биологическая химия - Астраханский Государственный

АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра органической,
биологической и физколлоидной
химии
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Методические указания к выполнению
лабораторного практикума по биохимии.
ЧАСТЬ I
ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ
РАБОТЕ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
При работе в биохимической лаборатории студент
должен соблюдать следующие правила:
1. Не загромождать свое рабочее место оборудованием, не
относящемся к выполняемой работе. Перед началом
практической работы подготовить рабочее место –
расставить все необходимое в таком порядке, чтобы это
обеспечивало быстрое и точное выполнение работы.
2. Проверить чистоту посуды.
3. Опыты проводить в строгом соответствии с описанием.
4. Прежде, чем взять вещество для опыта, надо обратить
внимание на этикетку, внимательно прочитать ее.
5. Химические реактивы нельзя брать руками. Нужно
пользоваться
специальными
приспособлениями:
шпателями, ложечками, лопаточками.
6. Запрещается пробовать на вкус или нюхать какие-либо
вещества, пить воду из химической посуды.
7. При нагревании
вещества или реакционной смеси
необходимо: а) правильно держать колбу или пробирку –
отверстие должно быть направлено в сторону от
себя и окружающих; б) не держать пробирку рукой –
пользоваться держателями; в) разогревание вести
осторожно, слегка встряхивая содержимое пробирки.
8. Особую осторожность следует соблюдать при обращении
с концентрированными кислотами и щелочами,
огнеопасными
веществами:
а) кислоты и щелочи нельзя набирать в пипетку ртом –
необходимо пользоваться пипеткой с грушей или
цилиндром;
б) не выливать в раковину
концентрированные
кислоты
и
щелочи
без
предварительного
их
разбавления;
в)
при работе с огнеопасными веществами (эфир,
хлороформ и др.) работу проводить под тягой и вдали от
нагревательных приборов.
9. Работу с ядовитыми и сильно пахнущими веществами
проводить в вытяжном шкафу.
10. По окончанию работы рабочее место привести в
порядок.
11. При попадании на кожу кислоты, необходимо быстро
обмыть это место водой и обработать слабым раствором
уксусной кислоты.
12. При термических ожогах кожу обрабатывать спиртом.
13. При возгорании спирта, эфира и других, легко
воспламеняющихся веществ огонь нельзя тушить водой,
следует пользоваться песком.
БЕЛКИ
Белки – сложные высокомолекулярные полимерные
органические соединения, состоящие из аминокислот.
Отдельные аминокислоты связаны друг с другом через
пептидную связь
|-СО-NH-|. В образовании пептидной
связи
участвуют
карбоксильная
группа
одной
аминокислоты и аминогруппа другой, при этом
происходит отщепление воды.
-СO-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-NHR1
R2
R3
где R1, R2, R3 – остатки аминокислот.
Различают первичную, вторичную, третичную и
четвертичную структуры белка. Последовательность
аминокислотных остатков в пептидной цепи образует
первичную структуру белка, спирализация полипептидной
цепи – вторичную, свертывание спирали в глобулу –
третичную
структуру белка. Для ряда белков
расшифрована их структурная организация.
Белки подразделяются на простые (протеины),
состоящие только из аминокислот, и сложные (протеиды),
содержащие, кроме аминокислот, другие небелковые
вещества, например, углеводы, липиды, нуклеиновые
кислоты и др.
Белки выполняют разнообразные функции в
организме: пластическую (построение тканей и органов),
каталитическую
(ферментативную),
транспортную,
механическую, иммунную и др. Основные проявления
жизни связаны с белками.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ.
При
взаимодействии
белка
с
отдельными
химическими
веществами
возникают
окрашенные
продукты реакции. Образование их обусловлены
присутствием в молекуле белка той или иной
аминокислоты, т.е. определенной химической группировки
обуславливающей ход реакции. Поэтому и вещества не
белковой природы, но имеющие те же химические
группировки, могут давать эти реакции.
Различают и так называемые универсальные цветные
реакции, свойственные всем белкам – это биуретовая и
нингидриновая реакции.
По цветным реакциям можно доказать белковую
природу вещества, обнаружить наличие или отсутствие
отдельных аминокислот. Кроме того, разработаны методы
количественного определения белков и аминокислот, в
основе которых лежат цветные реакции.
1.БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ.
Биуретовая реакция является универсальной на
пептидную связь в белках. Вещества, имеющие в своем
составе не менее 2-х пептидных связей дают эту реакцию.
H
C N
O
Реакция состоит в том, что в щелочной среде в
присутствии сернокислой меди белки и полипептиды дают
сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание в
зависимости от длины пептида вследствие образования
комплексных соединений меди с пептидной группой.
Продукты гидролиза белков (пептоны) могут давать
розовое, красное окрашивание.
Названа эта реакция так потому, что ее дает и биурет,
содержащий также пептидные связи. Биурет, имеющий две
группировки -СО-NH-, образуется при нагревании сухой
мочевины с отщеплением аммиака:
O
O
H2N C NH2 + H2N C NH2
O
O
- NH3
H2N C
N
H
C
NH2
Мочевина
Биурет
Группа, образующая пептидную связь |-CO-NH-|, в
щелочной среде присутствует в своей таутомерной енольной
форме:
O
OH
C N H
C N
H
Щелочная среда приводит к появлению отрицательного
заряда вследствие диссоциации ОН- группы, благодаря этому
кислород взаимодействует с медью с образованием
солеобразной связи, а медь в свою очередь с атомами азота
связана через дополнительно координационные связи за счет
использования их неподеленных электронных пар. Это ведет
к образованию стабильного комплекса. Схематично реакцию
можно представить так:
N
H
H
C
CO
H
C
N
H
R1
CO
R2
H
C
C
H
C
CO
N
H
C
C
H
C
CO
R4
OH
R1
N
H
R3
OH
N
N
H
OH
N
R2
H
C
C
R3
OH
N
H
C
C
R4
R2
Cu(OH)2
2
C
N
C
H
C
N
HC
NaOH
R1
CH
N
O
O
Cu
C
R3
ONa
+
4 HOH
N
HC
C
R4
ONa
N
Биуретовый комплекс
В пробирку налить 1мл раствора белка, 1-2мл 10%
NaOH и 1-2 капли раствора сернокислой меди (1%). При
взбалтывании появляется фиолетовое окрашивание.
