На правах рукописи ЯКОВЛЕВА Татьяна Юрьевна
реклама
На правах рукописи ЯКОВЛЕВА Татьяна Юрьевна ЗНАЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ И СЛЮНЫ В ДИАГНОСТИКЕ ФИБРОЗА И ПРОГНОЗИРОВАНИИ ЕГО ТЕЧЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ДИФФУЗНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕЧЕНИ 14.00.05 – внутренние болезни Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Нижний Новгород – 2007 2 Работа выполнена в Военно-медицинском институте Федеральной службы безопасности Российской Федерации Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор АЛЕКСЕЕВА Ольга Поликарповна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ПЕНКНОВИЧ Август Аронович доктор медицинских наук, профессор КОРОЧКИНА Ольга Владимировна Ведущая организация: 3-й ЦКВГ им. А. Вишневского Защита диссертации состоится « » мая 2007 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.061.02 при Нижегородской государственной медицинской академии (603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д. 3а Автореферат разослан _____________ 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор ЛУКУШКИНА Е.Ф. 3 Общая характеристика диссертации Актуальность проблемы Цирроз печени (ЦП) - важная медицинская и социальная проблема современности. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, ЦП занимает восьмое место в рейтинге причин смерти в странах Европейского региона [The worlds heath report, 2004]. Среди причин хронических диффузных заболеваний печени и развивающихся в их финале фиброза, а затем и цирроза, исследователи на первое место ставят алкоголь (35,5 - 40,9%случаев), а на второе – вирус гепатита С (19,1 – 25,1% случаев) [Хазанов А. И. и соавт., 2001; Хазанов А. И., 2005; Галимова С. Ф. и соавт., 2001; Шерлок Ш., Дули Дж., 2002; Игнатова Т. М., 2002]. В структуре смертности от цирроза печени на долю алкогольного цирроза приходится 42,8-63,4% случаев, HCV-цирроза – 8,6-11,8% [Плюснин С. В. и соавт., 2002; Павлов А. И. и соавт., 2005; Бобров А. Н. и соавт., 2006]. По данным T. Poynard и Y. Ratzin (2002), к злоупотребляющим алкоголем можно отнести 10% неселения Земного шара. Вирусом гепатита С (HCV) в настоящее время инфицировано более 200 млн человек в мире, и предполагается, что к 2015-2020 гг. это число удвоится [Armstrong G. L. et al., 2000; Seeff L. B., 1999]. В связи с этим, ранняя диагностика фиброза и цирроза печени с целью своевременного начала этиотропной и собственно антифибротической терапии чрезвычайно актуальна. Пункционная биопсия, имеющая в настоящее время статус «золотого стандарта» диагностики патологических процессов в печени, в силу так называемых «ошибок попадания» может давать ложное представление о характере изменений в органе. Кроме того, всегда сохраняется риск развития тяжелых осложнений этой инвазивной диагностической процедуры [Галимова С. Ф. и соавт., 2001; Пинцани М., 2002; Северов М. В. и соавт., 2003]. Поэтому чрезвычайно актуальна разработка альтернативных, неинвазивных методов оценки печеночного фиброгенеза. На решение этой задачи было направлено множество исследований, основанных на применении инструментальных методов [Sanada M. et al., 2000; Caballero Т. et al., 2001; Sandrin L., 2003], 4 определении содержания в крови пациентов компонентов внеклеточного матрикса [Вауег Diagnostics, 2000; Т. Poynard et al., 2000; Н. Д. Ющук и соавт., 2005], а также на оценке изменения в процессе фиброгенеза основных функций печени, состояния мембран гепатоцитов, содержания ростовых факторов [Бычкова В. И. и соавт., 2003; Макаров В. К., 2003; Царегородцева Т. М. и соавт., 2004; Павлов Ч. С. и соавт., 2006; Ягода А. В. и соат., 2006; Neuman M. et al., 1999]. Но способа диагностики фиброза печени, пригодного для применения в широкой клинической практике с точки зрения экономической приемлимости, простоты использования и специфичности показателей для ткани печени, в настоящий момент нет. Также актуально раннее выявление заболеваний, приводящих к фиброзу и циррозу печени – в частности, хронического гепатита С (ХГС). В литературе имеются указания на определение вирусологических маркеров гепатита С не только в крови, но и в слюне [Чернецова О. В. и соавт., 2003; Воробьев О. В., 2000; Roy K. M. et al., 1998, Taliani G. et al., 1997, Kage M. et al., 1997], но результаты этих исследований неоднозначны. Кроме того, в данных работах не ставилась задача оценки вирусной нагрузки крови при различных стадиях процесса в печени (фиброз, цирроз), что также является важным для своевременного начала лечения. Цель исследования: Изучить возможность диагностики и прогнозирования течения фиброза у больных хроническими диффузными заболеваниями печени по изменению некоторых биохимических сывороточных и саливарных показателей и определению HCV-РНК в слюне. Задачи исследования: 1. Провести сравнительную оценку клинических проявлений хронических диффузных заболеваний печени в стадии фиброза и цирроза. 