидозы (35%), среди нозологических форм преобладает болезнь Гоше (25%). Наиболее частыми нозологическими формами в группе митохондриальных болезней (n=176) являются атрофия зрительных нервов Лебера (35%), и синдром Ли (20%). 3. Частота новых случаев заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в европейской части России (Центральный федеральный округ) составила 5,22 на 100 000 новорожденных (1:19937), заболеваемость в расчете на 100 000 новорожденных составила: мукополисахаридоз тип I - 0,82 (95% ДИ 0,552-1,089), мукополисахаридоз тип II -0,74 (95% ДИ 0,478-1,075), болезнь Гоше -0,93 (95% ДИ 0,790-1,070), GM1-ганглиозидоз -0,58 (95% ДИ 0,117-1,052). 4. Для биохимических программ селективного скрининга на НБО методом тандемной масс-спектрометрии определены референсные значения 20 33 аминокислот и 32 ацилкарнитинов в крови в трех возрастных группах. Определены новые диагностически значимые соотношения параметров для недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы, (С18ОН+С18:1ОН+С16ОН)/С0 и (С6+С8+С10:1)/(С16+С18+С18:1) соответственно, применение которых повышает чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность метода тандемной масс-спектрометрии для диагностики этих заболеваний. 5. Разработаны биохимические тесты для диагностики пероксисомных болезней, микрометоды определения глутаровой, оротовой кислот и сукцинилацетона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии. 6. Для 14 разных форм НБО показано наличие мажорных мутаций, что позволяет применять простые методы ДНК-анализа (ПЦР-ПДРФ-анализ, SSCPанализ) на первом этапе подтверждающей диагностики этих заболеваний. 7. Для диагностики галактоземии тип 1 был создан биочип, который позволяет определять 14 мутаций и полиморфизмов в гене GALT, для диагностики тирозинемии тип 1 - биочип, позволяющий выявлять 5 мутаций в гене FAH. 8. При селективном скрининге 5205 пациентов детских психоневрологических отделений в возрасте 8 дней - 5лет на НБО методом тандемной масс-спектрометрии выявлено 119 больных (2,3%), из них с аминоацидопатиями – 39 (33%), с органическими ацидуриями – 62 (52%), с дефектами митохондриального β-окисления – 18 (15%). 9. Для массового скрининга новорожденных создан алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1, включающий определение активности фермента и молекулярно-генетический анализ. Определены оптимальные отрезные точки активности Г-1-ФУТ для пятен крови, < 2,5 Е/гHb (чувствительность – 100%, специфичность – 92%), для цельной крови < 1,3 Е/гHb (чувствительность – 100%, специфичность – 100%), охарактеризован спектр мутаций у российских пациентов с галактоземией тип 1, показано преобладание мутаций Q188R (57%), K285N (15%) . 34 10. Проведенный анализ уровня тотальной галактозы у пациентов с классической галактоземией, галактоземией-Дуарте и вариантом Дуарте-Дуарте показал, необходимость изменения отрезной точки тотальной галактозы для снижения числа ложноположительных результатов тестирования при проведении неонатального скрининга в популяциях РФ. Практические рекомендации 1. Для рационального планирования сети региональных и федеральных центров по диагностике и лечению НБО необходимо внедрение в практическое здравоохранение системы регистрации новых случаев заболеваний, выявленных при проведении массового и селективного скрининга. 2. Для повышения эффективности неонатального скрининга на галактоземию целесообразно внедрить в практическое здравоохранение разработанный в ходе исследования алгоритм проведения скрининга и подтверждающей диагностики с учетом биохимических и молекулярногенетических данных. 