Образуется Cu•Na протеинат. Проделать тот же опыт,
заменив NaOH чистой водой.
2.КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ.
Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в
белках
циклических
аминокислот
–
триптофона,
фенилаланина, тирозина, содержащих в своем составе
бензольное ядро.
Реакция носит название от греч. слова Xanthos –
желтый.
Ряд
белков
при
добавлении
к
ним
концентрированной азотной кислоты при нагревании дают
желтое окрашивание, которое может переходить в оранжевое
в щелочной среде.
OH
OH
HNO3
NO2
O2N
H
C C COOH
H2
NH2
Динитротирозин (желт.цв.)
H
C C COOH
H2
NH2
Тирозин
Реакция вызвана нитрованием бензольного ядра указанных
циклических аминокислот. Образуется нитросоединения
желтого цвета.
При подщелачивании возникает хиноидная структура,
окрашенная в оранжевый цвет.
O
O
OH
N
O2N
ONa
N
NaoH O2N
O
O
CH2
H
C COOH
NH2
Хиноидная форма
динитротирозина
CH2
H
C COOH
NH2
Натриевая соль
динитротирозина
хиноидной структуры (оранжевого
цвета)
протекает
реакция
нитрования
Аналогично
триптофана.
Ксантопротеиновую реакцию дают почти все белки.
Ксантопротеиновая реакция обуславливает появление
желтого окрашивания при попадании концентрированной
азотной кислоты на кожу, ногти. Эту реакцию могут давать и
более простые ароматические соединения (например,
фенолы).
Исключение составляют клупеин и сальмин (из
группы протаминов) и желатина, в молекуле которых почти
полностью отсутствуют ароматические аминокислоты.
К раствору белка 1мл прилить 5-6 капель
концентрированной азотной кислоты, белок выпадает в
осадок.
При
подогревании
(осторожно)
раствор
окрашивается в желтый цвет. После охлаждения в пробирку
наливают по каплям 10% раствор едкого натра до появления
оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой
соли динитротирозина.
3. РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА.
Реакция Милона характерна для белков, содержащих
ароматическую аминокислоту тирозин.
При взаимодействии белка с реактивом Милона (р-р
азотнокислой ртути в концентрированной HNO3) образуется
осадок белка, который при нагревании окрашивается в
красно-коричневый цвет.
OHg
O
OH
N
+
HNO3 + HgNO3
H
C C COOH
H2
NH2
Тирозин
Тирозин
O
+ 2 HOH
H
C C COOH
H2
NH2
Ртутная соль динитротирозина
(красно-коричневого цвета)
Реакция вызвана присутствием в белке фенольной
группы тирозина, после взаимодействия с реактивом Милона
образуется ртутная соль нитропроизводного.
Реакцию Милона дают все белки, за исключением тех,
CH2 CH COOH O
+
C
NH 2
H
N
C
OH
COOH COOH
CH2 CH
N
NH 2
C
HO
CH
CH2
NH 2
N
COOH
O H2SO4
молекулы которых не содержат тирозина (желатин, клупеин
и др.).
Реактив Милона дает окрашивание почти со всеми
фенолами.
К раствору белка 1-2 мл прилить 5-6 капель реактива
Милона. Осадок белка при нагревании окрашивается в
красно-коричневый цвет, вследствие образования ртутной
соли нитрозина. Следует избегать прибавления избытка
реактива Милона, поскольку он содержит азотную кислоту,
которая при взаимодействии с белком может дать желтое
окрашивание (ксантопротеиновую реакцию), маскирующее
реакцию Милона.
4. РЕАКЦИЯ АДАМКЕВИЧА.
Эта реакция обусловлена присутствием в молекуле
белка триптофана и его взаимодействием с глиоксиловой
кислотой. Если к раствору белка добавить незначительное
количество глиоксиловой кислоты и концентрированной
серной
кислоты,
развивается
красно-фиолетовое
окрашивание.
Реакция обусловлена конденсацией
триптофана с альдегидами с образованием окрашенных
продуктов.
В качестве источника глиоксиловой кислоты может
служить ледяная уксусная кислота, в которой всегда имеются
небольшие количества глиоксиловой кислоты.
Триптофан
Глиоксиловая кислота
продукт конденсации триптофана с глиоксиловой кислотой
(красно-фиолетовый цвет)
К раствору белка 1 мл прилить 1 мл
концентрированной уксусной кислоты. Осторожно, сильно
наклонив пробирку, по стенке прибавить 1 мл
концентрированной серной кислоты так, чтобы жидкости не
смешивались. На границе между ними появляется краснофиолетовое кольцо.
5.РЕАКЦИЯ НА СЕРУ В БЕЛКАХ (РЕАКЦИЯ ФОЛЯ).
Реакцию Фоля дают белки, содержащие цистин и
цистеин.