2. Показать зависимость количественных изменений железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы в крови и слюне от 5 наличия у больных хроническими диффузными заболеваниями печени фибротического процесса. 3. Изучить возможность диагностики фиброза и прогнозирования его течения по сочетанному изменению содержания в крови пациентов с HCVфиброзом и циррозом печени железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы на основе применения методов математического моделирования. 4. Оценить информативность исследования слюны по отношению к информативности исследования крови в диагностике фиброза печени и прогнозировании его течения у пациентов с HCV-фиброзом и циррозом печени по сочетанному изменению железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы. 5. Провести сравнительную оценку результатов определения вирусологических маркеров хронического гепатита С в слюне в сопоставлении с уровнем вирусной нагрузкой крови в у пациентов с HCV-фиброзом и HCVциррозом печени. 6. Сравнить возможности индикации HCV-РНК в общей, изолированной и концентрированной слюне у больных хроническим гепатитом С. Научная новизна исследования В результате проведенного исследования впервые установлено, что исход хронического диффузного заболевания печени (фиброз или цирроз) можно прогнозировать по сочетанному изменению содержания в крови или слюне железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы. Впервые разработаны количественные критерии сочетанного изменения сывороточного или саливарного уровней железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы, позволяющие с вероятностью 90-95% диагностировать фиброз и прогнозировать его дальнейшее течение у больного хроническим диффузным заболеванием печени. 6 Впервые показана высокая информативность исследования слюны в прогнозировании развития фиброза и цирроза печени с применением количественных биохимических критериев, не уступающая информативности исследованию сыворотки. Впервые показана зависимость частоты выявления HCV-РНК в слюне от уровня вирусной нагрузки крови у больных с HCV-фиброзом и HCV-циррозом печени. Впервые установлено, что для HCV-фиброза и HCV-цирроза печени характерна высокая виремия, которая сопровождается уровнем вирусной нагрузки слюны, достаточным для индикации современными методами исследования. Впервые показана приоритетная информативность общей слюны (ротовой жидкости) для индикации HCV-РНК по сравнению с изолированной слюной из выводного протока околоушной слюнной железы. Практическая значимость исследования Разработанные биохимические сывороточные и саливарные критерии фиброза и цирроза печени могут быть использованы при проведении неинвазивных исследований с целью выявления среди больных хроническими диффузными заболеваниями печени пациентов с фиброзом, нуждающихся в ранней этиотропной или патогенетической терапии, а также для неинвазивного динамического наблюдения за течением процесса фиброзирования печени у таких пациентов. У больных с HCV-фиброзом и HCV-циррозом печени результаты индикации HCV-РНК в слюне могут быть использованы для неинвазивной диагностики данной патологии и неинвазивного контроля уровня виремии. Реализация результатов исследования Результаты исследования и основные практические рекомендации внедрены в работу гастроэнтерологического отделения областной клинической больницы им. Н. А. Семашко (г. Нижний Новгород), используются в учебном процессе на кафедре внутренних болезней при проведении лекций и практических занятий со слушателями последипломного образования. 7 Публикации и апробация диссертации По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 5 – в центральной печати. Получен приоритет на изобретение от № 2006114890 от 02.05.2006г. