Основные типы биополимеров

Комментарии к задачам курса "Методы исследования биополимеров":
Задача 01a
(радиоактивность: удельная радиоактивность)
Условие: Рассчитать удельную активность препарата с начальной удельной активностью A Ci/mmol
после B суток хранения. Теоретическая (максимальная) удельная активность изотопа составляет C
Ci/mmol, T1/2 = D суток. Считать, что в результате радиоактивного распада содержащая распавшийся
атом молекула также распадается. Другими видами радиолиза пренебречь.
Схема решения: Из соотношения A и C определяем долю радиоактивных атомов (коэффициент
изотопного разбавления). После применения к радиоактивной части препарата закона р/а распада
определяем долю радиоактивных атомов после хранения, что позволяет, зная C, определить
удельную активность препарата после хранения.
Задача 01b
(радиоактивность: расчет необходимого количества препарата)
Условие: Даны количество биополимера (ДНК или олигонуклеотид) или объем и концентрация
реакционной смеси, коэффициент избытка радиоактивного препарата, его удельная и объемная
активности и время хранения. В более сложных вариантах задачи вместо количества или
концентрации даны оптическая плотность и коэффициент экстинции. Определить необходимый для
проведения реакции объем радиопрепарата (пояснение: как правило нужное количество
радиопрепарата перед реакцией лиофильно высушивается, так что его объем не влияет на объем
реакционной смеси).
(конкретный пример 1): Какой объем препарата -32P-ATP с начальными удельной активностью 1000
Ci/mmol и объемной активностью 20 Ci/l нужно взять в реакцию мечения фрагмента ДНК методом
достройки 5’-выступающих концов ДНК-полимеразой, если при достройке каждого из концов ДНК
включается 2 молекулы ATP. Объем реакционной смеси составляет 50 l, концентрация ДНК - 2 M,
молярный избыток -P32-ATP должен составлять 1.5. Срок хранения радиоактивного препарата
составлял 28.5 суток. Теоретическая (максимальная) удельная активность P32 составляет 9200
Ci/mmol, T1/2 = 14.3 суток. Считать, что в результате радиоактивного распада содержащая
распавшийся атом молекула также распадается.
(конкретный пример 2): Какой объем препарата -P32-ATP с начальными удельной активностью 1000
Ci/mmol и концентрацией 20 Ci/l нужно взять в реакцию мечения с использованием
полинуклеотидкиназы 0.004 о.е. 260A олигонуклеотида с 260 = 200 о.е./мкмоль/см2, если молярный
избыток -32P-ATP по отношению к олигонуклеотиду должен составлять 1.5. Срок хранения
радиоактивного препарата составлял 7 суток. Теоретическая (максимальная) удельная активность 32P
составляет 9200 Ci/mmol, T1/2 = 14.3 суток. Считать, что в результате радиоактивного распада
содержащая распавшийся атом молекула также распадается.
Схема решения: Определив количество (в молях) подлежащего мечению биополимера с учетом
стехиометрии реакции (при мечении двуцепочечного фрагмента ДНК достройкой сайтов рестрикции,
например, нужно учитывать, что метка включается с обеих концов) и требующегося молярного
избытка вычисляют необходимое количество (в молях) радиопрепарата. В более сложных вариантах
задания при этом необходимо перейти от оптической плотности к концентрации (количеству)
вещества, используя известный коэффициент экстинции. Чтобы определить необходимый объем
радиопрепарата, нужно, кроме необходимого количества, знать его концентрацию на момент
использования (после хранения). Для ее вычисления можно применить одну из следующих схем: 1)
вычислить удельную активность (см. Задачу 01a) и объемную активность (она меняется по закону
радиоактивного распада) препарата после хранения и, поделив второе на первое, получить
концентрацию; 2) определить исходную концентрацию радиоактивных и нерадиоактивных
составляющих препарата на начало хранения из объемной и удельной активностей, конечная
концентрация будет равна сумме концентраций нерадиоактивной части (она неизменна) и
уменьшенной с учетом распада концентрации радиоактивной части.