3. На основе полученных данных рекомендуется провести определение уровней пороговых концентраций галактозы в выборке больных из всех регионов России для коррекции отрезной точки, что позволит уменьшить количество детей, нуждающихся в подтверждающей диагностике и будет способствовать снижению экономических затрат на проведение неонатального скрининга на галактоземию. 4. Рекомендуется проведение селективного скрининга на НБО больных детских психо-неврологических стационаров методом тандемной массспектрометирии. 5. Для первого этапа лабораторной диагностики пероксисомных болезней рекомендуется определение уровня ОДЦЖК, что позволяет дифференцировать данные заболевания от других наследственных дегенеративных болезней со сходной клинической картиной 6. При 14 НБО (синдром Ли, атрофия зрительных нервов Лебера, синдром Альперса, галактоземия тип 1, тирозинемия тип 1, глутаровая ацидурия тип 1, недостаточность биотинидазы, недостаточность трифункционального 35 белка , гликогеноз тип 1а, гликогеноз тип 1в, болезнь Баллера тип 2, болезнь Краббе, алькаптонурия, лейкоэнцефалопатия с поражением ствола и высоким уровнем лактата при МР-спектроскопии) рекомендуется тестирование на мажорные мутации. Данный метод обладает высокой диагностической значимостью и рекомендуется для первого этапа подтверждающей молекулярногенетической диагностики этих заболеваний. 7. Включить в стандарты подготовки врачей разных специальностей (генетиков, неврологов, педиатров) в учреждениях высшего и последипломного медицинского образования информацию о новых методах диагностики НБО. РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ. 1. Мальберг С.А, Маслова О.И., Шередярова Т.Ч., Захарова Е.Ю., Метященко Е.П., Сурсолова П. А. Синдром Кернс-Сейра // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С.Корсакова. 1997. Т. 97, №8. С. 53-57. 2. Краснопольская К.Д, Захарова Е.Ю., Современные достижения в диагностике и профилактике митохондриальных болезней // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 1998. №8. С.49-51, 3. Яхно Н.Н., Нечкина Н.П., Помытко Н.П., Усачева Е.Л., Захарова Е.Ю., Воскобоева Е.Ю., Покровская А.Я. Случай синдрома MELAS // Неврологический журнал. 1998. №5. С. 14- 20. 4. Краснопольская К.Д., Петрухин А.С., Захарова Е.Ю., Покровская А.Я., А.С.Петрухин. Клинический полиморфизм митохондриальных болезней при недостаточности цитохром С оксидазы // Неврологический журнал. 1999. №1. С. 11-16. 5. Краснопольская К.Д., Букина Т.М., Ахунов В.С., Евдокименков В.Н., Захарова Е.Ю., Покровская А.Я., Воскобоева Е.Ю., Шехтер О.В., Тишканина С.В., Мытникова Е.А., Погорелов А.Г. Программа диагностики и профилактики наследственных болезней обмена клеточных органелл // Вестник РАМН. 1999. №11. С. 16-22. 36 6. Яхно Н.Н., Краснопольская К.Д., Жученко Т.Д., Торопина Г.Г., Шварева И.С., Лавров А.Ю., Захарова Е.Ю., Голубева В.В., Ерпылова Р.М. Синдром MERRF (митохондриальная энцефаломиопатия с "рваными" красными волокнами) // Неврологический журнал. 2000. № 4. С.23-29. 7. Казанцева Л.З., Сухоруков В.С., Николаева Е.А., Захарова Е.Ю., Семячкина С.В., Тозлиян Е.В., Яблонская М.И Клинические проявления, диагностика и лечение митохондриальной миопатии с офтальмоплегией, обусловленной делецией митохондриальной ДНК // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2002. № 2. С. 22-26. 8. Захарова Е.Ю., Руденская Г.Е., Карлова И.З., Адарчева Л.С., Михайлова Е.