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях Военно-медицинского института (2005-2007), на Х Нижегородской сессии молодых ученых (секция «Медицина, биология»), посвященной 60-летию Победы (Нижний Новгород, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции гастроэнтерологов «Особенности гастроэнтерологических заболеваний у детей и взрослых» (Нижний Новгород, 2006), на совместном заседании кафедр внутренних болезней, госпитальной и военно-полевой терапии с курсом токсикологии и радиационной защиты Военно-медицинского института ФСБ России и скорой и неотложной помощи Центра повышения квалификации и последипломного профессионального образования Нижегородской государственной медицинской академии (Нижний Новгород, 2007). Основные положения, выносимые на защиту 1. Определение в крови или слюне обследуемого с хроническим диффузным заболеванием печени железа, гаммаглутамилтранспептидазы орнитиндекарбоксилазы и комплексный анализ и их уровней с применением разработанных нами количественных критериев позволяет с вероятностью 95% диагностировать развитие фиброза печени. 2. В процессе динамического наблюдения за пациентом, которому ранее был поставлен диагноз фиброза печени, определение в крови или слюне железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы и комплексный анализ их уровней с применением разработанных нами количественных критериев позволяет с вероятностью 90-95% прогнозировать переход процесса в цирроз. 3. Метод исследования слюны с целью неинвазивной диагностики и прогнозирования течения фиброза печени по информативности не уступает исследованию крови. 8 Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, включающего 258 источников (из них 144 отечественных и 114 зарубежных). Содержание диссертации дополняют 33 таблицы, 10 диаграмм, 5 рисунков. Содержание диссертационного исследования Материалы и методы исследования Работа выполнена в отделении гастроэнтерологии областной клинической больницы им. Н. А. Семашко, в отделении общей терапии муниципального лечебно-профилактического учреждения № 33, в отделениях гепатологии и в консультативно-диспансерном кабинете городской инфекционной больницы №2. Для выполнения поставленных задач было обследовано 128 человек. Большую часть обследованных составили пациенты с хроническими диффузными заболеваниями печени (82 чел.): хроническим гепатитом С и циррозом печени алкогольного, вирусного, смешанного генеза и криптогенным. 18 больных с гепатитом А и острым гепатитом С вошли в группу сравнения (в дальнейшем - подгруппа ОГ). Контрольная группа (условно-здоровые лица) составила 28 человек (в дальнейшем - подгруппа К). В группе пациентов с острой и хронической патологией печени (100 чел.) было 72 (72,0 %) мужчины и 28 (28,0 %) женщин. Средний возраст обследованных составил 43,8±12,9 года, мужчин – 41,2±11,4 года, женщин – 50,8±14,1 лет. В контрольной группе было 19 мужчин (67,9%) и 9 женщин (32, 1%), средний возраст обследованных составил 35,7±10,6 лет. Диагноз хронического гепатита С и цирроза печени устанавливался в соответствии с общепринятыми международными рекомендациями. Для уточнения степени тяжести цирроза печени использовалась шкала ChildTurcotte-Pugh [Pugh R. N. et al., 1973]. Пациентам с хроническим гепатитом и 9 циррозом печени в стадии компенсации проводилась лапароскопическая или чрескожная пункционная (иглой Mengini) биопсия печени с последующей оценкой биоптата на основе полуколичественной шкалы R. G. Knodell и соавт. (1981). Критерии включения в исследование для пациентов с фиброзом или циррозом печени: наличие морфологически подтвержденного диагноза; критерии исключения: кровотечения любой локализации в течение предшествующих обследованию 3-х месяцев и онкопатология. Критерии включения для больных ХГС: выявление в крови HCV-РНК и характерного для хронизации процесса спектра антител (наличие anti-HCV Core JgG «+», antiHCV NS4 «+», anti HCV Core JgM «±») [С. Н. Соринсон, 1998; А. Ю. Афанасьев, 1995; О. В. Молочкова и соавт., 1998]; критерии исключения: микст-инфекция HBV и/или ВИЧ. В процессе проведения исследования пациенты были последовательно распределены в две группы. Группу № 1 (82 чел.) составили все больные хроническими заболеваниями печени с фибротическими и цирротическими изменениями. Группа была сформирована для поиска биохимических показателей крови и слюны с целью диагностики фиброза (цирроза) печени. Для проведения исследования пациенты были разделены на две подгруппы: Ф (фиброз) – 20 чел. и Ц (цирроз) - 62 чел. В группу №2 вошло 34 пациента с HCV-фиброзом (20 чел.) и HCV-циррозом (14 чел.) печени. Данная группа была набрана для изучения значимости слюны в диагностике HCV-фиброза и HCVцирроза печени в зависимости от уровня виремии. В сыворотке крови и слюне пациентов группы № 1 оценивалось содержание железа, гаммаглутамилтранспептидазы (ГГТП) и орнитиндекарбоксилазы (ОДК). Забор проб крови и слюны для определения биохимических показателей проводили всегда одновременно, в утреннее время, натощак. Периферическую