УДК - BioFact

УДК 582.71.734.4:581.14.6
М. В. КИТАЕВА, А. В. ЗУБАРЕВ
ПОЛУЧЕНИЕ АСЕПТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР POTENTILLA RUPESTRIS L.
И POTENTILLA RECTA L. КАК ОБЪЕКТОВ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ
И ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ
Центральный ботанический сад НАН Беларуси, Минск
Введение. В настоящее время сохранение, пополнение, научное и практическое использование
биологического разнообразия мировых растительных ресурсов, состояние которых в природе
вызывает серьезное опасение, – одни из актуальнейших задач ботанических садов. Особенно это
касается эндемичных и редких видов растений, для которых в силу биологических особенностей
восполнение вида естественным путем затруднено, а культивирование в полевых условиях в
производственных масштабах проблематично. Перенос из места произрастания многих видов
растений невозможен опять же в силу их биологических особенностей: плохой всхожести семян,
низкой жизнеспособности проростков растений из-за неподходящих климатических условий.
Перечисленные факторы затрудняют возделывание лекарственных и ценных декоративных видов
растений, представителей как культурной, так и дикорастущей флоры [1].
К таким растениям относятся изучаемые нами представители рода Potentilla L. лапчатка скальная
(Potentilla rupestris L.) и лапчатка прямая (Potentilla recta L.), которые были интродуцированы в ГНУ
«Центральный ботанический сад НАН Беларуси» в 1957 г.
Лапчатка скальная (Potentilla rupestris L.) – многолетнее травянистое растение с толстым
деревянистым корневищем. Высота растения 30–60 см. Цветет в мае–июне, плодоносит в июле–
августе. Произрастает на территории Беларуси в широколиственно-сосновых лесах [2]. Входит в
Список редких и находящихся под угрозой исчезновения видов диких животных и дикорастущих
растений, включаемых в Красную книгу Республики Беларусь 2004 г. (Постановление Минприроды
РБ № 14 от 09.06.2004).
Лапчатка прямая (Potentilla recta L.) – многолетнее лекарственное травянистое растение. Высота
растения 30–70 см. Цветет в июне–июле, плодоносит в июле–августе. На территории Республики
Беларусь встречается редко, произрастает по склоновым суходолам, залежам, сухим соснякам [3]. Ее
корневища используются для лечения и профилактики дизентерии, при язвенных колитах, гастритах,
холециститах, циррозе печени. Лапчатка оказывает бактерицидное, противовоспалительное и
кровоостанавливающее действие. Эфирное масло лапчатки прямой очень высоко ценится в народной
медицине Тибета и Китая как сильное противовирусное, противомикробное, антиаллергическое,
болеутоляющее средство [4].
В результате проведенных ранее исследований было выявлено, что оба вида, произрастающие в
центральной почвенно-климатической зоне Республики Беларусь, обладают повышенной способностью к
биосинтезу соединений фенольной природы, таких как флавоноиды и дубильные вещества [5, 6].
При решении проблемы сохранения генофонда растений успешно используются методы биотехнологии
растений, включающие микроклональное размножение. Использование методов размножения in vitro
представляет собой важную дополнительную возможность для сохранения этих проблемных видов в
ботанических садах [7]. Культуры клеток и тканей растений благодаря сохранению способности
изолированных клеток к биосинтезу вторичных метаболитов в высоких концентрациях являются
источником биологически активных веществ, необходимых для жизнедеятельности человека [8].
Цель работы – изучить возможность использования метода культуры тканей и клеток для
получения асептических культур P. rupestris L. и P. recta L., которые помогут решить задачи,
связанные с сохранением биологического разнообразия данных видов и станут новыми источниками
важных групп биологически активных веществ.
Материалы и методы исследования. Объектами исследования служили семена двух видов
лапчатки: P. rupestris L. и P. recta L. Для введения в культуру in vitro использовали зрелые семена
интактных растений, произрастающих на участках открытого грунта ГНУ «Центральный
ботанический сад НАН Беларуси». Семена были собраны в июле–августе 2011 г. До начала
проведения опытов они хранились в бумажных пакетиках при комнатной температуре.
Перед непосредственным получением асептических культур была изучена жизнеспособность семян по
показателю лабораторной всхожести. Всхожими считали семена, у которых длина корешка была не менее
длины семени [9].
При введении в культуру in vitro c целью повышения асептического эффекта семена сначала
выдерживали в детергенте (моющее средство Morning Fresh) в течение 20 мин с последующей отмывкой
в проточной воде. Затем их помещали в раствор, содержащий 0,01 % KMnO4, и ставили на лабораторную
качалку на 30 мин. После этого семена 1 мин обрабатывали 70 %-ным этиловым спиртом и
экспонировали в течение 20 мин в растворе 0,1 %-ного нитрата серебра с добавлением детергента Tween
80. На следующем этапе обработки семена трехкратно промывали в стерильной дистиллированной воде и
переносили на чашки Петри с безгормональной питательной средой Мурасиге–Скуга (МС). Для
прорастания семян чашки были помещены в люменостат (t = 20–24 °С, освещенность 3000 люкс, 16/8часовой фотопериод).