Н.. Наследственная атрофия зрительных нервов Лебера: ДНК-диагностика и клинико-генетические сопоставления в 12 семьях // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 2003. № 7. С. 44-50. 9. Воскобоева Е.Ю., Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Диагностика наследственной галактоземии типа I // Медицинская генетика. 2003. Т. 2, № 10. С. 407-408. 10. Новиков П.В., Семячкина А.Н., Курбатов М.Б., Улас В.Ю., Захарова Е.Ю., Букина А.М. Ганглиозидоз II типа (Синдром Дерри) у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2003. № 6. С. 46-50. 11. Михайлова С.В., Захарова Е.Ю., Букина А.М., Ильина Е.С., Покровская А.Я., Федонюк И.Д., Бембеева Р.Ц., Петрухин А.С. «Случай лейкодистрофии Канавана Ван Богарта-Бертрана» // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2004. №4. С. 49-55. 12. Захарова Е.Ю., Михайлова С.В., Руденская Г.Е., Дадали Е.Л. Дифференциальная диагностика лейкодистрофий // Медицинская генетика. 2004. №10. С. 453-459. 13. Руденская Г.Е., Захарова Е.Ю., Адарчева Л.С., Михайлова Е.Н., Карлова И.З. Наследственная атрофия зрительных нервов Лебера: неврологические и другие внеглазные проявления // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С.Корсакова. 2004. № 2. С. 38-42. 14. Е. М. Орлова, А. М. Букина, Е. Ю. Захарова, Э. С. Кузнецова, В. А. Петеркова Критерии диагностики аутоиммунного полигландулярного синдрома 37 1-го типа // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2005. №5. С. 12-15. 15. Михайлова С.В., Петрухин А.С., Захарова Е.Ю., Дунаевская Г.Н., Букина Т.М., Холин А.А., Миронов М.Б. , Волкова Э.Ю. Случай поздне-инфантильной формы GM-2 ганглиозидоза // Неврологический журнал. 2005. №1. C. 22-27. 16. Михайлова С.В. , Ильина Е.С. , Захарова Е.Ю. , Байдакова Г.В. , Бембеева Р.Ц., Шехтер О.В., Захаров С.Ф. Множественная карбоксилазная недостаточность, обусловленная мутациями в гене биотинидазы // Медицинская генетика. 2005. №2. C. 633-638. 17. Байдакова Г.В., Букина А.М., Гончаров В.М., Шехтер О.В., Букина Т.М., Покровская А.Я., Захарова Е.Ю., Михайлова С.В., Федонюк И.Д., Колпакчи Л.М., Семыкина Л.И., Ильина Е.С. Диагностика наследственных болезней обмена веществ на основе сочетания методов тандемной масс-спектрометрии и энзимодиагностики // Медицинская генетика. 2005. №1. С.28-33. 18. Мазанкова Л.Н., Солониченко В.Г., Попова М.В., Куликова М.А., Котлукова Н.П., Захарова Е.Ю., Букина Т.М., Жарова Е.Л., Сорока С.Г. Трудности диагностики болезни Помпе у детей грудного возраста // Педиатрия. 2005. №6. С.89-92. 19. Михайлова С.В., Захарова Е.Ю., Петрухин А.С., Колпакчи Л.М., Букина Т. М., Ильина Е.С., Ахунов В.С. Дисмиелинизирующие заболевания нервной системы у детей. Болезнь Краббе. Три «маски» одной нозологической формы // Неврологический журнал. 2005. №5. С.13-17. 20. Повалко Н.Б., Захарова Е.Ю., РуденскаяГ.Е. Мутации мтДНК при атрофии зрительных нервов Лебера в российских семьях // Медицинская генетика. 2006. № 8. С. 24-29. 21. Захарова Е.Ю., Повалко Н.Б., Цыганкова П.Г. Особенности ДНКдиагностики болезней дыхательной цепи митохондрий // Медицинская генетика. 2006. № 10. С. 38-43. 22. Ломоносова Е.З.,.Руденская Г.Е, Шехтер О.В., Михайлова С.В., Галкина В.А., Захарова Е.Ю. Клинико-генеалогические, биохимические и молекулярногенетические характеристики Х-сцепленной адренолейкодистрофии // Медицинская генетика. 2006. № 6. С. 38-47. 38 23. Руденская Г.Е., Захарова Е.Ю., Букина А.М., Букина Т.М., Семыкин С.Ю. Нейролипидозы с поздним началом // Медицинская генетика. 2006. №10. С. 33-38 . 24. Николаева Е.А., Яблонская М.