кровь (5 мл) забирали шприцем из локтевой вены и помещали в стеклянную пробирку объемом 10 мл. После центрифугирования на 3 тыс. об/мин в течение 15 мин. получившуюся сыворотку помещали в стандартизованную пластиковую одноразовую микропробирку типа 10 «Эппендорф» объемом 1,5 мл. Забор общей слюны (ротовой жидкости) для исследования осуществляли в утреннее время, натощак, до чистки зубов (во избежание повреждения десен и попадания в пробу крови), после обязательного споласкивания полости рта водой. Слюну собирали пробирку «Эппендорф». Определение путем сплевывания в биохимических показателей, как правило, проводилось в день забора проб. Для оценки содержания железа в сыворотке крови и в слюне был использован метод атомно-сорбционной пламенной спектрофотометрии в соответствии с методическими рекомендациями П. Н. Любченко (1994) (спектрофотометр атомно-сорбционный СФ – 115 - М1 производства ПСЗ «Оптрон», г. Сумы, Украина, № государственной регистрации 11296-88). Активность сывороточной и саливарной ГГТП определяли с помощью набора реагентов GTP-carboxy «FL» производства фирмы «VITAL DIAGNOSTICS SPb» (г. Санкт-Петербург) унифицированным методом по «конечной точке» с использованием фотометра фотоэлектрического КФК-3 производства АО «Оптико-механический завод», г. Загорск. Активность ОДК определяли на фотоколориметре энзиматическим методом на основе убыли субстрата (орнитина) по методике В. А. Храмова (1997). Всем обследуемым, вошедшим в группу №2, проводилось исследование крови в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью качественной индикации HCV-РНК и определения вирусной нагрузки. Параллельно проводилось исследование общей слюны (ротовой жидкости) на наличие HCV-РНК. В случае обнаружения последней в общей слюне, проводился забор изолированной слюны из выводного протока околоушной слюнной железы (Стенонова протока) с последующей качественной индикацией в образце HCVРНК. Слюна больных с низким уровнем вирусной нагрузки крови (1х103 коп/мкл), результат качественной индикации HCV в которой оказался отрицательным, подвергалась концентрированию определением HCV-РНК в полученном концентрате. с последующим 11 Для сравнительного определения HCV-РНК в крови и в слюне забор проб крови и слюны проводили всегда параллельно, в утреннее время, натощак. Периферическую кровь (1 мл) забирали шприцем из локтевой вены и помещали в стандартизованную пластиковую одноразовую (во избежание контаминации) микропробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. Забор общей слюны для индикации HCV-РНК осуществлялся согласно приведенным выше правилам. Изолированную слюну для исследования на наличие HCV-РНК собирали с помощью катетера подключичного, однократного применения, стерильного «Луер», ТУ 64-3-115-86, производства ОАО «Синтез», г. Курган, и присоединенного к свободному концу катетера шприца (5 мл). Индикация HCV-РНК в образцах крови и слюны, как правило, проводилась в день забора проб. Для определения HCV использовалась двухкомпонентная отечественная тест-система производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ России (Москва). Чувствительность использованного метода индикации HCV-РНК составила 1х103 вирусных геномов в 1 мкл. Слюну для концентрирования собирали в пластиковые градуированные одноразовые пробирки объемом 50 мл в количестве 30-35 мл. Забор производился в соответствии с вышеперечисленными правилами, путем сплевывания в температуре - последующей пробирку. 20º ПЦР. и После этого образцы хранились до проведения Концентрирование слюны замораживались при концентрирования и осуществлялось двумя способами (дробное осаждение на полиэтиленгликоль молекулярной массой 6000 и седиментационное осаждение в ультрацентрифуге со скоростью 27000 оборотов в минуту в течение 3 часов). Для седиминтационного осаждения использовалась ультрацентрифуга препаративная К-32 производства машиностроительного завода «Молния» (г. Москва), 1980 г/в (ротор С-30, 30 тыс. оборотов в минуту). Статистическая обработка материалов проводилась на ЭВМ с использованием стандартных программ Excel и Statistica 6.0 Оценку уровней межгрупповых различий по количественным признакам производили с 12 использованием непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни (U). Различия считали достоверными при t = 2 - 2,5 (p<0,05), высокодостоверными при t > 2,5 (p<0,01) и недостоверными при t < 2 (p>0,05). Для уточнения достоверности различия между группами по изучаемым нами биохимическим показателям и для определения количественных критериев прогнозирования диагностики