Если к раствору белка добавить крепкой едкой
щелочи, уксуснокислого свинца и прокипятить, развивается
темное окрашивание. При кипячении белка со щелочью
слабосвязанная сера указанных аминокислот отщепляется и
образуется сернистый натрий, который вступает во
взаимодействие с уксуснокислым свинцом с образованием
сернистого свинца черного цвета:
Цистеин
Сирин
CH2
CH2 OH
SH
CH2 NH2
+ 2NaOH
CH2 NH2
+ Na2S +
H2O
COOH
COOH
Уксуснокислый свинец реагирует со щелочью с
образованием плюмбита натрия:
(CH3COOH)2Pb
+ 2 NaOH
Na2S + Pb(ONa)2 +
2 HOH
Pb(ONa)2 + 2 CH3COOH
PbS + 4 NaOH
Сернистый натрий при взаимодействии с плюмбитом
образует осадок сернистого свинца черного цвета:
К раствору белка 1 мл прилить 2-3 мл 10% едкого
натрия и вскипятить. В горячий раствор прибавить
небольшое количество уксуснокислого свинца. Раствор
темнеет, образуя черный осадок сернистого свинца.
Метионин, как известно, хотя и содержит серу, но
этой реакции не дает (сера прочно удерживается метильной
группой).
6.РЕАКЦИЯ ПАУЛИ (ДИАЗОРЕАКЦИЯ).
Раствор белка, содержащий в своем составе
аминокислоты тирозин и гистидин, при обработке
диазореактивом в щелочной среде образует окрашенное в
оранжевый цвет соединение.
Реакция обусловлена тем, что названные выше
аминокислоты имеют подвижные атомы в ароматической
части радикала, за счет которых они и вступают в реакцию
азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой
(диазореактивом).
Образованием
азосоединения
и
обусловлено
появление окраски.
H2 H
C C
SO3 Na
SO3 Na
COOH
N
NH2
+
OH
+
- 2 HOH
N
H
N
N
HO
OH
äèàçî ðåàêòèâ
O
S
N
ãèñòèäèí
O
N
äèàçî ðåàêòèâ
NH2
H2
C C COOH
H
N
N
-
N
N
N
N
H
ONa
O
S
O
ONa
àçî ñî åäèí åí èå (î ðàí æåâî ãî öâåòà)
Протекающие при этом реакции можно записать
следующим образом:
К 4-5 каплям раствора белка добавляют 4 капли
раствора соды и 8-10 капель диазореактива. Образуется
азосоединение оранжевого цвета.
7. РЕАКЦИЯ САКАГУШИ
Она обнаруживает в белке аминокислоту аргинин,
которая в присутствии гипобромида (NaBrO) теряет
аминогруппу, а продукт окисления конденсируется с
нафтолом, образуя вещество красного цвета.
Происходящие при этом реакции можно представить
следующей схемой:
NH2
C
NH
C
NaOBr
NH
NH2
- NaBr
+
(CH2)3
HC
COOH
O
O
NH
(CH2)3
HC
H
NH2
NH2
OH
COOH
C
NH2
N
H
(CH2)3
H
C
COOH
NH2
+ HOH
К 1 мл раствора белка добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора
едкого натра, 0,5 мл 0,1%-ного раствора
-нафтола и
содержимое пробирки перемешивают.
Добавляют 0,5 мл раствора гипобромида натрия и
наблюдают появление продукта конденсации красного цвета.
8. НИНГИДРИРОНОВАЯ РЕАКЦИЯ.
Реакция нингидрина с аминокислотами используется
для
обнаружения
и
количественного
определения
аминокислот.
Нингидрин, являющийся сильным окислителем,
вызывает окислительное дезаминирование аминокислот,
приводящее к образованию CO2, соответствующего
альдегида и восстановленной формы нингидрина (1).
O
OH
C
+ H2 N
OH
O
H
C
COOH
R
O
OH
C
O
+ NH3 + CO2 + R
C
H
H
O
Восстановленная форма нингидрина реагирует с
избытком нингидрина и NH3. При этом образуется продукт
сине-фиолетового цвета (2).
Протекающие реакции можно записать следующим
образом:
O
O
OH
OH
+
NH3 +
HO
H
O
O
O
HC N
O
+
3 HOH
O
O
окрашенный продукт конденсации
К 1 мл белка добавляют 2 мл водного 1% р-ра
нингидрина и кипятят. Образуется осадок сине-фиолетового
цвета.
МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ И РЕАКТИВЫ
1. 1% раствор яичного белка.
2. Водный раствор исследуемого белка.
3. NaOH, 10%-ный раствор, 30%-ный раствор.
4. CuSO4, 1%-ный раствор.
5. Азотная кислота, конц.
6. Реактив Милона: в 57 мл конц. HNO3 растворяют
40 г ртути сначала на холоду, а затем слабо
нагревая на водяной бане. Полученный раствор
разбавляют двумя объемами воды, дают
отстояться и сливают с осадками.
7. CH3COOH, конц.
8. Уксуснокислый свинец, 5-10%-ный раствор.
9. Na2CO3, 10%-ный раствор.
10. NH4OH, конц.
11.
–нафтол, 0,1%-ный раствор.
12. Гипобромит натрия.
13. Диазореактив.
14. H2SO4, конц.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2
РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ.
ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ.
1. ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ СУЛЬФАТОМ АММОНИЯ.
Важным фактором устойчивости белков в растворе
является наличие около частиц белка гидратной
оболочки. Если к раствору белка прибавить соли,
например (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl и др., то вследствие
разрушения водных оболочек частицы белка обычно
слипаются друг с другом, укрупняются и выпадают в
осадок. Разные белки высаливаются при неодинаковых
концентрациях одних и тех же солей. Глобулины,
например, осаждаются в полунасыщенном растворе
сернокислого аммония, тогда как альбумины – в
насыщенном растворе этой соли. Высаливание белков
является обратимой реакцией. Денатурации белков при
этом не происходит.