Задача 01c
(радиоактивность: расчет эффективности счетчика Гейгера)
Условие (вариант 1): При определении эффективности включения радиоактивной метки в продукт
ферментативной реакции студент использовал счетчик Гейгера. Измерив радиоактивность аликвоты
образца, нанесенной на целлюлозу, до и после отмывки невключившегося радиопрепарата, он
получил значения C0 и C1 CPS соответственно, на основании чего студент определил эффективность
включения как C1/C0. Прав ли он (объясните), а если нет, то какова реальная эффективность
включения? Предельное значение CPS (CPS следующих подряд без пауз импульсов) использованного
счетчика составляет Cmax, импульсы считать равномерно распределенными во времени.
Условие (вариант 2): Измерив радиоактивность образца, нанесенного на целлюлозу, с
использованием двух разных счетчиков Гейгера (с различными предельными значениями CPS),
студент получил разные значения. Почему? Какое значение он получил на счетчике с пределом
Cmax2 CPS, если на счетчике с пределом Cmax1 CPS получилось C1 CPS? Импульсы считать
равномерно распределенными во времени.
Условие (вариант 3): Руководитель попросил студента определить среднюю радиоактивность N
образцов с использованием счетчика Гейгера, измеряя радиоактивность каждого образца отдельно.
Для экономии времени студент поместил все образцы на детектор счетчика одновременно и разделил
результат на количество образцов, получив при этом Cstud CPS. Правильно ли он поступил (почему)?
Какое значение он бы получил, если бы послушался руководителя, при условии, что образцы были
абсолютно одинаковыми. Предел использованного счетчика составляет Cmax CPS, импульсы считать
равномерно распределенными во времени.
Схема решения: Эффективность счетчика Гейгера определяется, помимо геометрических (доля
телесного угла, в котором происходит регистрация) и физико-химических (гашение) факторов,
которые в данной задаче не учитываются, соотношением времени формирования разряда ("периода
нечувствительности") и среднего времени между регистрируемыми импульсами, иными словами,
долей частиц, попадающих в колбу в момент формирования или тушения разряда (они не
регистрируются). Время формирования и тушения разряда можно оценить как величину, обратную
предельному значению CPS данного счетчика (если считать, что при этом разряды следуют один за
другим непрерывно). Тогда доля незарегистрированных частиц будет равна отношению времени
разряда к среднему времени между импульсами (разрядами), которое, в свою очередь, можно
вычислить как величину, обратную показаниям счетчика (числу импульсов в одну секунду – CPS). А
эффективность счета, в свою очередь, равна доле зарегистрированных частиц или (1 - доля
незарегистрированных частиц). Таким образом, каждой паре CPS(i):CPS(max) соответствует своя
эффективность счета. Зная эффективность регистрации, можно определить общее число попавших в
колбу частиц (их количество обратно пропорционально эффективности счета), на основании
которого можно корректно сравнивать радиоактивность разных образцов. Более сложные варианты
(2 и 3) предполагают также решение обратной задачи – определение показаний счетчика (CPS) при
попадании в колбу известного числа частиц в единицу времени. Эти величины связаны простой
алгебраической зависимостью (в которую также входит предельное значение CPS счетчика), легко
получаемой, если выразить связь "реальной" и "измеренной" интенсивности потока через
эффективность счета и решить полученное уравнение относительно "измеренной" интенсивности.
Задача 02a
(детекция: количество ДНК по результатам электрофореза)
Условие: Оценить суммарное количество (по массе) ДНК плазмиды, содержащей
вставку, выделенное из бактериальной культуры, по результатам окрашивания EtBr
геля агарозы после аналитического электрофореза продуктов гидролиза части
препарата эндонуклеазой рестрикции, вырезающей вставку из состава плазмиды.
Длина плазмиды (pBlueScript) без вставки 3000 н.п. На гель наносили 1/60
выделенной плазмиды по массе. В качестве маркера используется гидролизат
плазмиды pQpR’(длина интактной плазмиды около 7000), содержащий фрагменты
следующих длин: 1326 919 762 587 540 504 458 434 307 267 234 213 184 124
88 80 54 52 21 18. Электрофорез <дата>, препарат <№>.