фиброза печени и прогрессирования его в цирроз был использован метод Байеса и последовательный анализ Вальда. Основные расчеты были проведены на основе известных методов математического моделирования для распознавания образов [Е. В. Гублер, 1978; В. В. Власов, 2001]. Метод Байеса позволяет рассчитать полную вероятность каждого из возможных вариантов заболевания, события или другого процесса, если у тест-объекта обнаружен определенный набор изменений показателей (симптомов заболевания или иных диагностических признаков). В качестве диагностических признаков нами было использовано содержание в определенном диапазоне значений отдельных биохимических показателей крови и слюны (железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы). Результаты исследования Клиническая характеристика больных хроническими заболеваниями печени в стадии фиброза и цирроза Результаты сравнительной оценки клинических проявлений фиброза и цирроза печени представлена в таблице 1. Клиническая картина цирроза в целом была более яркой, чем при фиброзе и отличалась от последнего по всем учитываемым нами признакам. проявлений у При раздельной же оценке клинических пациентов с компенсированным и субкомпенсированным/декомпенсированным ЦП выяснилось, что клиническая картина при циррозе класса А существенно отличалась от клинических проявлений цирроза классов В и С (по шкале Child-Turcotte-Pugh), и в то же время была практически идентична клинической симптоматике фиброза печени. 13 Повышение аланинаминотрансферазы (АЛТ) наблюдалось у 50,0% пациентов подгруппы Ф и 71,0% больных с ЦП (табл. 2). При фиброзе и циррозе класса А речь в большинстве случаев шла об увеличении активности фермента в переделах 2 норм, в то время как при циррозе классов В и С имело место повышение уровня АЛТ от 2 до 4 норм и более. Таблица 1. Клиническая характеристика больных с фиброзом и циррозом печени. Симптом/синдром Подгруппы больных Ф (n=20) Ц (n=62) Цирроз класса А (n = 18) абс. % Цирроз классов B и C (n = 44) абс. % абс. % абс. % Слабость 10 50,0 52 83,9 10 55,6 42 95,5 «Малые» печеночное знаки Гепатомегалия 2 10,0 46 74,2 2 11,1 44 100,0 16 80,0 58 93,5 15 83,3 43 97,7 Спленомегалия 0 - 38 61,3 0 - 38 86,4 Холестатический синдром Синдром желудочнокишечного дискомфорта Геморрагический синдром Тяжесть/дискомфорт в правом подреберье Сухость во рту 2 10,0 40 64,5 2 11,1 38 86,4 8 40,0 40 64,5 11 61,1 29 65,9 2 10,0 36 58,1 2 11,1 34 77,3 8 40,0 32 51,6 9 50,0 23 52,3 6 30,0 24 38,7 5 27,8 19 43,2 Повышение таких «печеночных» показателей, как билирубин, протромбиновый индекс и альбумин, входящих в критерии шкалы ChildTurcotte-Pugh, используемой для оценки степени компенсации цирроза и составления краткосрочного прогноза его прогрессирования, закономерно имело место в основном при циррозе классов В и С. У пациентов с фиброзом печени вышеперечисленные показатели превышали норму в единичных 14 случаях, как и при циррозе класса А. Частота превышения нормы ГГТП была одинаково высокой при циррозе всех трех классов (табл. 2). Таблица 2. Данные лабораторных исследований пациентов с фиброзом и циррозом печени. Изменение показателя Повышение АЛТ Повышение ГГТП Повышение общего билирубина Снижение ПТИ Снижение альбумина Уменьшение количества тромбоцитов абс. 10 % 50,0 Подгруппы больных Ц (n=62) Цирроз класса Цирроз А классов B и C (n = 18) (n = 44) абс. % абс. % абс. % 44 71,0 10 55,6 34 72,3 2 10,0 53 85,6 14 77,8 39 88,6 - - 34 54,8 - - 34 54,8 1 5,0 32 51,6 1 5,6 31 70,5 2 10,0 18 29,0 2 11,1 16 36,34 - - 16 25,8 1 5,6 15 34,1 Ф (n=20) То есть, разграничить компенсированный цирроз печени и фиброз– ту стадию заболевания, когда своевременно начатое лечение может оказаться наиболее эффективным - на основании оценки клинических проявлений и большинства лабораторных показателей «печеночного» профиля оказалось невозможным. При сравнительной оценке клинических проявлений HCV-фиброза и HCV-цирроза печени в зависимости от уровня виремии выяснилось, что вирусная нагрузка крови в целом незначительно влияет на клинику. Исключения составили такие проявления геморрагического синдрома, как кровоточивость десен, носовые кровотечения и телеангиэктазии, из системных 15 поражений – артралгии, которые чаще встречались у пациентов с высокой вирусной нагрузкой (1х105-6 коп/мкл) по сравнению с пациентами со средней и низкой виремией (1х103-4 коп/мкл). Гепатомегалия различной степени выраженности имела место практически у всех пациентов как с низким/средним, так и с высоким уровнем вирусной нагрузки крови – 90,9% и 91,3% соответственно. Но при