1.Генерация активных форм кислорода

1.Генерация активных форм кислорода
Воспаление, радиация, увеличение содержания кислорода, озона и NО2
в окружающей среде, старение, временная гипоксия ткани (например, в
результате спазма сосуда) и последующая реоксигенация увеличивают
вероятность образование активных форм кислорода.
Наибольшее
количество
АФК
в
процессе
нормального
функционирования клеток образуется в дыхательной цепи митохондрий.
Считается, что от 1 до 4% потребляемого дыхательной цепью митохондрий
кислорода превращается в АТФ [1]. Со времен Варбурга, т.е. с 20-х годов XX
столетия интерес к изучению роли митохондрий в канцерогенезе не угасал до
середины 70-х годов, пока не было показано существование онкогенов и
впоследствии генов-супрессоров. Однако в последние годы интерес к
изучению роли митохондрий в канцерогенезе появился опять. С одной
стороны, это связано с тем, что только нарушением регуляции экспрессии
или структуры онкогенов и генов-супрессоров не всегда можно объяснить
возникновение
опухоли.
Кроме
того
некоторые
ранее
полученные
экспериментальные данные не могли быть объяснены существующими
гипотезами. Так, например, цитоплазма опухолевых клеток поддерживает
опухолевый фенотип при слиянии с ядром нормальных клеток [ 2 ]. Это
свидетельствовало, что цитоплазматические факторы ответственны за
опухолевый
фенотип.
Из
цитоплазматических
структур
на
роль
«канцерогенного фактора» более всего подходит митохондрия. Показано, что
митохондриальный
стресс,
вызванный
различными
воздействиями
(исчерпанием митохондриальной ДНК, введением митохондриальных ядов
типа разобщителя дыхания и фосфорилирования), вызывает прогрессию
опухолевого фенотипа, выраженной в появлении инвазии в клетках, не
обладающих инвазивностью, а также устойчивостью к апоптозу [3] [4] [5].
Одним
из
возможных
механизмов
нарушения
функционирования
митохондрий, приводящее к митохондриальному стрессу, может быть
повышенное при канцерогенных воздействиях образование АФК. В пользу
того, что избыточное образование АФК в митохондриях является фактором
канцерогенной опасности, являются эксперименты по изменению уровня
АФК в митохондриях [6].
Для некоторых типов канцерогенов показано, что они вызывают
повышенное образование АФК в дыхательной цепи митохондрий и этим
может быть обусловлено их промоторное действие.
Широко используются в качестве опухолевых промоторов соединения,
принадлежащие к классу форболовых эфиров. Показано, что по своей
структуре эти вещества являются структурным аналогом диацилглицеролов –
естественных активаторов протеинкиназы С. Считается, что способность
активировать протеинкиназу С является первой стадией промоторного
действия
форболовых
эфиров.
Однако
каким
образом
активация
протеинкиназы С приводит к промоции было не известно. В тоже время на
культуре
было
продемонстрировано,
что
антиоксиданты
подавляют
промоторное действие форболовых эфиров, что говорит об АФК-зависимом
действии этого класса промоторов. Анализ путей образования АФК при
действии форболовых эфиров привел авторов статьи [7] к заключению, что
они образуются в митохондриях. Недавно было показано, что наиболее
эффективный опухолей промотор семейства форболовых эфиров – форбол12-миристат-13-ацетат,
вызывает
транслокацию
протеинкиназы
С
в
митохондрии в различных типах клеток. Транслокация сопровождалась
усилением киназной активности протеинкиназы С, изменение морфологии
митохондрий,
падением
трансмембранного
потенциала,
уменьшением
активности комплекса 1 в дыхательной цепи митохондрий и активности
пируват дегидрогеназы. Наблюдалось увеличение образования АФК в
митохондриях [8].
Факт увеличения образования АФК в митохондриях под действие
промоторов и канцерогенная опасность образовавшихся в митохондриях
АФК на взгляд авторов статьи [2] показан достаточно убедительно. Однако
однозначного ответа на вопрос, каким образом канцерогенные вещества
вызывают усиление образования АФК в митохондриях и одинаков ли
механизм их образования для различных классов веществ, пока что нет.