Схема решения: Длину фрагмента анализируемого препарата можно оценить из
сравнения его подвижности с подвижностями ближайших фрагментов маркера
известных длин, при этом допустимо использовать линейную аппроксимацию
(вместо аппроксимации в логарифмических координатах длины). На приведенном
примере длина фрагмента примерно 458+(504-458)*1/3 = 470.
Для ПРИБЛИЗИТЕЛЬНОЙ(!) оценки количества ДНК следует выбрать среди
фрагментов маркера тот, интенсивность которого наиболее близко соответствует
интенсивности фрагмента анализируемого препарата (на приведенном примере это
фрагмент 762). Массу выбранного фрагмента легко определить, зная суммарную
массу гидролизата (указана на фото электрофореза) и длину выбранного фрагмента,
поскольку все фрагменты содержатся в гидролизате в эквимолярных количествах и
масса каждого пропорциональна его длине. После определения таким образом
примерной массы вырезаемого эндонуклеазой фрагмента остается только определить
массу полной плазмиды, которая во столько же раз больше массы фрагмента, во
сколько длина исходной плазмиды больше длины фрагмента. Следует учесть, что в
некоторых препаратах вырезается несколько фрагментов, - для расчета можно
использовать любой из них. Полученную массу плазмиды следует умножить на 60,
т.к. анализу подвергали 1/60 препарата. Следует еще раз отметить, что оценка по
интенсивности окраски EtBr является весьма приблизительной (погрешность может
достигать сотен %) и никакое сравнение интенсивностей, кроме выявления примерно
одинаковых, без применения специальных методов регистрации невозможно.
Задача 03а
(электрофорез: зависимость скорости от напряженности)
Условие (вариант 1): При проведении электрофореза в камере длиной L1 см в течение T1 час при
напряжении V1 V длина миграции лидирующего красителя составила X1 см. Какое время необходимо
вести электрофорез в камере длиной L2 см при напряжении V2 V если длина миграции лидирующего
красителя должна составить X2см ?.
Условие (вариант 2): При проведении электрофореза в камере длиной L1 см в течение T1 час при
напряжении V1 V длина миграции лидирующего красителя составила X1 см. Какое напряжение
необходимо установить в камере длиной L2 см чтобы лидирующий краситель мигрировал за то же
время на X2 см ?
Условие (вариант 3): При проведении электрофореза в камере длиной L1 см в течение T1 час при
напряжении V1 V длина миграции лидирующего красителя составила X1 см. Какое расстояние
пройдет лидирующий краситель за то же время в камере длиной L2 см при напряжении V2 V?
Схема решения: Учитывая, что пройденное красителем расстояние равно произведению времени на
скорость миграции, а скорость миграции пропорциональна напряженности эл. поля, а она, в свою
очередь, определяется отношением напряжения к длине камеры, решение данной задачи сводится к
расчету соответствующих пропорций.
Задача 03b
(электрофорез: ширина зон при изотахофорезе)
Условие: При проведении изотахофореза смеси 3х однозарядных анионов с концентрациями C1, C2 и
C3 и подвижностью u1, u2 и u3 соответственно ширина зоны образца до начала электрофореза
составляла 1 см. Какова будет ширина зон после достижения равновесия, если концентрация
лидирующего аниона CL, его подвижность - uL, а подвижность общего катиона - uK? Площадь
поперечного сечения системы и концентрация лидирущего аниона постоянны.
Схема решения: Для вычисления концентраций в зонах после их полного формирования
(достижения равновесия) следует использовать зависимость соотношения концентраций анионов в
соседних зонах от их подвижностей и подвижности катиона. Можно поочередно определить
концентрации зон, начиная с ближайшей к зоне лидирующего аниона, концентрация которого
считается неизменной. На самом деле порядок и число зон не влияют на их концентрации, которые
зависят только от соотношения подвижностей аниона, составляющего зону, и лидирующего
(почему?). После определения равновесной концентрации ширину зоны легко определить, зная
исходную ширину и концентрацию, и учитывая, что ширина (пропорциональная объему при
неизменном сечении) обратно пропорциональна концентрации (следствие закона сохранения
вещества ).
Задача 04a
(диссоциация электролитов: заряд молекул при разных pH)
Условие (вариант 1): pKa одноосновной кислоты составляет 4.0. Каков будет средний заряд
молекулы этой кислоты (в зарядах электрона) при pH 3.0? pH 4.0? pH 5.0? pH 6.0?