низкой и средней виремии превышение нормальных размеров печени при перкуссии по среднеключичной линии в среднем составило 2,38±0,23 см, а при высокой – 3,54±0,57 см, различие было статистически значимым (p<0,05). Анализ зависимости содержания в сыворотке АЛТ от вирусной нагрузки крови существенной (статистически достоверной) разницы между группами не выявил. Таким образом, клинические симптомы не могут быть использованы как достоверный маркер степени тяжести хронического гепатита С и надежный прогностический фактор. Изменение содержания железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы в сыворотке и слюне больных с фиброзом и циррозом печени Поскольку фиброз у всех пациентов в нашем исследовании был обусловлен наличием у них хронического гепатита С, а цирроз у обследованных больных только в 45% случаев развился в финале этого заболевания, мы сочли необходимым вначале проанализировать раздельно уровень изучаемых нами показателей в крови и слюне пациентов с HCV- и не HCV-циррозом (алкогольным и криптогенным). Для этого подгруппа Ц была разделена на 2 подгруппы: больные с HCV-циррозом (28 чел.) и с не HCVциррозом (34 чел.). Анализ показал, что средние уровни железа, ГГТП и ОДК в подгруппах, как сывороточные, так и саливарные, оказались практически идентичны между собой. Это позволило нам для дальнейшего изучения объединить подгруппы пациентов с HCV- и не HCV-циррозом в одну – подгруппу Ц (62 чел.). Результаты определения содержания железа в сыворотке и слюне обследованных представлены в таблице 3. 16 Имело место статистически достоверное повышение содержания железа в сыворотке и слюне пациентов с фиброзом печени по отношению к условноздоровым и снижение содержания микроэлемента в исследуемых биологических средах при развитии цирроза по отношению к больным с фиброзом. Среднее содержание сывороточного и саливарного железа при остром гепатите также оказалось ниже, чем при фиброзе печени, но незначительно и статистически недостоверно. Результаты определения содержания гаммаглутамилтранспептидазы в сыворотке и слюне обследованных представлены в таблице 4. Имело место последовательное, через фиброз к циррозу, статистически значимое увеличение активности ГГТП как в сыворотке, так и в слюне больных. Среднее содержание ГГТП в крови больных острым гепатитом оказалось в несколько раз выше, чем у больных с фиброзом печени, различие было статистически подтверждено, а соответствующее повышение фермента в слюне оказалось невыраженным и статистически незначимым. Результаты определения активности орнитиндекарбоксилазы в сыворотке и слюне обследованных представлены в таблице 5. Имело активности место фермента выраженное, в статистически сыворотке и слюне значимое больных повышение хроническими заболеваниями печени по сравнению с условно-здоровыми лицами. Отличие содержания орнитиндекарбоксилазы в сыворотке и слюне больных острым гепатитом и пациентов с циррозом от соответствующих показателей подгруппы Ф статистически значимым не было. 17 Таблица 3. Содержание железа в сыворотке и слюне пациентов с фиброзом и циррозом печени, пациентов с острым гепатитом и условно-здоровых лиц. Подгруппа пациентов Ф (n=20) Биологическая среда Кровь Слюна Кровь Слюна Кровь Слюна Кровь Слюна Ц (n=62) К (n=28) ОГ (n=18) X ± S x , мкмоль/л 23,64±2,11 1,67±0,34 18,32±1,24 0,83±0,11 17,57±0,80 0,91±0,27 21,90±1,64 1,36±0,12 Достоверность отличия от подгруппы Ф по критерию УилкоксонаМанна-Уитни (U) р<0,05 p<0,05 p<0,05 р<0,01 р>0,05 р>0,05 Таблица 4. Содержание гаммаглутамилтранспептидазы в сыворотке и слюне больных с фиброзом и циррозом печени, пациентов с острым гепатитом и условно-здоровых лиц. Подгруппа пациентов Ф (n=20) Ц (n=62) К (n=28) ОГ (n=18) Биологическая среда Кровь Слюна Кровь Слюна Кровь Слюна Кровь Слюна X ± S x , мккат/л 0,71±0,12 0,30±0,12 2,86±0,31 1,01±0,12 0,26±0,03 0,19±0,03 3,58±0,50 0,42±0,07 Достоверность отличия от подгруппы Ф по критерию УилкоксонаМанна-Уитни (U) p<0,01 p<0,05 p<0,01 p<0,01 р<0,01 р>0,05 18 Таблица 5. Содержание орнитиндекарбоксилазы в сыворотке и слюне больных с фиброзом и циррозом печени, пациентов с острым гепатитом и условноздоровых лиц. Подгруппа пациентов Ф (n=20) Ц (n=62) К (n=28) ОГ (n=18) Биологическая среда Кровь Слюна Кровь Слюна Кровь Слюна Кровь Слюна X ± S x , нкат/мл Достоверность отличия от подгруппы Ф по критерию УилкоксонаМанна-Уитни (U) 0,04±0,02 0,12±0,03 0,07±0,01 0,10±0,01 0,004±0,001 0,04±0,01 0,03±0,01 0,07±0,01 р>0,05 р>0,05 p<0,01 p<0,01 p>0,05 р>0,05 С применением метода Байеса нами было вычислено, что: 1. при уровне