Наливают в пробирку 1-1,5 мл раствора белка,
добавляют равный объем насыщенного раствора
сульфата аммония. Наблюдают выпадение белого
хлопьевидного осадка глобулинов. Мутную жидкость
фильтруют через сухой складчатый фильтр. К фильтрату
добавляют при перемешивании избыток сульфата
аммония в порошке до прекращения его растворения.
Появляется муть или хлопья выпадающих в осадок
альбуминов. К осадку добавляют 2-3 кратное по объему
количество воды и убеждаются в способности осадка к
растворению.
2. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СПИРТОМ.
Спирт дегидратирует белки, вследствие чего происходит
их коагуляция, агрегация и осаждение. Реакция осаждения
белков спиртом при непродолжительном контакте его с
белком обратима.
В пробирку наливают около 2 мл раствора белка,
добавляют несколько кристалликов NaCl и по каплям
этиловый спирт до образования хлопьев. После оседания
хлопьев белка, сливают жидкость над ними, к осадку
приливают воду, наблюдая растворение белка.
3. ОСАЖДЕНИЕ
БЕЛКОВ
СОЛЯМИ
ТЯЖЕЛЫХ
МЕТАЛЛОВ.
Соли тяжелых металлов, например CuSO4, HgCl2,
(CH3COO)2Pb и др., осаждают белки из растворов
необратимо, что связано с образованием белковометаллических нерастворимых в воде комплексных
соединений. При этом белки денатурируют. Такой белок
теряет способность выполнения свойственной ему функции.
Изменяется при этом и физико-химические его свойства,
белок теряет свою растворимость. Процесс денатурации, как
правило, необратим.
В пробирку наливают около 2 мл раствора белка и
прибавляют медленно по каплям раствор соли тяжелого
металла (1%-ного раствора сульфата меди или 5%-ного
раствора ацетата свинца).
Наблюдают коагуляцию белка. Выпавшие хлопья от
прибавления воды не растворяются.
4. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ
КИСЛОТАМИ.
Трихлоруксусная кислота является специфическим
реактивом на белок. Она осаждает только белки и не
осаждает продукты распада белка и аминокислоты, поэтому
ею пользуются для полного удаления белков из
биологических жидкостей (например, сыворотки крови,
молока). В этих условиях продукты распада белков остаются
в растворе.
В пробирку наливают 2-3 мл раствора белка и добавляют
несколько капель 5%-ного раствора трихлоруксусной
кислоты. Наблюдают выпадение осадка белка.
5.ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ НАГРЕВАНИИ.
При нагревании белки денатурируют. Денатурация
сопровождается
изменением структуры белковых молекул с нарушением
соотношения гидрофильных и гидрофобных групп в сторону
увеличения последних. Такое изменение структуры молекул
приводит к потере нативных свойств белка, в том числе к
потере его растворимости. В пробирку наливают 3-5 мл
раствора яичного белка , вставляют в нее термометр и
раствор нагревают до образования хлопьев. Замечают , при
какой температуре образовались хлопья. Проверяют реакцию
на обратимость.
Белок не выпадает в осадок, если среда, в которой он
растворен, будет сильнокислая или сильнощелочная.
Белковая молекула будет нести определенный заряд –
положительный в кислой среде и отрицательный – в
щелочной среде. При этом устойчивость белка повышается в
результате электростатических сил отталкивания, и белок не
выпадает в осадок.
В четыре пробирки налить раствор белка. Во вторую
добавить несколько капель разведенной уксусной кислоты, в
третью – крепкой ледяной уксусной кислоты, в четвертую –
несколько капель щелочи. Все четыре пробирки
прокипятить. Отметить изменения.
Пробирку с крепкой уксусной кислотой осторожно
нейтрализовать щелочью, отметив изменения.
МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ И РЕАКТИВЫ.
1. 1% раствор яичного белка;
2. (NH4)2SO4, насыщенный раствор;
3. (NH4)2SO4, кристалл;
4. NaCl, кристалл;
5. Этиловый спирт;
6. CuSO4, 5%-ный раствор;
7. ZnSO4, 5%-ный раствор;
8. (CH3COO)2Pb, 5%-ный раствор;
9. Трихлоруксусная кислота, 5%-ный раствор;
10. CH3COOH, конц.
11. NaOH, 10%-ный раствор.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3
РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ
ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ.
Разделение
аминокислот
методом
хроматографии на бумаге проводится с целью
идентификации
аминокислот,
находящихся
в
растворе.
Определение свободных аминокислот важно
для изучения обмена белков в организме. В норме в
плазме крови и в моче содержится определенное
количество аминокислот. При нарушении функции
отдельных органов или физиологических систем
(недостаточная функция печени, усиленный распад
белков, ослабление выделительной функции почек и
т.д.) в сыворотке, а иногда и в моче наблюдаются
изменения в содержании аминокислот и в
аминокислотном составе.
Метод основан на различной растворимости
отдельных
аминокислот
в
двух
частично
смешивающихся жидкостях, одной из которых
является
вода,
другой
–
водонасыщенный
органический растворитель (смесь бутилового спирта
с уксусной кислотой). Водная фаза неподвижна, так
как в данном случае вода сорбирована на инертном
носителе-целлюлозе, которая в насыщенной влагой
атмосфере (хроматографической камере) удерживает
до 20% воды, оставаясь внешне сухой; подвижной
фазой является насыщенный водой органический
растворитель.