Еще один источник образования АФК при действии промоторов
канцерогенеза – пролифераторов пероксисом могут являться пероксисомы –
органеллы,
в
которых
происходит
β-окисление
жирных
кислот,
сопровождаемое образованием перекиси водорода. Помимо увеличения
количества пероксисом и соответственно ферментов окисления жирных
кислот пролифераторы пероксисом индуцируют синтез изоформ цитохрома
Р450
семейства
пролифераторы
4
в
эндоплазматическом
пероксисом
ингибируют
ретикулуме.
относительную
При
этом
экспрессию
ферментов детоксикации АФК – каталазу и глутатион пероксидазу. Таким
образом, диспропорция в изменении экспрессии ферментов, синтезирующих
АФК и разрушающих их, приводит к кислородному стрессу [2].
2. Биологический эффект, вызываемый АФК в клетках
АФК в клетках вызывают различные биологические преобразования.
Изменяются свойства мембран, в них появляются гидрофильные зоны, через
которые проникает вода (а также Са2+, Na+), вызывая набухание клеток и
изменение их внутреннего состава. Кислородные радикалы могут легко
повреждать ДНК и таким образом вызывать мутации. Возможно, эти
радикалы участвуют во многих стадиях канцерогенеза in vivo, что обычно
требует длительного воздействия. В настоящее время установлено, что ткани,
пораженные
воспалением,
образуют
повышенные
количества
супероксидного радикала (O−
2 ). Общей основой всех этих явлений является
биологическое или химическое действие кислородных свободных радикалов
[9].
Также образуется малоновый диальдегид — химически очень активное
вещество, своими альдегидными группами взаимодействует с NН2-группами
белков, вызывая их необратимую денатурацию.
АФК несут также и положительные эффекты – такие как активация
разобщающих белков, регулирующая продукцию АТФ, и передача сигналов
роста через тирозин – киназы. При пониженном содержании в атмосфере
супероксидных радикалов животные и человек заболевают, а при длительном
их отсутствии гибнут. Обнаружена еще одна роль АФК – компенсаторная
регуляция активности клеточной дыхательной цепи через активацию
репликации митохондриальной ДНК [10] [11].
Среда, окружающая живые микроорганизмы, характеризуется, как
правило,
окислительными
условиями,
а
внутриклеточное
состояние
поддерживается в области восстановительных значений. Это очень важно для
жизнедеятельности клеток, поскольку его нарушение может сопровождаться
повышением уровня активных форм кислорода. Поддержание нормального
редокс - состояния внутри клеток играет существенную роль в таких
процессах, как синтез ДНК, экспрессия генов, ферментативная активность и
другие. С другой стороны, изменения редокс - состояния внутриклеточного
содержимого и отдельных молекул, являющиеся следствием стрессовых
воздействий или результатом активности самих клеток, вовлечены в
регуляцию клеточных процессов [12].
Известно, что программированная гибель клеток (апоптоз), как
правило, сопровождается образованием значительного количества АФК. В то
же время АФК способны инициировать апоптоз в различных типах клеток
[13]. Это позволяет предполагать, что АФК могут служить для усиления
сигналов апоптоза и их передачи. Передача сигнала апоптоза играет важную
роль в терапии опухолей. Индукция апоптоза в опухоли под действием
цитотоксических химиопрепаратов или облучение могут затронуть лишь
часть клеток, а гибель остальных произойдет под действием пероксида
водорода. В этом случае могут быть уничтожены даже опухолевые клетки,
защищенные от апоптоза, вызываемого цитотоксическими препаратами [14].
1.4 Перекисное окисление липидов
При окислении жирных кислот образуются перекиси, поэтому такое
окисление липидов называют перекисным окислением липидов (ПОЛ).