Проростки пересаживали в колбы на четыре типа сред (рН 5.77): 1) МС безгормональная; 2) МС с
добавлением 0,5 мг/л кинетина; 3) МС с добавлением 1 мг/л кинетина; 4) МС с добавлением 1 мг/л 6бензиламинопурина (БАП).
Инициацию каллусообразования проводили на стерильных эксплантах листового происхождения
(сегменты листовых пластинок длиной 0,5–1,0 см, листовых черешков – 1,0–1,5 см). Поверхностное
культивирование проводили на агаризованной модифицированной питательной среде MС (сахароза – 20
г/л, 2,4-дихлорфенилуксусная кислота (2,4-Д) – 0,5 мг/л, БАП – 0,1 мг/л). Каллусы выращивали в темноте
в условиях термостата при температуре 22 °С, а также на свету в люменостате при температуре 20–24 °С
и освещенности 5000 люкс с 16/8-часовым фотопериодом. Культивирование первичного каллуса
продолжалось до тех пор, пока он не становился пригодным для субкультивирования. Образовавшиеся
каллусы характеризовали по морфологическим признакам (консистенция, цвет, оводненность). Частоту
каллусообразования (%) определяли как соотношение числа эксплантов с каллусом к общему числу
неинфицированных эксплантов.
Результаты и их обсуждение. Семена изучаемых видов лапчаток (рисунок 1) имели следующие
параметры: P. rupestris L. (средняя масса одного семени – 0,28 ± 0,03 мг, длина – 1,23 ± 0,12 мм,
ширина – 0,72 ± 0,09 мм, толщина – 0,53 ± 0,04 мм); P. recta L. (средняя масса одного семени –
0,29 ± 0,05 мг, длина – 1,35 ± 0,11 мм, ширина – 1,01 ± 0,10 мм, толщина – 0,55 ± 0,06 мм). Семена
обладали физическим типом покоя В1 по классификации типов органического покоя семян [10].
А
Б
Рис. 1. Семена: А – P. rupestris L.; Б – P. recta L.
Определение лабораторной всхожести семян проводили при 22–24 °С через месяц после сбора.
Семена P. rupestris L. начинали прорастать на 9-е сутки (доля проросших семян составила 14 %).
Общая всхожесть через 3 недели составила 65 %. У P. recta L. семена начинали прорастать только на
15-е сутки (проросло два семени). Общая всхожесть составила 21 %. Наблюдения по определению
всхожести семян исследуемых видов лапчаток в лабораторных условиях проводили только в течение
одного месяца, так как вследствие развития инфекции дальнейшие наблюдения были затруднены.
Процент стерильности семян при применении 0,1 %-ного раствора нитрата серебра в течение 20 мин
составил 92 % для лапчатки скальной и 86 % для лапчатки прямой. Прорастание семян в стерильных условиях
сильно варьировалось, и период от появления первого проростка до появления последнего был сильно
растянут. Так, у P. rupestris L. первый проросток был получен на 7-е сутки, последний – на 77-е, а у P. recta L.
– на 15-е и 116-е сутки соответственно. Доля жизнеспособных семян составила 86 и 73 % соответственно.
Полученные стерильные проростки высаживали на четыре варианта сред. Отмечено, что наилучшим
вариантом среды для роста и развития оказался третий. На этой питательной среде в культуре in vitro за 3 мес.
лапчатка прямая из семени развивалась в розетку непарноперистых сложных трехраздельных листьев длиной
3,5–6,0 см (листовые пластинки с пильчатым краем, длиной 0,7–1,4 см, шириной 0,7–1,0 см). Лапчатка скальная в
этом же возрасте имела прямостоячий стебель с очередно расположенными простыми листьями 2,0–3,5 см
(рисунок 2), листовые пластинки почти круглые, 0,7–1,6 см в диаметре (на 3-м месяце развития начинали
появляться трехраздельные сложные листья). Лапчатка скальная, в отличие от прямой, имела развитую
разветвленную корневую систему. Для данного варианта среды была отмечена также активация пазушных
меристем у обоих видов лапчаток (примерно в 25 % случаев) (рис. 2, Б). Это явление имеет важное значение для
эффективного микроклонального размножения, поскольку позволяет поддерживать генетическую стабильность
размножаемых растений [11].
В вариантах с более низким содержанием кинетина и при его отсутствии ростовые показатели
были значительно ниже. Наименьшими параметры роста и развития были у стерильных культур,
выращенных на среде с добавлением БАП (рис. 2, В).
Рис. 2. А – P. rupestris L. на питательной среде МС с добавлением 0,5 мг/л кинетина; Б – активации пазушных меристем
у P. recta L. на питательной среде МС с добавлением 1,0 мг/л кинетина; В – P. recta L. на среде МС с добавлением 1,0 мг/л
БАП
Асептические растения P. rupestris L. и P. recta L. на 90-е сутки развития использовали для выделения
стерильных эксплантов и дальнейшей инициации на них каллусообразования. Цикл выращивания обоих
культур составил 40–45 сут. Культивирование сегментов листьев и черешков в условиях in vitro
позволило выявить их различную способность к каллусообразованию. Наибольшая частота каллусогенеза
(100 %) как у P. rupestris L., так и у P. recta L. наблюдалась на черешках листьев, на листовых пластинках
этот показатель был несколько ниже (от 70 до 85 %). Интенсивнее каллус формировался вблизи
проводящих тканей, поэтому более высокий потенциал к каллусогенезу наблюдался в случае сегментов
листовых черешков (рисунок 3).