Чем
больше
растворимость
аминокислоты в водной фазе и меньше – в
органическом растворителе, тем медленнее движется
аминокислота
по
бумаге
с
органическим
растворителем. По ходу передвижения растворителя
смесь аминокислот будет разделяться, причем те из
них, которые растворяются в органическом
растворителе лучше, продвигаются вдоль бумаги
дальше, те же, которые растворяются в нем хуже,
делают
более
короткий
путь.
Поэтому
местоположение вещества на хроматограмме зависит
от его коэффициента распределения – а:
а= концентрация вещества в подвижной фазе
концентрация вещества в неподвижной фазе
В распределительной хроматографии важен
подбор
такого
органического
растворителя
(подвижная фаза), при котором различны значения
«а» для отдельных компонентов смеси.
В свою очередь от «а» зависит коэффициент
скорости движения – Rf (retention factor – фактор
удерживания),
который
легко
определить
практически:
Rf=
концентрация вещества в подвижной фазе
концентрация вещества в неподвижной фазе
Rf данного вещества зависит не только от качества
растворителя (его состава, рН), но и от температуры среды и
качества используемой бумаги (плотность, толщина и др.).
Поэтому очень важно хроматографию проводить при
определенной и постоянной температуре (200-220) и
пользоваться только предназначенной для хроматографии
бумагой.
Rf является характерной величиной для каждой
аминокислоты и постоянен для данных условий опыта.
Поэтому им широко пользуются при идентификации веществ
при их анализе методом распределительной хроматографии
на бумаге. Для этого сравнивают Rf
аминокислот
исследуемой смеси с Rf известных стандартных
аминокислот.
Основные
преимущества
хроматографи-ческого
метода – простота, точность данных при незначительных
количествах исследуемых веществ (десятые и сотые доли
миллиграмма), быстрота и возможность одновременно
проводить большое количество анализов.
Для разделения смеси аминокислот вырезают полоску
хроматографической бумаги длиной 15-16 см и шириной 1,5
см, в зависимости от величины хроматографической камеры,
в которой проводится хроматографирование. В качестве
хроматографической камеры могут использоваться большие
пробирки, стеклянные цилиндры. Хроматографическую
бумагу можно брать только пинцетом. Один из концов
полоски «заостряют», отрезая от него кусочки ножницами, и
на нем проводят простым карандашом линию на расстоянии
2 см от края. Этот конец бумаги зажимают между двумя
стеклянными пластинками и проводят стеклянной палочкой,
смоченной раствором смеси аминокислот, по начерченной
линии. После подсыхания полоски вновь наносят порцию
аминокислот. Эту процедуру повторяют 3-4 раза.
На дно хроматографической камеры осторожно, не
смачивая стенок, наливают из пипетки 1-2 мл смеси
бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:5).
Конец хроматограммы, где не нанесена смесь
аминокислот, прикрепляют с помощью иголки к пробке,
которой плотно закрывают хроматографическую камеру, при
этом заостренный конец хроматограммы должен быть
погружен в растворитель на 1 см, полоска со смесью
аминокислот не должна касаться растворителя (рис.1).
Хроматографирование проводят в течение 1,5-2 часов. За это
время проявитель пройдет по хроматограмме путь снизу
вверх, равный примерно 10 см. Затем хроматограмму
вынимают из камеры, отмечают границу фронта
продвижения растворителя (делают надрезы ножницами
слева и справа) и высушивают под тягой. На высушенную
хроматограмму наносят с помощью пульверизатора 0,5%
раствор нингидрина в ацетоне так, чтобы вся хроматограмма
была равномерна (без подтеков) смочена раствором. Как
только ацетон испарится, хроматограмму помещают в
сушильный шкаф при температуре 700С на 15 минут.
Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных
(синих или фиолетовых) пятен, расположенных на разных
расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.
Рис.1. Упрощенный прибор для распределительной
хроматографии на бумаге.
1- пробка, 2- иголка, 3- фронт растворителя, 4пробирка, 5- полоска хроматографической бумаги, 6- место
нанесения смеси аминокислот, очерченное карандашом, 7растворитель.
При нагревании смеси аминокислот с раствором
нингидрина
происходит
распад
аминокислоты
с
образованием
двуокиси
углерода,
аммиака
и
соответствующего альдегида, при этом нингидрин
восстанавливается.
Восстановленной
нингидрин
конденсируется с аммиаком и окисленной молекулой
нингидрина, образуя окрашенный продукт сине-фиолетового
цвета.
O
NH2
OH
R C COOH +
H
O
нингидрин
аминокислота
O
R C
+ CO2
H
альдегид
OH
+
NH3
+
O
OH
H
O
восстановленный
нингидрин
O
O
OH
OH
+
NH3 +
HO
H
O
O
O
O
N
H
+
3 OH2
O
O
окрашенный продукт конденсации
Идентификацию аминокислот осуществляют по
значению Rf . Для этого измеряют с точностью до
миллиметра расстояние, пройденное проявителем от линии
нанесения аминокислот до границы фронта проявителя. С
такой же точностью измеряют расстояние
от точки
нанесения аминокислот до центра цветного пятна. Путем
деления величины пути, пройденного аминокислотой на
хроматограмме,
на
величину
пути,
пройденного
проявителем, находят значение коэффициента Rf.
Таким же образом вычисляют Rf для стандартных
известных аминокислот (хроматограммы с известными
аминокислотами ставятся параллельно). И сравнивая Rf
известных аминокислот с Rf аминокислот смеси, определяют
последние.