сывороточного железа более 20,0 мкмоль/л, содержании в сыворотке ГГТП более 0,3 мккат/л и ОДК – более 0,002 нкат/мл у обследуемого с хроническим диффузным заболеванием печени с вероятностью 95% верно предположение о наличии у него фиброза печени; 2. при уровне саливарного железа более 1,0 мкмоль/л, содержании в слюне ГГТП более 0,2 мккат/л и ОДК – более 0,05 нкат/мл у обследуемого с хроническим диффузным заболеванием печени с вероятностью 95% верно предположение о наличии у него фиброза печени; 3. при уровне сывороточного железа менее 11,5 мкмоль/л, содержании в сыворотке ГГТП более 1,0 мккат/л и ОДК – более 0,08 нкат/мл у пациента, которому ранее был поставлен диагноз фиброза печени, с 19 вероятностью 95% верно предположение о прогрессировании фиброза в цирроз; 4. при уровне саливарного железа менее 1,2 мкмоль/л, содержании в сыворотке ГГТП более 0,6 мккат/л и ОДК – более 0,145 нкат/мл у пациента, которому ранее был поставлен диагноз фиброза печени, с вероятностью 90% верно предположение о прогрессировании фиброза в цирроз; 5. при уровне сывороточного железа более 22,5 мкмоль/л, содержании в сыворотке ГГТП менее 1,4 мккат/л и ОДК – более 0,015 нкат/мл у обследуемого с патологией печени с вероятностью 90% верно предположение о наличии у него фиброза, а не гепатита; 6. при уровне саливарного железа более 2,0 мкмоль/л, содержании в слюне ГГТП менее 0,36 мккат/л и ОДК – более 0,09 нкат/мл у обследуемого с патологией печени с вероятностью 90% верно предположение о наличии у него фиброза, а не гепатита. Таким образом, были разработаны биохимические критерии разграничения таких состояний, как фиброз и отсутствие фиброза, фиброз и цирроз, фиброз и острый гепатит. Данные критерии были рассчитаны нами раздельно для сывороточных и саливарных показателей, и было установлено, что слюна в качестве материала для подобного исследования не уступает сыворотке в информативности, а, соответственно, является более предпочтительной для использования вследствие простоты и удобства забора, неинвазивности и безболезненности этой процедуры, отсутствия риска инфицирования. Результаты индикации HCV-РНК в сыворотке и слюне больных HCV-фиброзом и HCV-циррозом печени Почти у 70% пациентов с HCV-фиброзом и HCV-циррозом печени был зарегистрирован высокий уровень вирусной нагрузки крови (1х105-6 коп/мкл), еще у 18% содержание HCV-РНК в крови составило 1х104 коп/мкл. Та часть пациентов, определить вирус в слюне которых не удалось (пациенты с 20 виремией 1х103 коп/мкл), составила среди больных с HCV-фиброзом и HCVциррозом менее 15%. При содержании вируса в сыворотке, равном 1х104 коп/мкл, в слюне он методами, применяемыми в современной медицинской практике, определялся у половины пациентов. При высоком же уровне виремии (1х105-6 коп/мкл) частота выявления HCV-РНК в слюне возрастала до 71-100%. Таким образом, более, чем для 85% таких больных характерно среднее и высокое содержание HCV-РНК в крови и высокая частота выявления вируса в слюне. При дополнительном обследовании 20 больных с HCV-фиброзом и HCVциррозом печени с положительными результатами качественной индикации HCV-РНК в ротовой жидкости, в изолированной слюне из Стенонова протока вирус был выявлен у 6 человек (30%). При сравнительной оценке вирусной нагрузки в общей и изолированной слюне различия в содержании HCV-РНК выявлено не было. Таким образом, общая слюна (ротовая жидкость) оказалась более информативным материалом для индикации HCV-РНК, чем изолированная из околоушной слюнной железы. Ни в одном из образцов концентрированной слюны HCV-РНК не была выявлена. Данный факт, на фоне выявления вируса гепатита С в слюне большей части больных с высокой виремией, на наш взгляд, свидетельствовал о сохранении нормальной функции гематосаливарного барьера при низкой вирусной нагрузке крови и о нарушении его проницаемости в отношении изучаемого нами вирусного агента при высокой виремии. Выводы 1. Клиническая картина цирроза печени в стадии компенсации оказалась скудной и была неотличима от клинических проявлений хронического диффузного заболевания печени в стадии фиброза. 2. Содержание железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы в крови и слюне больных хроническими диффузными заболеваниями печени в стадии фиброза и цирроза 21 статистически значимо отличалось от соответствующих показателей здоровых лиц. 3. Применение метода Байеса с использованием оценки сывороточных и саливарных уровней орнитиндекарбоксилазы железа, гаммаглутамилтранспептидазы позволило с вероятностью и 90-95% диагностировать фиброз у обследуемого с хроническим диффузным заболеванием печени, а при динамическом наблюдении – прогнозировать прогрессирование фиброза в цирроз. 