НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития
Фармацевтический факультет
__________________________
Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии
Химико-токсикологический
анализ фосфорсодержащих
пестицидов
Учебно–методическое пособие для студентов 5 курса
фармацевтического факультета
Нижний Новгород
2006
ВВЕДЕНИЕ
Пестициды – химические вещества, используемые для борьбы с
вредителями, наносящими ущерб животным, растениям, грибам или
микроорганизмам, а также применяемые в качестве стимуляторов роста.
Пестициды можно классифицировать по видам вредителей, на
которые они воздействуют, и по химической природе. В соответствии с
химической классификацией пестициды делят на три класса:
 неорганические соединения – соединения меди, мышьяка (арсениты
и арсенаты);
 органические
соединения
(синтезированные
и
природного
происхождения);
 металлорганические соединения (органические соединения ртути и
олова).
Одним из наиболее важных классов синтезированных органических
ядохимикатов являются фосфорсодержащие соединения.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Фосфорорганические пестициды (ФОС) представляют собой эфиры
различных кислот:
HO
O
P
P
HO
OH
фосфорной
HO
HO
HO
S
HO
фосфористой
O
HO
P
SH
дитиофосфорной
P
OH
HO
P
HO
S
HO
тиофосфорной
O
O
OH
OH
P
OH
пирофосфорной
2
Основные фосфорорганические пестициды
Наименование
Производные ортофосфорной кислоты Н3РО4:
дихлофос, О-(2,2-дихлорэтинил)-диметилфосфат
(для борьбы с кишечными паразитами животных)
OCH3
H3CO
P
O
C
H
DL50, мг/кг
80
CCl2
O
Производные фосфоновой кислоты:
хлорофос (трихлорфон) – 1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтилО,О-диметилфофонат (инсектицид)
560
OCH3
H3CO
P
H
C
O
OH
CCl3
Производные тиофосфорной кислоты:
метафос – О,О-диметил-О,n-нитрофенилтиофосфат
(инсектицид для защиты бобовых, ягодных культур и риса)
25-50
H3CO
P
H3CO
O
NO2
S
метилнитрофос (сумитион) – диметил 3-метил-4нитрофенил фосфоротионат (инсектицид)
470-516
S
H3CO
P
O
NO2
H3CO
CH3
фоксим – 2-(диэтокситиофосфиноилоксамино)-2фенилацетонитрил (инсектицид)
3
2000
S
C2H5O
CN
P
O
N
C
C2H5O
байтекс (фентион) – О,О-диметил О-3-метил-4метилтиофенил фосфоротионат (инсектицид)
S
H3CO
P
O
341
S
CH3
H3CO
CH3
Производные дитиофосфорной кислоты:
карбофос (малатион) – О,О-диметил-S-(1,2этоксикарбонилэтил) дитиофосфат (инсектицид, акарицид)
OCH3
H3CO
P
H
C
COOC2H5
H2C
COOC2H5
S
S
фосфамид – О,О-диметил –S-(N-метилкарбамоилметил)
дитиофосфат (для борьбы с вредными насекомыми, в
частности, с клещами и жуками)
OCH3
O
H3CO
P
S
H2
C
C
H
N
O
P
O
O
N(CH3)2
P
(H3C)2N
N(CH3)2
4
250
CH3
S
Производные пирофосфорной кислоты:
Пирофосфамид
–
октаметилтетрамидпирофосфорной
кислоты (для борьбы с сосущими насекомыми и
растительноядными клещами)
(H3C)2N
1375
10-22
Токсическое
действие
активности
фермента
разрушение
и
ФОС
является
ацетилхолинэстеразы,
прекращение
биологической
следствием
который
угнетения
отвечает
активности
за
медиатора
ацетилхолина. Реакция между фософрорганическим эфиром и активным
центром фермента ацетилхолинэстеразы (гидроксильная группа серина)
приводит к формированию устойчивого и нереакционноспособного
ингибированного
фермента
ФОС-ацетилхолинэстеразы,
происходит
блокирование передачи нервных импульсов вследствие недоступности
фермента для молекул эндогенного нейромедиатора. Наблюдается стойкий
нейротоксический эффект, нарушаются нервно-психические и нервномышечные
функции,
что
может
вызывать
желудочно-кишечные
расстройства, заболевания сердечно-сосудистой системы и др. Эти
нарушения могут сохраняться и развиваться 5-10 лет.