Условие (вариант 2): Вещество содержит две ионогенные группы: кислоту с pKa 3.0 и основание с
pKa 7.0. При каком pH это вещество не будет иметь заряда? Какова при этом степень диссоциации
ионогенных групп?
Условие (вариант 3): При проведении электрофореза содержащего 2 ионогенные группы (кислоту с
pKa 4.0 и основание с pKa 7.0) вещества при pH 7.0 в камере длиной 40 см в течение 4 час при
напряжении 120 V длина миграции анионов составила 30 см. Сколько времени надо вести
электрофорез при 90 V для достижения той же длины миграции при pH 8.0? pH 6.0?
Схема решения: Считая, что равновесные концентрации форм связаны с Ka выражением
Ka 
[ A ][ H  ]
(это выражение удобно логарифмировать), а [H+] дано в условии (поскольку задано
[ AH ]
значение pH), легко определить соотношение концентраций диссоциированной (A-) и
недиссоциированной (AH) форм, и долю, которую составляет концентрация диссоциированной форм
от концентрации всех форм (степень диссоциации). Поскольку это одновременно и доля времени
пребывания молекулы в заряженном состоянии, то эффективный заряд будет равен ее произведению
на зарядовое число (для однозарядных анионов 1). При наличии других ионогенных групп нужно
сложить эффективные заряды каждой из них с учетом знаков. Обратите внимание, что для
оснований приведены константы диссоциации сопряженной кислоты, т.е. константы процесса
BH+  B + H+ (что удобнее для оснований – акцепторов H+, например, аминогрупп, о которых, как
правило, и идет речь). При решении варианта 2 необходимо определить pH, при котором степень
диссоциации кислоты и протонирования основания одинаковы, приравняв соответствующие
выражения. Вариант 3 является, фактически, комбинацией задач 04a и 03а и в части определения
скорости миграции при электрофорезе полностью аналогичен задаче 03а. Следует только учесть, что
подвижность пропорциональна эффективному зарядовому числу, которое в данном случае будет
отлично от 1.
Задача 04b
(диссоциация электролитов: буферная емкость)
Условие (вариант 1): Определить время, в течение которого можно вести электрофорез в
горизонтальном аппарате с буфером TBE (50mM Tris pKa = 8.2, 40mM H3BO3 pKa1 ~ 8.5; pH буфера
= 8.4) при токе 20mA (0.02A) при условии изменения pH электродных камер не более чем на a) 1.0 b)
2.0. Объем каждой электродной камеры считать равным 0.3 л. Число Фарадея = 96500 A*сек / г-экв.
Условие (вариант 2): Определить время, в течение которого можно вести электрофорез в
горизонтальном аппарате с буфером TAE (40mM Tris pKa = 8.2, 20mM CH3COOH pKa = 4.75; pH
буфера = 8.2) при токе 50mA (0.05A) при условии изменения pH электродных камер не более чем на
a) 1.0 b) 2.0. Объем каждой камеры считать равным 0.3 л. Число Фарадея = 96500 A*сек / г-экв..
Условие (вариант 3): Определить время, в течение которого можно вести электрофорез в
горизонтальном аппарате с буфером TSE (25mM Tris pKa = 8.2, 30mM HOCH2CH(NH2)COOH
(Serine) pKa1 = 9.21, pKa2 = 2.20; pH буфера = 8.65) при токе 50mA (0.05A) при условии изменения
pH электродных камер не более чем на a) 1.0 b) 2.0. Объем каждой электродной камеры считать
равным 0.6 л. (Число Фарадея = 96500 A*сек / г-экв. ).
Условие (вариант 4,5,6): Более сложные варианты задач полностью аналогичны 1, 2, 3, за
исключением того, что задан только начальный состав, но не начальный pH буфера. Последний
также необходимо определить.
Схема решения: Считая, что равновесные концентрации форм связаны с Ka выражением
Ka 
[ A ][ H  ]
(удобно логарифмировать), а [H+] известно (поскольку задано значение pH), из
[ AH ]
соответствующих уравнений материального баланса можно определить концентрации
диссоциированной (A-) и недиссоциированной (AH) форм при заданном значении pH (обратите
внимание, что для оснований приведены константы диссоциации сопряженной кислоты, т.е.