ЗНАЧЕНИЕ Rf АМИНОКИСЛОТ
(при температуре 200С)
АМИНОКИСЛОТА
Растворитель бутанол-уксусная кислота: вода.(4: 1: 5)
Цистин
0,04
Цистеин
0,05
Аспарагиновая кислота
0,24
Глутаминовая кислота
Серин
Лизин
Глицин
Треонин
Гистидин
Аланин
Тирозин
Валин
Метионин
Лейцин
Фенилаланин
Изолейцин
Аргинин
0,28
0,22
0,14
0,25
0,29
0,16
0,36
0,45
0,50
0,50
0,69
0,66
0,68
0,18
МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И РЕАКТИВЫ.
1. Смесь аминокислот. Аминокислоты растворяют в
концентрации около 0,04 М. Можно использовать
следующие сочетания аминокислот:
а) глютаминовая кислота – 60 мг,
аланин – 40 мг,
лейцин – 50 мг;
б) глютаминовая кислота – 60 мг,
глицин – 40 мг,
аланин – 40 мг;
в) аспарагиновая кислота – 60 мг,
серин – 40 мг,
лейцин – 60 мг;
г) аспарагиновая кислота – 60 мг,
глицин – 40 мг,
лейцин – 60 мг.
Указанное количество кислот растворяют в 10 мл
воды. Для ускорения растворения аминокислот можно
растворять их при нагревании.
2. Нингидрин, 0,5% раствор в ацетоне.
3. Бутанол.
4. Уксусная кислота ледяная.
ОБОРУДОВАНИЕ
1.
2.
3.
4.
5.
Сушильный шкаф.
Пульверизаторы.
хроматографические камеры.
Хроматографическая бумага.
Стеклянные пластинки и палочки.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ПО
МЕТОДУ ЛОУРИ.
Метод основан на измерении интенсивности окраски,
которую дает раствор белка в цветных реакциях:
биуретовой и реакции Фолина.
При взаимодействии белка со щелочным раствором
медного купороса образуются комплексные соединения
(биуретовая реакция), которые своими тирозиновыми и
цистеиновыми радикалами восстанавливают смесь
фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой
кислот с образованием комплексного соединения синего
цвета (реакция Фолина).
Интенсивность окраски комплекса, которая зависит от
количества белка в исследуемой пробе, измеряется на
фотоэлектроколориметре с красным фильтром. В работе
используются следующие реактивы:
А – 2%раствор Na2CO3 в 0,1 н NaOH;
В – 0,5% раствор CuSO4*5 H2O в 1% растворе
виннокислого среднего Na, K;
С – щелочной раствор меди, полученный сливанием
50 мл реактива А и 1 мл реактива В (в день определения);
Е – реактив Фолина (приготовленный разводят в 2
раза).
Чтобы определить содержание белка в исследуемой
пробе, необходимо построить калибровочную кривую. Для
построения калибровочной используют ряд растворов
бычьего альбумина с известными концентрациями. Для этого
берут 10 мг альбумина растворяют в 10 мл, концентрация
полученного исходного раствора белка – 200 мг/мл. Из этого
раствора готовят разбавленные растворы. Для этого
наливают в пробирку указанное в таблице количество белка
и воды.
К 1 мл каждого разбавленного раствора добавляют 5
мл реактива С. Смесь перемешивают, и через 10 минут
приливают к ней 0,5 мл раствора Е. Через 30 минут измеряют
оптическую плотность каждого раствора на ФЭКе с красным
светофильтром, и строят график – калибровочную кривую,
откладывая по горизонтальной оси (абсциссе) известные
концентрации, а по вертикальной оси (ординате) –
соответствующие им значения оптической плотности (рис.2).
Приготовление разбавленных растворов
№
пробирки
1
2
3
4
5
6
7
Концентрация
р-ра белка (мкг
в 1 мл)
40
60
80
100
120
140
160
Количество
исходного рра белка в мл
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Количество
Н2О в мл
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
Затем к 1 мл исследуемого раствора белка добавляют
реактивы С и Е в таком же количестве и порядке, как и при
построении калибровочной кривой и находят оптическую
плотность этого раствора. Найденную величину оптической
плотности исследуемого раствора белка откладывают на оси
ординат и проводят прямую линию параллельно оси абсцисс
до пересечения с калибровочной кривой. Из точки
пересечения проводят линию параллельно оси ординат. В
точке пересечения с осью абсцисс находят концентрацию
белка, соответствующую данной оптической плотности
раствора.
МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И РЕАКТИВЫ.
1. Бычий альбумин;
2. Na2CO3, 2% раствор;
3. NaOH, 0,1 н раствор;
4. Na2C4H4O6 или K2C4H4O6, 0,1% раствор;
5. Медный купорос, 0,5% раствор;
6. Реактив Фолина 100 г Na2WO4*2H2O и 25 г
Na2MoO4*2H2O растворяют в 700 мл воды в
круглодонной
колбе
на
1
л,
снабженной
пришлифованным
холодильником
Либиха.
Прибавляют 50 мл 85% фосфорной кислоты и 100 мл
соляной кислоты (конц.). Помещают в колбу
несколько капилляров. Смесь кипятят в колбе с
обратным холодильником в течение 10 часов. Далее
прибавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и
несколько капель брома. Не пользуясь более
обратным холодильником, кипятят содержимое колбы
в течение 15 минут для удаления избытка брома (под
тягой). Раствор охлаждают, доводят водой до объема
1 л и фильтруют через стеклянный фильтр.
Хранят реактив Фолина в склянке из темного стекла.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
АМИННОГО
АЗОТА
МЕТОДОМ ФОРМАЛЬНОГО ТИТРОВАНИЯ.