Повышенный уровень ПОЛ при лейкогенезе в значительной мере связан с
прямым свободнорадикальным окислением липидов, естественным при
слабой
митохондриальной
базе,
и
возникающей
соответственно
внутриклеточной гипероксии [ 15 ]. Основным субстратом ПОЛ являются
полиненасыщенные цепи жирных кислот (ПНЖК), входящих в состав
клеточных мембран, а также липопротеинов. Их атака кислородными
радикалами (АФК) приводит к образованию гидрофобных радикалов,
взаимодействующих друг с другом [ 16 ]. Вначале происходит атака
сопряженных двойных связей ненасыщенных жирных кислот со стороны ОН∙
и
O−
2
,что
приводит
к
появлению
липидных
радикалов:
LH + ОН∙ → Н2 О + L⋅
(1)
Липидный радикал может реагировать с О2 с образованием пероксильного
радикала, который, в свою очередь, взаимодействует с новыми молекулами
ненасыщенных жирных кислот и приводит к появлению липидных
пероксидов,
которые
достаточно
стабильны
при
температуре
тела:
L⋅ + О2 → LO2−
(2)
⋅
LO−
2 + LH → LOOH + L
(3)
Скорость этих реакций зависит от активности антиоксидантной
системы клетки. При взаимодействии с комплексами железа гидроперекиси
липидов
превращаются
в
активные
радикалы,
продолжающие
окисления
цепь
липидов:
LOOH + Fe2+ → Fe(III) + ОН∙ + LO⋅
(4)
LO⋅ + LH → LOH + L⋅
(5)
Образующиеся липидные радикалы, а также 4-гидроксиноненаль и
МДА, могут атаковать молекулы белков и нуклеиновых кислот. Альдегидные
группы
этих
соединений
образуют
межмолекулярные
сшивки,
что
сопровождается нарушением структуры макромолекул и дезорганизует их
функционирование [ 17 ]. Окисление липидов приводит к нарушению
нормальной упаковки мембранного бислоя, что может вызвать повреждение
и мембраносвязанных белков. Так, например, ПОЛ может приводить к
инактивации мембранных рецепторов, а также таких ферментов, как
глюкозо-6-фосфатаза и Na/K-АТФаза, принимающая непосредственное
участие в поддержании ионного гомеостаза клетки [18].
3. 1. Антиоксидантная система клеток
Возникшая в процессе эволюции «побочная» ветвь использования
кислорода в силу своей потенциальной опасности для клеточных структур,
естественно, нуждалась в достаточном развитии защитных механизмов.
Система защиты от повреждающего действия АФК включает 2 основных
способа: неферментативный и ферментативный. Основной ферментативной
защитой от действия АФК служит супероксиддисмутаза (СОД). Этот
фермент переводит супероксидный радикал в электронейтральную форму
Н2 О2 . Судьба последней зависит от активности двух ферментов,
разрушающих молекулу, – каталазы, образующей Н2 О и О2 , и
глутатионпероксидазы, образующей глутатион. Кроме того, Н2 О2 в качестве
нейтральной молекулы может покинуть клетку. Помимо ферментных систем,
в цитоплазме присутствуют различные низкомолекулярные вещества, также
обладающие антиоксидантными свойствами. Особенностью перекисного
окисления в мембранах следует считать его цепную реакцию с разрушением
ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов мембран.
Поэтому
в
мембранах
присутствуют
собственные
липофильные
антиоксиданты, среди которых основными являются убихинон и aтокоферол.
Неферментативная защита осуществляется с помощью антиоксидантов,
веществ выступающих в качестве ловушки свободных радикалов. Эти
вещества, взаимодействуя с АФК, снижают их реакционную способность и
останавливают цепной процесс образования новых радикалов.
Также к антиоксидантам относят: Витамины А, Е, С, флавоноиды,
зеленый и черный чай, а также какао.
3.2.Антиоксиданты плазмы крови
Изучение изменения антиоксидантного статуса плазмы крови и
асцитной жидкости в ходе развития асцитной гепатомы Зайделя, позволило
бы использовать антиоксиданты в комплексной терапии на поздних стадиях
заболеваний. И использовать их для снижения цитотоксическго потенциала
фагоцитирующих клеток [19].
3.3.Влияние аминокислот
Образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в
растворах L-аминокислот в фосфатном буфере, рН 7,4, при воздействии
рентгеновского
излучения
определено
методом
усиленной
хемилюминесценции в системе люминол-р-йодофенол-пероксидаза и с
использованием флуоресцентного зонда, кумарин-3-карбоновой кислоты
соответственно. Аминокислоты по их влиянию на образование перекиси
водорода при облучении делятся на три группы: снижающие выход Н202, не
влияющие на ее образование и увеличивающие ее выход. L-аминокислоты в
концентрации 1 мМ снижают выход гидроксильных радикалов в растворе
при воздействии рентгеновского излучения, однако наибольший эффект
наблюдается в ряду: Cys > His > Phe = Met = Trp > Туr. Показано, что при
концентрациях аминокислот Cys, Туг и His близких к физиологическим
происходит существенное уменьшение выхода гидроксильных радикалов. С
помощью иммуноферментного анализа с использованием моноклональных
антител к 8-оксогуанину (8-оксо-7,8-дигидрогуанину) исследовано влияние
аминокислот с наиболее выраженными антиоксидантными свойствами (Cys,
Met, Туг, Trp, Phe, His, Lys, Arg, Pro) на образование 8-оксогуанина в ДНК in
vitro под воздействием рентгеновского излучения. Установлено, что
аминокислоты уменьшают содержание 8-оксогуанина в ДНК. Возможно, эти
аминокислоты в составе ДНК-связывающих белков защищают ДНК в клетке
от окислительных повреждений, обусловленных образованием активных
форм кислорода при умеренном окислительном стрессе [20].