константы процесса BH+  B + H+ , что удобнее для оснований – акцепторов H+, например,
аминогрупп, о которых, как правило, и идет речь). Далее остается вычислить эти концентрации при
изменившемся на заданное значение в ту или иную сторону pH и определить, сколько заряженных
частиц (H+ или OH- ) необходимо ввести в систему для получения таких концентраций. Это
количество равно разности конечных (при "новом" pH) и начальных (при исходном pH)
концентраций всех заряженных частиц с учетом их знаков, умноженной на объем системы (одной
камеры). Число заряженных частиц связано с произведением тока (дан в условии) и времени его
пропускания законом Фарадея, что дает возможность легко вычислить искомое время. Для
вычисления ответа необходимо выбрать ту из двух камер (анодную или катодную), в которой pH
изменится быстрее (для соответствующего изменения pH необходимо меньше заряженных частиц).
Иногда нужную камеру можно выбрать без вычислений, например в варианте 2 это будет катодная,
поскольку буферная емкость Tris при исходной pH=pKa одинакова при любом направлении
изменения pH, а буферная емкость уксусной кислоты увеличивается при закислении (приближении
pH к pKa). Более сложные варианты задачи, в которых неизвестно исходное значение pH,
предполагают определение последнего из состава буфера. Для этого необходимо решить систему
уравнений, связывающих равновесные концентрации с pKa и суммарными концентрациями
электролитов (уравнения равновесия и уравнения материального баланса). При этом следует учесть,
что равновесные концентрации H+ и OH- достаточно малы (не более 10-5 при pH от 5 до 9), по
сравнению, например, с концентрациями анионов и Tris, чтобы ими можно было пренебречь в тех
местах, где они складываются с суммарными концентрациями электролитов (или вычитаются из
них). С учетом этого допущения вышеупомянутая система уравнений для двухкомпонентного буфера
(примеры 1 и 2) сводится к одному квадратному уравнению, положительный корень которого и дает
искомое решение. Для трехкомпонентного буфера (пример 3) можно пренебречь концентрацией
одной из форм компонента с pKa2 = 2.20 , поскольку при pH в диапазоне 6-9 ее доля будет
существенно меньше 10-3. При этом дальнейший ход решения аналогичен таковому для
двухкомпонентной системы.
Задача 05a
(центрифугирование: коэффициент седиментации)
Условие: Для полного осаждения частиц в роторе Beckman SW 65 Ti (Swing bucket, rmin=41.2mm,
rmax=89.0mm) из полностью заполненной пробирки требуется 1 час при 30000 об/мин. Определить
коэффициент седиментации частиц в S. Сколько времени потребуется для полного осаждения частиц
в роторе Beckman SW 55 Ti (Swing bucket, rmin=60.8mm, rmax=108.5mm) при 40000 об/мин?
Схема решения: Применив формулу, связывающую расстояние частицы от оси вращения на
заданный момент времени с начальным расстоянием, угловой скоростью и коэффициентом
седиментации, к частице, которая в начальный момент времени находилась на поверхности образца (
r0 = rmin ), и которая за время центрифугирования согласно условию тоже достигла дна ( r1 = rmax ),
легко получить коэффициент седиментации (обратите внимание, что по условию задачи его нужно
выразить в Сведбергах ). Тот же подход используется и при решении второй части задачи, только
теперь неизвестно время при известном коэффициенте седиментации.
Задача 05b
(центрифугирование: градиент плотности)
Условие: При формировании градиента концентрации CsCl равновесным центрифугированием в
роторе Beckman VTi 80 (Vertical, rmin=57.9mm, rmax=71.1mm) при 60000 об/мин диапазон
концентраций составил 0.3 – 6.0 М. Определить макс. концентрацию CsCl в градиенте, полученном в
роторе Beckman VTi 65.2 (Vertical, rmin=74.4mm, rmax=87.9mm) при 40000 об/мин если минимальная
концентрация составила 0.2 М?