Химико-токсикологический анализ различных объектов, главным
образом растительного происхождения, основан на экстракции ФОС
органическим растворителем, разрушении молекулы ФОС, качественном
обнаружении и количественном определении продуктов разложения.
Изолирование фосфорорганических ядохимикатов
Биологический материал в количестве 50 г измельчают, помещают в
колбу емкостью 250—300 мл с притертой пробкой, заливают трехкратным
количеством (150 мл) смеси ацетона, этанола, воды (в соотношении 2:2:1),
перемешивают, подкисляют кристаллической щавелевой кислотой до рН =
4,5 по универсальному индикатору (0,5 г щавелевой кислоты) и
однократно
настаивают
при
комнатной
температуре
4
часа
при
периодическом взбалтывании через 15—20 мин или 2 часа при
непрерывном перемешивании.
После настаивания надосадочную жидкость отфильтровывают через
бумажный фильтр в фарфоровую чашку и упаривают на водяной бане до
60—75 мл. Остаток переносят в делительную воронку емкостью 250—300
мл, добавляют 25 мл хлороформа, 75 мл 25 % раствора хлорида натрия,
5
содержимое
воронки
встряхивают
5
мин.
После
отстаивания
хлороформный слой сливают в колбу емкостью 100—150 мл, а оставшуюся
в делительной воронке жидкость еще дважды экстрагируют, добавляя по 15
мл хлороформа. Объединенные хлороформные извлечения обесцвечивают
активированным углем и фильтруют через бумажный фильтр с безводным
сульфатом натрия в сухую фарфоровую чашку, упаривают до объема 2 мл и
исследуют.
Холинэстеразная проба
с применением кислотно-основного индикатора
Берут две фарфоровые чашки. В одну вносят 1 каплю исследуемого
хлороформного извлечения, выпаривают досуха. К сухому остатку
прибавляют 2-3 капли воды, 1 каплю индикаторной смеси и через 10 мин 1
каплю 0,4 % раствора ацетилхолина. Окраска раствора не изменяется. Во
вторую чашку (контроль) вносят 1 каплю индикаторной смеси и 1 каплю
раствора ацетилхолина. Через несколько минут синяя окраска раствора
переходит в желтую. Изменение окраски жидкости во второй чашке и
отсутствие изменения окраски в первой чашке указывает на наличие ФОС
в исследуемом объекте.
Индикаторная смесь: к 5 мл лошадиной сыворотки прибавляют 15 мл воды, 0,5 мл 0,1
моль/л раствора гидроксида натрия и 1,25 мл 0,6 % раствора бромтимолового синего в
0,1 моль/л растворе гидроксида натрия.
Обнаружение фосфора
Чтобы определить наличие фосфора в соединениях, их подвергают
минерализации, т. е. переводят органически связанный фосфор в фосфатион. Для этой цели используют различные окислители: бром, персульфат
аммония, перекись водорода, смесь хлорной и хлористоводородной
кислот, смесь серной и азотной кислот и др. Затем в минерализате фосфатион обнаруживают с помощью соответствующих реакций.
Обнаружение
фосфат-иона.
В
пробирку
вносят
3—5
капель
минерализата и прибавляют 5 капель раствора молибдата аммония. Смесь
6
подкисляют 10 % раствором азотной кислоты. Появляется желтое
окрашивание.
К
полученному
насыщенного
водного
раствору
раствора
прибавляют
гидрохлорида
3—5
капель
бензидина,
затем
прибавляют 10 % раствор гидроксида аммония до щелочной реакции (по
лакмусу). Появляется синее окрашивание.
Обнаружение
фосфора
методом
ТСХ.
На
стартовую
линию
хроматографической пластинки наносят исследуемое хлороформное
извлечение и растворы метчиков в хлороформе: дихлофоса, хлорофоса,
карбофоса,
метафоса.
Пластинку
хроматографируют
в
системе
растворителей н-гексан:ацетон (2:1). Фронт пробега растворителя 10 см.