Рис. 3. Каллусная культура: А – на сегментах черешка P. rupestris L.; б – на сегментах листовой пластинки P. rupestris L.
(среда МС, 0,5 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л БАП, без освещения)
Каллус, индуцированный на эксплантах листового происхождения P. rupestris L., в темноте имел светложелтую окраску, характеризовался среднеплотной консистенцией, был незначительно оводнен. Каллус,
образованный на свету, имел светлую окраску с участками светло-зеленого цвета, по консистенции и по остальным
параметрам ничем не отличался от каллуса, выращенного в темноте.
Образующийся каллус на эксплантах черешка и листовой пластинки P. recta L. в условиях
темноты имел бело-серую окраску, полупрозрачную мягкую консистенцию и отличался высокой
интенсивностью роста. Каллус, полученный в условиях освещения, относительно каллуса P. rupestris
L. был крупнее, приобретал желто-зеленый цвет, при разрезе имел мягкую вязкую консистенцию,
был значительно оводнен.
Установлено, что освещение не оказывает значительного влияния на удельную скорость роста и
частоту каллусообразования по сравнению с каллусными культурами, выращенными в темноте.
Исследуемые культуры характеризовались наличием способности к позеленению на свету, однако
освещение не приводило к изменению консистенции каллусов.
Заключение. В ходе выполнения работы нами разработаны условия введения в культуру in vitro
двух видов Potentilla L. Получены стерильные культуры интактных растений и каллусов P. rupestris
L. и P. recta L. Сделан вывод, что добавление кинетина и повышение его концентрации в
питательной среде способствовало активации пазушных меристем исследуемых растений.
Инициирован процесс каллусообразования на сегментах листовых пластинок и черешков обоих
видов в условиях темноты и освещения.
Нами продолжаются исследования по подбору фитогормонального состава среды
культивирования и физических факторов для поддержания роста и развития и дальнейшего
микроклонального размножения введенных в культуру in vitro P. rupestris L. и P. recta L. Также
ведется подбор и оптимизация состава культуральных сред для каллусогенеза, сохранения
полученного каллуса и оценки его биосинтетического потенциала как источника биологически
активных веществ фенольной природы.
Литература
1. Орлова И. Г., Атаманченко М. П. Биотехнологические методы в интродукции и сохранении биологического
разнообразия
растений
[Электронный
ресурс].
2008.
–
Режим
доступа:
http://www.rusnauka.com/
/16_NTP_2008/Biologia/34088.doc.htm. – Дата доступа: 10.02.2012.
2. Кухарева Л. В., Пашина Г. В. Справочник по итогам интродукции в Белоруссии. Минск, 1986. ─ 189 с.
3. Парфенов В. И. Определитель высших растений Беларуси. Минск, 1999. ─ 151с.
4. Орлова Л. Лечение корнем лапчатки. Минск, 2006. ─ 64с.
5. Китаева М. В., Кот А. А., Спиридович Е. В. // Трансфер инновационных биотехнологий в растениеводстве и
животноводстве. Брянск, 2011. ─ С. 25–28.
6. Рупасова Ж. А., Игнатенко В. А., Василевская Т. И. и др. // Природные ресурсы. 2001. № 1. ─ С. 135–137.
7. Fay M. // In vitro Plant Cell Dev. Biol. 1992. Vol. 28. Р. 1–4.
8. Бутенко Р. Г. Культура клеток и биотехнология. М., 1986. ─ 3с.
9. Нестерова С. В., Холина А. Б., Воронкова Н. М. // Растительные ресурсы. 1998. Т. 34. Вып.2. ─ С. 41–42.
10. Николаева М. Г., Разумова М. В., Гладкова В. Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян. Ленинград, 1985.
─ 241с.
11. Высоцкий В. А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и
селекции плодовых и ягодных растений: aвтореф. дис. … д-ра с.-х. наук. М., 1998. ─ 44с.
M. V. KITAEVA, A. V. ZUBAREV
GETTING AXENIC CULTURES OF POTENTILLA. RUPESTRIS L. И POTENTILLA. RECTA L. AS OBJECTS
MICROCLONAL PROPAGATION AND THE POTENTIAL SOURCE
OF BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES IN THE REPUBLIC OF BELARUS
Summary
In the course of scientific work we have developed conditions of introduction two species of Potentilla L. to in vitro. Axenic
cultures of P. rupestris L. и P. recta L. have been available. Draw conclusion that throwing in and increase the concentration of
kinetin in culture medium to stimulate the development of axial meristems on plants. This event can to promote effective microclonal
propagation of study species of learnt plants .