Схема решения: Используя выражение, связывающее концентрации равновесного градиента с
расстоянием соответствующих зон от оси вращения, а также с условиями центрифугирования, можно
по результатам первого эксперимента получить отношение S/2D, которое определяется свойствами
вещества, формирующего градиент, и остается неизменным при изменении условий
центрифугирования. Остается только воспользоваться еще раз тем же самым выражением для
вычисления искомой концентрации во втором эксперименте.
Задача 05c
(центрифугирование: эффективность разделения скоростной седиментацией)
Условие: Определить эффективность разделения скоростной седиментацией (% более легких частиц,
не попадающих в осадок “тяжелых” при полном осаждении последних) смеси частиц с константами
седиментации 100S и 200S, равномерно заполняющей цилиндрическую пробирку, в роторах Beckman
SW 65 Ti (Swing bucket, rmin=41.2mm, rmax=89.0mm) при 25000 об/мин и Beckman SW 60 Ti (Swing
bucket, rmin=63.1mm, rmax=120.3mm) при 15000 об/мин.
Схема решения: Применив формулу, связывающую радиус частицы на заданный момент времени с
начальным радиусом, угловой скоростью и коэффициентом седиментации, к частице с б'ольшим S,
которая в начальный момент времени находилась на поверхности образца ( r0 = rmin ), и которая за
время центрифугирования согласно условию тоже достигла дна ( r1 = rmax ), легко получить время,
необходимое для полной седиментации более тяжелых частиц. Затем с использованием той же
зависимости необходимо определить минимальный радиус, имея который (или б'ольший) легкие
частицы также успеют достигнуть дна за время центрифугирования. Считая пробирку
цилиндрической (пренебрегая закруглением дна), можно оценить долю попадающих в осадок легких
частиц, как отношение объемов (или высот ) соответствующих цилиндров: объема, из которого
частицы успеют достигнуть дна к общему объему пробирки.
Задача 06a
(хроматография: основные понятия)
Условие: Объем удержания и ширина пика для веществ A и B с коэффициентами распределения KDA
= 0.6 и KDB = 1.4 составили соответственно VRA = 2.4 мл, WA = 0.2 мл, VRB = 5.2 мл, WB = 0.3 мл.
Определить объем носителя (мертвый объем) и объем сорбента использованной хроматографической
системы, а также коэффициент разделения и степень разделения веществ.
Схема решения: Как следует из названия, для решения данной задачи необходимы лишь выражения,
определяющие соответствующие "основные понятия", а также выражение VR(i) = V0 + KD(i)VS . При
известных KD и VR для двух разных веществ V0 и VS не составляет труда определить, решив
элементарную систему двух линейных уравнений. KC = KD(2) / KD(1) (или наоборот ) по
определению. Вся необходимая информация для вычисления степени разделения RS (в соответствии с
определением) в условии задачи также имеется.
Задача 06b
(хроматография: параметры хр. системы по результатам эксперимента)
Условие: Преподаватель попросил студента разделить хроматогафией смесь 2х веществ, отбирая
фракции, концентрации в которых были не менее ½ максимальных. При скорости элюции 1.2 мл/мин
максимум пика первого вещества вышел через 24 минуты после нанесения образца, а второго – через
32 минуты. Суммарные объемы отобранных студентом фракций составили соответственно 1.4 и 1.9
мл. Определить свободный (мертвый) объем системы (V0), эффективное число теоретических тарелок
(Nэфф, считать его одинаковым для разделяемых веществ), а также коэффициент разделения (Kc) и
степень разделения (Rs) веществ.
Схема решения: Фактически в условии даны координаты максимумов (время удержания) и ширины
пиков по уровню 0.5макс., т.е. имеется вся необходимая информация для вычисления степени
разделения RS (в соответствии с ее определением). Используя информацию о том, что Nэфф для
обоих веществ одинаковы, можно легко вычислить свободный объем системы (V0), приравняв
соответствующие выражения для Nэфф(1) и Nэфф(2) и решив получившееся уравнение относительно
V0 .После этого останется только подставить найденное значение в выражение для Nэфф любого из
веществ. Зная RS и Nэфф, можно определить Kc, используя выражение зависимости RS от Nэфф.