4. Информативность исследования слюны в диагностике фиброза печени и прогнозировании его течения с помощью анализа сочетанного изменения уровней железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы не уступала сыворотке крови. 5. Уровень вирусной нагрузки крови у большинства больных с HCVфиброзом и HCV-циррозом печени оказался высоким (1х105-6 коп/мкл). При данном уровне вирусной нагрузки HCV-РНК с частотой 71-100% выявлялась также и в слюне. При низком уровне вирусной нагрузки крови HCV-РНК слюне не выявлялась. 6. Общая слюна (ротовая жидкость) оказалась более информативным материалом для вирусологической диагностики хронического гепатита С, чем изолированная слюна из выводного протока околоушной слюнной железы. Практические рекомендации 1. Для неинвазивной диагностики фиброза и цирроза печени на этапе амбулаторного обследования рекомендуется определять в крови или слюне пациентов с хроническими диффузными заболеваниями печени содержание железа, гаммаглутамилтранспептидазы и орнитиндекарбоксилазы и на основании анализа сочетанного изменения показателей предполагать фиброз или цирроз печени с проведением дальнейшего необходимого обследования. 22 2. При определении HCV-РНК в общей слюне пациента с HCV-фиброзом или HCV-циррозом печени при первичном обследовании или в динамике следует предполагать, что вирусная нагрузка крови больного высокая. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ 1. Использование спектра anti HCV в слюне для диагностики хронического гепатита С / Т. Ю. Яковлева // Ремедиум Приволжье. Выпуск «Гастроэнтерология». – Апрель 2004. - С. 43-44. 2. Слюна как материал для диагностики различных клинических вариантов хронического гепатита С / О. П. Алексеева, Т. Ю. Яковлева // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. Приложение № 23. Материалы 10-й Российской гастроэнтерологической недели (25-28 октября 2004 г., г.Москва). - 2004. – Т ХIV, № 5. - С. 72. 3. Возможность использования слюны в качестве материала для неинвазивной диагностики хронического гепатита С / О. П. Алексеева, Т. Ю. Яковлева // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. Приложение № 24. Материалы 10-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (28-30 марта 2005 г., г.Москва). – 2005. – Т. XV, №1 - С. 72. 4. Возможность использования определения спектра anti HCV в слюне для неинвазивной диагностики хронического гепатита С / Т. Ю.Яковлева // Материалы итоговой научно-практической конференции слушателей ВМИ ФСБ России – Н. Новгород, 14 апреля 2005. – С.84-86. 5. Определение HCV РНК в общей и изолированной слюне больных хроническим гепатитом С / Т. Ю. Яковлева, В. Н. Мазепа, А. Г. Кургульский // Актуальные вопросы внутренней патологии: Сб. научных работ посвященных 10-летию кафедры внутренних болезней Военномедицинского института ФСБ России /под ред. Борисова А.Н., Н.Новгород, 2005. – С.141-145. 6. Клинический пример внепеченочных проявлений хронического гепатита С / Т. Ю. Яковлева, О. В. Абраменко // Актуальные вопросы внутренней патологии: Сб. научных работ посвященных 10-летию кафедры внутренних болезней Военно-медицинского института ФСБ России /под ред. Борисова А.Н., - Н.Новгород, 2005. – С.146-150. 7. Значение некоторых биохимических показателей крови и слюны в скрининг-диагностике фиброза печени / Т. Ю. Яковлева, О. А. Мажара, А. Б. Бузина, И. О. Отмахова // Материалы итоговой научнопрактической конференции слушателей ВМИ ФСБ России – Н. Новгород, 20 апреля 2006. – С. 103-105 8. Значение слюны в скрининг-диагностике фиброза печени и динамическом наблюдении за его прогрессированием / Т. Ю. Яковлева, О. П. Алексеева, Л. В. Коркоташвили // Материалы научно-практической 23 конференции «День Российской науки». - Н Новгород, 7 февраля 2006. – С.38-41. 9. Значение биохимических показателей крови и слюны в диагностике фиброза печени / Т. Ю. Яковлева // Ремедиум Приволжье. – Июль-август 2006. – С. 37-39. 10.Использование биохимических показателей крови и слюны для диагностики фиброза печени и динамического наблюдения за его прогрессированием / Т. Ю. Яковлева, Л. В. Коркоташвили, О. П. Алексеева // Нижегородский медицинский журнал. – 2006. - № 8. – С. 4448 Список сокращений АЛТ – аланинаминотрансфераза ГГТП – гаммаглутамилтранспептидаза ОДК – орнитиндекарбоксилаза ПЦР – полимеразная цепная реакция HCV, HCV-РНК – вирус гепатита С ХГС – хронический гепатит С ЦП – цирроз печени anti-HCV – антитела к вирусу гепатита С