Аминокислоты в молекуле белка соединены между
собой посредством пептидных связей. Эти связи
можно расщепит при помощи ферментов и под
воздействием концентрированных кислот и щелочей
при высокой температуре. При этом происходит
гидролиз, т.е. расщепление его на полипептиды, и в
конечном итоге, на аминокислоты. При гидролизе
белка происходит нарастание количества свободных
аминных и карбоксильных групп. По нарастанию
количества этих групп можно судить о степени
гидролиза белка.
Аминным азотом называют азот свободных аминных
групп, содержащихся в аминокислотах, полипептидах
и белках.
По приросту аминного азота можно следить за
скоростью гидролиза белков, определить конец
гидролиза.
Определение аминного азота проводится в процессе
хранения, а также при технологической обработке
рыбы.
Определение его необходимо также при изучении
обмена белков и аминокислот в организме.
Аминокислоты – амфотерные электролиты, поэтому в
водных растворах они преимущественно находятся в
виде внутренних солей:
H
R C COOH
NH2
_
H
R C COO
+ NH3
Вследствие этого непосредственное титрометрическое
определение аминных и карбоксильных групп в
молекулах аминокислот практически невозможно.
Поэтому перед титрованием раствор, содержащий
аминокислоты,
обрабатывают
раствором
формальдегида, способного связывать свободные
аминогруппы
с
образованием
метиленовых
производных аминокислот (Шиффовые основания).
H
H
R C COOH + O C
H
NH
2
H
R C COOH
N CH2
+
OH2
После такой обработке карбоксильные группы можно
оттитровать раствором щелочи:
H
R C COOH + NaOH _
OH2
N CH2
H
R C COONa
N CH2
Считают, что количество карбоксильных групп
эквивалентно
количеству
аминных
групп,
нейтрализованных щелочью.
Ход работы.
Подготовка пробы:
Навеску рыбы (фарш) не более 4 г переносят в
мерную колбу на 200-250 мл (объем и навеску
записать) и наливают дистиллированной воды 1/3
колбы.
Тщательно перемешивают содержимое колбы,
помещают ее в кипящую водяную баню на 5 минут.
После этого колбу с содержимым охлаждают и
доводят до метки дистиллированной водой.
Для удаления осадка скоагулировавшего белка
раствор фильтруют через складчатый фильтр.
Определение аминного азота:
Титрование проводят параллельно в 3-х конических
колбах емкостью 300 мл.
1 колба: определяем кислотность фильтрата:
В коническую колбу емкостью 300 мл отмеряют
пипеткой 20-25 мл фильтрата (объем пипетки записать),
добавляют 0,4 мл индикатора №1 и 1 мл индикатора №2.
Титруют 0,2 N раствором NaOH.
Конец титрования определяют по изменению синей
окраски до зеленой.
2 колба: определяем аминный азот:
В колбу пипеткой отмеряют 20-25 мл фильтрата (той
же пипеткой, что и первую колбу), из бюретки под тягой
добавляют 10 мл формалина и 1 мл индикатора №2. Титруют
0,2 N раствором NaOH. Конец титрования определяют по
переходу желтой окраски раствора в фиолетовую.
3 колба: определяем кислотность формалина:
В
колбу
пипеткой
отмеряют
20-25
мл
дистиллированной воды (объем воды равен объему взятого
выше фильтрата), добавляют 10 мл формалина и 1 мл
индикатора №2.
Титруют 0,2 N раствором NaOH. Конец титрования
определяем также, как во второй колбе.
Расчет ведут по формуле:
,
(б-а-в) к 2,8 Vк 100
gVпипетки
Х – результат определения аминного азота в мг %.
g - навеска исследуемого вещества в г.
2,8 – количество мг азота, эквивалентное 1 мл 0,2 N
раствора NaOH.
а, б, в, - результаты титрования колб №1,2,3.
К
–
поправочный
коэффициент
точности
приготовленного раствора 0,2 N NaOH.
Хмг%=
Определение аминного азота проводим:
1. В исходной пробе.
2. В той же рыбе, выдержанной в термостате
несколько часов, сутки при Т=37-400С.
Сделать вывод о том, как изменится аминный азот в
процессе термостатирования рыбы.
ИССЛЕДУЕМЫЕ МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ.
1. Формалин, 40% раствор.
2. NaOH, 0,2 N раствор.
3. Индикатор №1.
4. Индикатор №2.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6
СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ
Сложными
белками
называют
высокомолекулярные соединения, состоящие из белка
и связанной с ним какой-либо небелковой части,
называемой простетической группой.
К сложным белкам относят: нуклеопротеиды,
хромопротеиды, глюкопротеиды, фосфопротеиды и
др.
Все они играют важную биологическую роль.
К
сложным
белкам
относятся
и
двухкомпонентные ферменты.
I. НУКЛЕОПРОТЕИДЫ.
Нуклеопротеиды играют исключительно важную
биологическую роль. Они построены из белка и
нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота или
полинуклеотид
построена
из
большого
числа
мононуклеотидов.
НП
( РНП и ДНП )
БЕЛОК
НК ( РНК и ДНК )
(полинуклеотиды)
ПОЛИПЕПТИДЫ
МОНОНУКЛЕОТИДЫ
АК
НУКЛЕОЗИДЫ
ПУРИНОВЫЕ или
ПИРИМИДИНОВЫЕ
ОСНОВАНИЯ
H3PO4
РИБОЗА или
ДЕЗОКСИРИБОЗА
Итак,
конечными
продуктами
гидролиза
мононуклеотидов являются пуриновые или пиримидиновые
основания, углевод (рибоза или дезоксирибоза) и фосфорная
кислота.