Для обнаружения веществ на хроматограмме пластинку выдерживают 2—
3 мин в камере (эксикаторе), насыщенной парами брома, затем переносят в
вытяжной шкаф для удаления избытка брома. Опрыскивают 7 % раствором
персульфата аммония, выдерживают 10 мин в сушильном шкафу при 100
°С,
охлаждают
до
комнатной
температуры.
Затем
пластинку
последовательно обрабатывают 1 % раствором хлорида железа (III) в 80 %
этаноле и 1 % раствором сульфосалициловой кислоты в 80% этаноле. В
области локализации ФОС наблюдаются белые и желтоватые пятна на
розовом фоне пластинки.
Групповое разделение и предварительное обнаружение ФОС (ТСХскрининг ФОС). Хроматографическую пластинку делят на три зоны в
вертикальном направлении. На стартовую линию в каждой зоне в виде
отдельных точек наносят исследуемое хлороформное извлечение и
растворы метчиков в хлороформе: в зоне I— хлорофоса и дихлофоса, в
зоне II — метафоса, в зоне III — карбофоса. Пластинку хроматографируют
в системе бензол или хлороформ. Пробег фронта растворителя 10—15 см.
Для обнаружения веществ на хроматограмме каждую зону обрабатывают
соответствующим реактивом. При этом две другие зоны пластинки
закрывают. Первую зону пластинки (метчики — хлорофос и дихлофос)
обрабатывают 1% раствором резорцина в 5% растворе гидроксида натрия.
7
Дихлофос проявляется через 1-2 мин в виде пятна красно-розового цвета.
После проявления дихлофоса пластинку нагревают 5 мин в сушильном
шкафу при 100 °С. В зоне локализации хлорофоса появляется пятно
красно-розового цвета. Вторую зону пластинки (метчик – метафос)
обрабатывают 5% спиртовым раствором гидроксида натрия и нагревают
5—10 мин в сушильном шкафу при 100—110°С. Наблюдается лимонножелтое окрашивание. Третью зону пластинки (метчик — карбофос)
обрабатывают 0,5% раствором хлорида палладия в 1 % растворе
хлористоводородной кислоты. Карбофос образует желтое пятно.
Значения Rf хлорофоса, дихлофоса, метафоса и карбофоса на различных
сорбентах указаны в табл. 1.
При обнаружении на хроматографической пластинке соответствующей
группы
ФОС
(производные
алкилфосфорной,
тиофосфорной
и
дитиофосфорной кислот) с хлороформными извлечениями проводят
химические реакции и ТСХ в частных системах растворителей.
Цветные реакции на хлорофос и ДДВФ.
Реакция с пиридином и щелочью (реакция Фудживара). Сухой остаток
после испарения хлороформного извлечения растворяют в 1 мл воды. К
полученному раствору прибавляют 1 мл пиридина и 1 мл 30 % раствора
гидроксида натрия. Смесь нагревают на кипящей водяной бане 5 мин.
Появляется красное или розовое окрашивание.
Реакция с резорцином. Сухой остаток после испарения хлороформа
растворяют в 1 мл воды. К полученному раствору прибавляют 2 капли 1 %
раствора резорцина в 20 % растворе карбоната натрия или 1 % растворе
гидроксида натрия. Через 10 мин появляется розовое окрашивание, а через
15—30 мин наблюдается желто-зеленая флюоресценция раствора. Реакция
протекает при рН = 9,0—11,0. Окраска и флюоресценция достигают
максимума через 1—2 часа после прибавления реактивов. Через 4—6 часов
розовое окрашивание переходит в оранжевое, а затем в желтое.
Флюоресценция раствора сохраняется в течение нескольких суток.
8
Реакция образования изонитрила. К сухому остатку прибавляют 1 мл
этилового спирта. Смесь взбалтывают, затем прибавляют 2 мл 10 %
спиртового раствора гидроксида натрия и 1 каплю анилина, нагревают.
Ощущается характерный запах изонитрила.
Реакция с о-толидином. Сухой остаток растворяют в 0,2—0,5 мл воды
или спирта, прибавляют 1 мл 0,5 % раствора о-толидина в ацетоне и 1 мл
смеси растворов пероксида водорода и гидроксида натрия. Появляется
желтое или оранжевое окрашивание.