И., Барсукова П.Г., Захарова Е.Ю., Новикова И.М., Новиков П.В. Болезнь Лея, обусловленная мутацией гена SURF1: диагностика и подходы к терапевтической коррекции // Педиатрия. 2006. №2. С. 27-31. 25. Семячкина А.Н., Новиков П.В., Воскобоева Е.Ю., Захарова Е.Ю., Букина Т.М. Мукополисахаридозы у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2007. № 4. С.22-29. 26. Михайлова С.В., Захарова Е.Ю., Банин А.В., Волкова Г.И., Брюсова И.Б., Бобылова М.Ю., Рассказчикова И.В Байдакова Г.В., Петрухин А.С., Шехтер О.В., Ильина Е.С. Глутаровая ацидурия тип 1: клиника, диагностика и лечение // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 2007. № 10. С.4-12. 27. Захарова Е.Ю., Михайлова С.В., Шехтер О.В., Дадали Е.Л., Петрухин А.С., Повалко Н.Б. Нарушения биогенеза пероксисом // Медицинская генетика. 2008. №1. С. 4-7. 28. Захарова Е.Ю. Лечение лизосомных болезней накопления // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2008. Т.7, №4. С. 27-33. 29. Руденская Г.Е., Захарова Е.Ю., Букина Т.М., Волкова Э.Ю., Козлов А.С. Болезнь Нимана—Пика, тип С (ювенильный дистонический липидоз) // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 2008. № 5. С. 76-79. 30. Руденская Г.Е., Захарова Е.Ю. , Михайлова С.В. Наследственные болезни ЦНС: новое в диагностике и медико-генетическом консультировании // Медицинская генетика. 2008. № 11. С. 28-39. 31. Николаева Е.А., Шулякова И.В., Цыганкова П.Г., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Белоусова Е.Д. Симптоматическая эпилепсия как проявление дефицита ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот с очень длинной углеродной цепью // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2008. №.3. С. 87. 32. Серебреникова Т.Е., Фоминых Л.Д. Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Покровская А.Я., Сорокина Т.В., Кочкина Н.А., Случай острой формы 39 тирозинемии 1-го типа у новорожденного ребенка // Педиатрия. 2008. №4. С.148-150. 33. Воскобоева Е.Ю., Байдакова Г.В., Денисенков А.И., Денисенкова Е.В., Захарова Е.Ю. Галактоземия в России: молекулярно-генетические особенности, неонатальный скрининг, подтверждающая диагностика // Медицинская генетика. 2009. №6. С. 25-33. 34. Михайлова С.В., Захарова Е.Ю., Банин А.В., Демушкина А.А., Петрухин А.С.. Клинические проявления и молекулярно-генетическая диагностика лейкоэнцефалопатии с преимущественным поражением ствола мозга, спинного мозга и повышенным лактатом у детей // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2009. №9. С. 16-22. 35. Харламов Д.А., Сухоруков В.С., Захарова Е.Ю., Ильина Е.С., Михайлова С.В., Лузин А.В., Цыганкова П.Г., Балина Е.А. Подострая некротизирующая энцефаломиопатия // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2009. № 6. С.58-63. 36. Руденская Г.Е., Захарова Е.Ю., Карпин С.Л., Учаев Д.А. Миоклонусэпилепсия Лафоры. Описание наблюдения // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010. №3. С. 11-16. 37. Цыганкова П.Г., Михайлова С.В., Захарова Е.Ю., Пичкур Н.А., Ильина Е.С., Николаева Е.А., Руденская Г.Е., Дадали Е.Л., Колпакчи Л.М., Федонюк И.Д., Матющенко Г.Н. Синдром Ли, обусловленный мутациями в гене SURF1: клинические и молекулярно-генетические особенности // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010. №1. С. 25-32. 38. Семячкина А.Н., Воскобоева Е.Ю., Букина Т.М., Новикова И.М., Воинова В.Ю., Захарова Е.Ю., Новиков П.В. Множественная сульфатазная недостаточность у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2010. №3. С. 31-36. 39. Панкратова Е.В., Воскобоева Е.