Проведение гидролиза.
Берут 0,5 г свежих или 0,1 г сухих пекарских
дрожжей, заливают 4 мл 10% раствора H2SO4. Гидролиз
можно проводить в большой пробирке, которую закрывают
пробкой с вставленной в нее длинной стеклянной трубкой.
Для гидролиза необходимо нагревать пробирку примерно час
с момента закипания. По истечении времени жидкость
охлаждают и фильтруют.
Составные части нуклеопротеидов открывают путем
специальных реакций.
Биуретовая реакция на полипептиды.
Биуретовой
реакцией
устанавливают
наличие
полипептидов.
Берут 5 капель гидролизата, 10 капель 10% раствора
NaOH и 1-2 капли 1% раствора CuSO4. Развивается синефиолетовое
или
красно-фиолетовое
окрашивание,
указывающее на присутствие полипептидов. Последние
образовались в результате гидролиза белков, входящих в
состав нуклеопротеидов.
Серебряная проба на пуриновые основания.
Берут 10 капель гидролизата, добавляют 1 каплю
концентрированного раствора аммиака (чтобы создать
нейтральную среду) и 5 капель 1% раствора AgNO3. Через
несколько минут выпадает осадок серебряных производных
пуриновых оснований бурого цвета.
Реакция протекает по уравнению:
NH2
N
N
N
+ AgNO3 + NH4OH
N
H
NH2
N
N
N
+ NH4OH +
OH2
N
Ag
Проба Фелинга на углевод (рибозу и дезоксирибозу)
Первоначально получают реактив Фелинга. Для этой цели
смешивают 5 капель 7% раствора сернокислой меди и 5
капель раствора сегнетовой соли. К полученному реактиву
добавляют 5-7 капель гидролизата, перемешивают и
нагревают до кипения, выпадает осадок закиси меди
красного цвета.
Молибденовая проба на фосфорную кислоту.
К 5 каплям гидролизата добавляют 20 капель
молибденового реактива (раствор молибденовокислого
аммония в азотной кислоте) и кипятят. Появляется окраска
лимонно-желтого цвета. Охлаждают пробирку под краном,
выпадает осадок лимонно-желтого цвета за счет
комплексного образования – фосфорно-молибденовокислого аммония.
H3PO4+ 12 (NH4)2MoO4+ 21 HNO3
(NH4)3PO4 * 12 MoO3+21 NH4NO3+ 12 HOH
2. ФОСФОПРОТЕИДЫ.
Фосфопротеиды – сложные белки, простетическая
часть которых представлена фосфорной кислотой,
эфирно присоединенной к белку через остатки
оксиаминокислот (треонина, серина). Чаще всего
через серин.
Представителем фосфопротеидов может служить
казеин -белок молока.
При щелочном гидролизе эфирная связь легко
разрушается и фосфопротеид распадается на белок и
Н3РО4.
Гидролиз казеина.
В пробирку помещают несколько зернышек
казеина и 8 капель 10% раствора NaOH.
Кипятят 30 секунд, затем охлаждают пробирку и
проводят реакции на продукты гидролиза.
Обнаружение белка (биуретовая реакция).
В пробирку помещают 2 капли гидролизата и
добавляют каплю 1% раствора CuSO4.
Молибденовая проба
Оставшийся гидролизат подкисляют 5 каплями
кислоты, добавляют 5 капель молибденого реактива и
нагревают до кипения. Жидкость окрашивается в
желтый цвет, а затем выпадает желтый осадок
фосфорномолибдата аммония, указывающий на
присутствие в гидролизате Н3РО4 (может появляеться
и сине-зеленое окрашивание).
3. ГЛЮКОПРОТЕИДЫ
Это сложные белки, в состав простетической группы
которых входят углеводы и их производные.
Глюкопротеиды делятся на две большие группы.
1.
Муцины- белки слизей. Их можно найти в
слюне, в слизи, покрывающей поверхность
рыбы, в яичном белке и т.д. Эти белки
выполняют обычно защитную функцию.
2.
Мукоиды- белки, входящие в состав
костной,
хрящевой
ткани,
панцирей
ракообразных.
Углеводный компонент в белках можно обнаружить с
помощью реакции Молиша.
Выделение муцинов слюны
В две пробирки собирают по 1 мл слюны и добавляют в
каждую по каплям 1% раствор CH3COOH до появления
сгустков муцина. Осадок муцина в пробирках осторожно
промывают водой, придерживая сгусток. С полученным
муцином проделывают два опыта.
Обнаружение белка (биуретовая реакция)
К сгустку муцина добавляют 5-6 капель 1% раствора CuSO4
и 10-15 капель 10% раствора NaOH.
Проба на углеводы
К сгустку муцина добавляют 5-6 капель 0,2% раствора αнафтола,
смешивают
и
осторожно
добавляют
концентрированную серную кислоту (по стеночке,
подслаивая). На границе раздела двух
жидкостей
появляется фиолетовое окрашивание. Рекция обусловоена
тем, что в простетической части муцина имеются углеводы
(моосахариды), которые под влиянием H2SO4 превращаются
в оксиметилфурфурол, а последний с α-нафтолом дает
окрашенное соединение.
МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ И РЕАКТИВЫ
1. Пекарские дрожжи
2. Серная кислота, 10% раствор
3. Реактив Фелинга I и II
4. NH4OH, концентрированный
5. AgNO3, 1-2% раствор
6. Молибденовый реактив
7. NaOH, 10% раствор
8. СuSO4, 1% раствор
9. Казеин
10. СН3СООН, 1% раствор
11. α- нафтол, 0,2% раствор
12. Н2SO4, концентрированная