Реакция с 2,4-динитрофенилгидразином. Сухой остаток растворяют в 210 каплях воды, прибавляют 2 капли 1 моль/л раствора гидроксида натрия.
Через
20
мин
прибавляют
динитрофенилгидразина
в
4
1
каплю
моль/л
0,1
растворе
%
раствора
2,4-
хлористоводородной
кислоты. Пробирку нагревают 30 мин на кипящей водяной бане. Смесь
охлаждают и прибавляют 1 каплю 4 моль/л раствора гидроксида натрия и
0,5 мл этилового спирта. Появляется синее или сине-фиолетовое
окрашивание.
Реакция с ацетоном. Сухой остаток растворяют в 0,1-0,5 мл этилового
спирта, прибавляют 1 мл ацетона и 0,5 мл 0,5 моль/л спиртового раствора
гидроксида натрия. Через 5-15 мин появляется розовое окрашивание,
переходящее в оранжевое.
Качественные реакции на карбофос
Реакция с диазотированной сулъфаниловой кислотой. Несколько
миллилитров хлороформного извлечения вносят в пробирку и выпаривают
досуха. К сухому остатку прибавляют 2 мл воды, 1 мл раствора
диазотированной сульфаниловой кислоты и 0,5 мл 5 % раствора
гидроксида натрия. Появляется вишнево-красное окрашивание.
Раствор диазотированной сульфаниловой кислоты: в мерную колбу на 100 мл вносят 5
мл раствора сульфаниловой кислоты (4,5 г сульфаниловой кислоты и 45 мл
концентрированной хлористоводородной кислоты в 500 мл воды). Колбу охлаждают
льдом и прибавляют 2,5 мл 10 % раствора нитрита натрия. Смесь оставляют на льду 5
мин, затем прибавляют еще 10 мл 10 % раствора нитрита натрия, взбалтывают,
9
оставляют на льду в течение 5 мин и объем раствора доводят водой до метки.
Реакция с реактивом Марки. К сухому остатку прибавляют 5-10 капель
реактива Марки. Появляется оранжевое окрашивание, переходящее в
темно-коричневое.
Реакция с сульфатом меди. К сухому остатку прибавляют 1 мл 10 %
спиртового раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают на кипящей
водяной бане 10 минут. После охлаждения вносят 25 % раствор серной
кислоты до рН = 4-5. Затем прибавляют 1 мл хлороформа и 2 капли 10%
раствора сульфата меди. Хлороформный слой приобретает зеленоватожелтую окраску.
Качественные реакции на метафос
Реакция с о-дианизидином и перборатом натрия. Сухой остаток
растворяют в 1 мл ацетона, прибавляют 0,5 мл 3 % свежеприготовленного
ацетонового раствора о-дианизидина и 2 мл 1,25 % свежеприготовленного
раствора пербората натрия. Через 5—30 мин раствор приобретает желтое
или красноватое окрашивание. Чувствительность реакции повышается при
рН=10-11.
Реакция с сульфатом меди. Методику см. выше. Хлороформный слой
приобретает лимонно-желтое окрашивание.
Обнаружение ФОС методом ТСХ в частных системах растворителей
На стартовую линию хроматографической пластинки наносят в виде
точек исследуемое хлороформное извлечение и растворы метчиков в
хлороформе
(ДДВФ хлорофоса, мета-фоса, карбофоса). Пластинку
хроматографируют в системе растворителей гексан: ацетон (2:1). Условия
хроматографирования и значения Rf указаны в табл. 1. После подъема
растворителя на 10 см пластинку вынимают из камеры, высушивают при
комнатной температуре до полного испарения растворителей и ФОС
проявляют соответствующими реактивами.
Проявление серосодержащих ФОС (карбофос, метафос) Пластинку
опрыскивают 0,5 % раствором хлорида палладия в 1% растворе
10
хлористоводородной кислоты. Карбофос проявляется без нагревания в
виде пятен желтого цвета. При нагревании пластинки в течение 10 мин в
сушильном шкафу при 90—100°С появляется коричневато-желтое пятно
метафоса.