Ю., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю. Создание тест-системы для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1-антитрипсина // Медицинская генетика. 2010. №3. С. 34-42. 40. Панкратова Е.В., Степченко А.Г., Воскобоева Е.Ю., Захарова Е.Ю., Чудинов А.В., Георгиева С.Г. Создание тест-системы для определения мутаций в 40 гене галактозо-1-фосфат-уридил трансферазы, обуславливающих развитие галактоземии тип I // Медицинская генетика. 2010. №1. С. 22-28. 41. Руденская Г.Е., Захарова Е.Ю., Бессонова Л.А., Захарова О.М., Бобылова М.Ю., Федоров Е.С. Синдром Леша–Найхана: фенотипическое разнообразие и ДНК-диагностика // Медицинская генетика. 2010. №9. С.41-48. 42. Михайлова С.В., Захарова Е.Ю., Букина Т.М., Савин Д.А., Пилия С.В., Петрухин А.С., Болезнь Ниманна-Пика тип С. Клинические примеры // Педиатрическая фармакология. 2010. № 5. С. 48-53. 43. Г.Е. Руденская Т. М. Букина, Е. Ю. Захарова Болезнь Нимана-Пика, тип С: взрослая форма с преобладанием психических расстройств // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2011. №7. С.71-75. Методические рекомендации 44. Гинтер Е.К., Захарова Е.Ю., Воскобоева Е.Ю., Байдакова Г.В. «Галактоземия: неонатальный скрининг, диагностика и лечение» //N354-ПД.626, Методические рекомендации: Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации .2006. 18с. Патент 45. Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1-фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей № 2423521 от 27.10.2009. (Соавторы: Воскобоева Е.Ю., Панкратова Е.В., Степченко А.Г., Наседкина Т.В., Чудинов А. В., Георгиева С. Г.) Публикации в других изданиях и монографиях 46. Winchester B., Bali D., Bodamer O.A., Caillaud C., Christensen E., Cooper A., Cupler E., Deschauer M., Fumić K., Jackson M., Kishnani P., Lacerda L., Ledvinová J., Lugowska A., Lukacs Z., Maire I., Mandel H, Mengel E, Müller-Felber W, Piraud M, Reuser A, Rupar T, Sinigerska I, Szlago M, Verheijen F, van Diggelen OP, Wuyts B, Zakharova E, Keutzer J. Methods for a prompt and reliable laboratory diagnosis of 41 Pompe disease: report from an international consensus meeting // Mol Genet Metab. 2008. V 93. P.275-281. 47. Parvaneh N, Teimourian S, Jacomelli G, Badalzadeh M, Bertelli M, Zakharova E, Tabatabaei P, Parvaneh L, Pourakbari B, Yeganeh M, Tamizifar B, Mamishi S, Micheli V. Novel mutations of NP in two patients with purine nucleoside phosphorylase deficiency //Clin Biochem. 2008. V.41. P.350-352 48. Lavrov AY, Ilyna ES, Zakharova EY, Boukina AM, Tishkanina SV.The first three Russian cases of classical, late-infantile, neuronal ceroid lipofuscinosis //Eur J Paediatr Neurol. 2002. V.6. P.161-164. 49. Orlova EM, Bukina AM, Kuznetsova ES, Kareva MA, Zakharova EU, Autoimmune polyglandular syndrome type 1 in Russian patients: clinical variants and autoimmune regulator mutations //Horm Res Paediatr. 2010. V.73. P.449-457 50. Povalko N., Zakharova E., Rudenskaya G., Akita Y., Hirata K., Toyojiro M., Koga Y. A new sequence variant in mitochondral DNA associated with high penetrance of Russian Leber hereditary optic neuropathy // Mitochondrion. 2005. V.5. P. 194-199. 