Пластинку
обрабатывают
раствором
бромфенолового
синего,
содержащим нитрат серебра. Появляются лиловые (сиреневые) пятна на
синем фоне. Затем пластинку нагревают 20 мин в термостате при 60°С и
после охлаждения для обесцвечивания фона опрыскивают 10% раствором
уксусной кислоты. Карбофос и метафос проявляются в виде пятен
лилового цвета.
Раствор бромфенолового синего, содержащий нитрат серебра: к 10 мл 0,5 % раствора
бромфенолового синего в ацетоне прибавляют 90 мл 0,5% раствора нитрата серебра в
смеси воды и ацетона (1:3). Полученный раствор сохраняют в темном месте, пригоден к
применению 15 суток.
Проявление метафоса. Пластинку обрабатывают 5 % спиртовым
раствором гидроксида натрия, нагревают 5—10 мин в термостате при 100110°С. Появляются пятна лимонно-желтого цвета.
Проявление ДДВФ и хлорофоса. Пластинку обрабатывают 1 % раствором
резорцина в 5 % растворе гидроксида натрия. Через 1-2 мин проявляется
ДДВФ в виде пятна красно-розового цвета (оранжевого). Затем пластинку
нагревают 5 мин в сушильном шкафу при 100°С. При этом проявляется
хлорофос в виде пятна красно-розового цвета (оранжевого).
Пластинку опрыскивают 1 % раствором о-толидина в ацетоне и облучают
УФ-светом. Через 2—5 мин ДДВФ и хлорофос проявляются в виде пятен
голубовато-синего цвета.
11
Таблица 1.
Условия хроматографического исследования ФОС и значения их Rf
Наименование
ФОС
хлорофос
ДДВФ
карбофос
метафос
хлорофос
ДДВФ
карбофос
метафос
Сорбент
СилуфолUV-254
Сорбфил
Система растворителей
гексан:ацетон
хлороформ
бензол
2:1
0,05
0,10
0,26
020
0,32
0,12
0,50
0,36
0,60
0,60
0,58
0,70
0,05
0,14
0,09
0,02
0,10
0,20
0,40
0,23
0,13
0,50
0,50
0,58
Контрольные вопросы.
1. Значение пестицидов.
2. Какие методы выделения и очистки используют для пестицидов?
3. Напишите формулы и химические названия фосфорорганических
ядохимикатов – хлорофоса, дихлофоса, метафоса, карбофоса.
4. Каково токсикологическое значение и метаболизм ФОС в
организме?
5. Каковы симптомы отравления и механизм действия ФОС на
организм?
6. Каковы методы определения активности холинэстеразы в крови?
7. Как доказать наличие фосфора в исследуемых соединениях?
Укажите условия, приведите химизм.
8. Какие химические реакции используются для обнаружения
хлорофоса, дихлофоса, метафоса, карбофоса при химикотоксикологических исследованиях? Приведите условия и химизм.
9. Укажите условия хроматографического разделения и обнаружения
ФОС при их совместном присутствии (ТСХ-скрининг ФОС).
12
Литература
1.
Белова
А.В.
Руководство
к
практическим
занятиям
по
токсикологической химии.— М.: Медицина, 1976. 232 с.
2 Швайкова М.Д. Токсикологическая химия.— М.: Медицина, 1975. 256 с.
3.Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия.— Киев: Вища школа,
1989.—447 с.
4. Туркевич Б.М. Анализ ядохимикатов.— М.: Химия, 1978. 263 с.
5. Серко С.А. Рекомендации по ветеренарно-санитарной экспертизе мяса и
молока
на
наличие
остаточных
пестицидов. Л., 1987. 35 с.
13
количеств
фосфорорганических
ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ФОСФОРСОДЕРЖАЩИХ ПЕСТИЦИДОВ
Учебно-методическое пособие для студентов 5 курса
фармацевтического факультета
Печатается в авторской редакции
Компьютерная верстка – авторская
Подписано к печати ___________ Формат 60×841/16.
Бумага писчая. Гарнитура «Таймс». Печать офсетная.
Усл. печ. л. _____. Уч.-изд. л. ____. Тираж 300 экз. Заказ _____
Издательство Нижегородской государственной
медицинской академии
603005, Н.Новгород, пл. Минина 10/1
Полиграфический участок НижГМА
603005, Н.Новгород, ул. Алексеевская, 1.
14