51. Zakharova E.Y, Boukina T.M., Mikhaylova S.V ., Ilina E.S Krabbe disease: mutations spectrum in Russian patients. // J.Inherit. Metab.Dis. 2007. V.30. P.111 52. Tsygankova P.G., Zakharova E.Yu., Mikhaylova S.V., Fedonyuk I.D., Il’ina E.S,Pichkur N.A. The molecular findings in a series of Leigh syndrome patients with Surf1 gene mutations in Russia // J.Inherit. Metab.Dis. 2007. V. 30. P.77 53. Mikhaylova S.V, Zakharova E.Y., Tsygankova P.G.., Kolpakhi L.M., Ilina E.S., Petrukhin A.S Clinical spectrum of Alpers syndrome associated with mutations of the mitochondrial polymerase γgene // J.Inherit. Metab.Dis. 2007. V.30. P.79 54. Mikhaylova S.V., Zakharova E.Y, Baidakova G.V., Shehter O.V., Ilina E.S Clinical outcome of glutaric aciduria type I in Russia. // J.Inherit. Metab.Dis. 2007. V. 30. P.38 55. Voskoboeva EY, Baydakova GV, Denisenkova EV, Denisenkov AI, Zakharova EY A newborn screening and diagnostics of galactosemia type I in Russia. // J.Inherit. Metab.Dis. 2007. V. 30. P.8 56. Zakharova E, Boukina TM. Gene symbol: GALC. Disease: Krabbe disease. // Hum Genet. 2008 . V.124. P.299. 42 57. Захарова Е.Ю., Михайлова С.В. Нарушения обмена углеводов. В кн. Педиатрия. Национальное руководство. / Под ред. А.А. Баранова. М.: «ГЭОТАРМедиа». 2009. Т. 2. С. 408-432. 58. Захарова Е.Ю., Михайлова С.В., Воскобоева Е.Ю. Мукополисахаридозы. В кн. Педиатрия. Национальное руководство. / Под ред. А.А. Баранова. М.: «ГЭОТАР-Медиа». 2009. Т. 2. С. 432-449. 59. Петрухин А.С., Михайлова С.В., Захарова Е.Ю. Наследственные заболевания нервной системы. В кн. Неврология. Национальное руководство / Под ред. Е.И. Гусева, А.Н. Коновалова, В.И. Скворцовой, А.Б. Гехт. М.: «ГЭОТАР-Медиа». 2009. С. 871-908. 60. Михайлова С.В., Захарова Е.Ю., Петрухин А.С. Нейрометаболические заболевания у детей и подростков. Диагностика и подходы к лечению / М: Литера, 2011. 356 с. 61. Захарова Е.Ю., Михайлова С.В. Принципы лечения наследственных болезней. В кн. Наследственные болезни: национальное руководство. Под ред. Н.П. Бочкова, Е.К. Гинтера, В.П. Пузырева. М.: «ГЭОТАР-Медиа». С. 726-741. 62. Захарова Е.Ю., Немцова М.В., Цыганкова П.Г. Митохондриальное наследование и митохондриальные болезни. В кн. Наследственные болезни: национальное руководство. Под ред. Н.П. Бочкова, Е.К. Гинтера, В.П. Пузырева. М.: «ГЭОТАР-Медиа». С. 499-510 . 63. Бочков Н.П., Лавров А.В., Захарова Е.Ю. Биохимические и молекулярногенетические методы диагностики наследственных болезней. В кн. Наследственные болезни: национальное руководство. Под ред. Н.П. Бочкова, Е.К. Гинтера, В.П. Пузырева. М.: «ГЭОТАР-Медиа». 2012. С. 436-452 . 64. Захарова Е.Ю., Воскобоева Е.Ю., Байдакова Г.В., Шехтер О.В., Букина Т.М., Букина А.М. Наследственные болезни обмена веществ. В кн. Клиническая лабораторная диагностика: Национальное руководство / Под ред. В.В. Долгова. М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2012. Т.1. С. 719-735. 43 Список использованных в автореферате сокращений: АЗНЛ –атрофия зрительных нервов Лебера ВЭЖХ-МС-высокоэффективная жидкостная хроматография масс спектрометрия Г-1-ФУТ – галактозо-1-фосфат уридилтрансфераза ГХ-МС- газовая хроматография масс спектрометрия ДЦГАД-длинноцепочечная гидрокси ацил-КоА дегидрогеназа жирных кислот ЛБН – лизосомные болезни накопления ЛБСЛ– лейкоэнцефалопатия с поражением ствола, мозжечка и высоким уровнем лактата при МР-спектроскопии МБ – митохондриальные болезни МЗ – Министерство здравоохранения МЛД – метахроматическая лейкодистрофия ММА–метилмалоновая ацидурия МПС- мукополисахаридозы МС/МС-тандемная масс-спектрометрия мтДНК –митохондриальная ДНК НБО – наследственные болезни обмена веществ НБП – нарушения биогенеза пероксисом ОДЦЖК – очень длинноцепочечные жирные кислоты ПБ – пероксисомные болезни ППЦ –положительная прогностическая ценность РФ- Российская Федерация ФКУ – фенилкетонурия Х-АЛД – Х-сцепленная адренолейкодистрофия