1. Shertzer, H.G. TCDD decreases ATP levels and increases reactive oxygen
production through changes in mitochondrial F(0)F(1)-ATP synthase and
ubiquinone/ H.G. Shertzer, M.B. Genter, D. Shen, D.W. Nebert, Y. Chen, T.P.
Dalton// Toxicol Appl Pharmacol. – 2006. - № 217. – P. 363–374.
2. Кобляков, В.А. Механизмы опухоль-промоторного действия/ В.А.
Кобляков// Биохимия. – 2010. – Т. 75, № 6. – С. 760-769.
3. Biswas, G. Mitochondria-to-nucleus stress signaling in mammalian cells:
nature of nuclear gene targets, transcription regulation, and induced resistance to
apoptosis/ G. Biswas, M. Guha, N.G. Avadhani// Gene. – 2005. - № 354. – P. 132–
139.
4. Amuthan, G. Mitochondria-to-nucleus stress signaling induces phenotypic
changes, tumor progression and cell invasion/ G. Amuthan, G. Biswas, S. Zhang,
A. Klein-Szanto, C. Vijayasarathy, N. Avadhani //EMBO J. – 2001. – V. 20(8). –
P. 1910-1920.
5. Biswas, G. Mechanism of mitochondrial stress-induced resistance to
apoptosis in mitochondrial DNA-depleted C2C12 myocytes/ G. Biswas, H.K.
Anandatheerthavarada, N.G. Avadhani// Cell Death Differ. – 2005. – V. 12. – P.
266-278.
6. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell ruction/ W.
Droge // Physiol. Rev. - 2001. - V.82. - P. 47-95.
7. Traore, K.R. Redox-Regulation of ERK 1/2-Directed Phosphatase by
Reactive Oxygen Species: Role in Signaling TPA-Induced Growth Arrest in ML-1
Cells/ K.R. Traore, Sharma, R.K. Thimmulappa, W.H. Watson, S. Biswal, and
M.A. Trush// Journal of Cellular Physiology. – 2008. - № 216. – P. 276-285.
8. Wang, Y. Modulation of mitochondrial metabolic function by phorbol 12myristate 13-acetate through increased mitochondrial translocation of protein
kinase Calpha in C2C12 myocytes/ Y. Wang, G. Biswas, S.K. Prabu, N.G.//
Avadhani Biochemical pharmacology. – 2006. – V. 72, № 7. – P. 881-892.
9. Finkel, T. Oxygen radicals and signaling/ T. Finkel // Current Opinion in
Cell Biology. – 1998. – Vol. 10. – P. 248 – 253.
10. Moreno-Loshuertos, R. Differences in reactive oxygen species
production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial
DNA variants/ R. Moreno-Loshuertos// Nature genetics. – 2006. – V. 38, № 11. –
P. 1261-1268.
11. Joshua, M. Buffering mitochondrial DNA variation/ Joshua M.
Baughman, Vamsi K. Mootha// Nature genetics. – 2006. – V. 38, № 11. – P. 12321233.
12. Октябрьский, О.Н. Редокс - регуляция клеточных функций / О.Н.
Октябрьский, Г.В. Смирнова //Биохимия. – 2007. – Т. 72 №2. – С. 158-174.
13. Skulachev, V.P. Mitochondria, reactive oxygen species and longevity:
some lessons from the Barja group/ V.P. Skulachev// Ag-ing Cell. – 2004. – V. 3. –
P. 17-19.
14 . Плетюшкина, О. Ю. Пероксид водорода, образуемый внутри
митохондрий, участвует в передаче апоптозного сигнала от клетки к клетке/
О. Ю. Плетюшкина, Е. К. Фетисова, К. Г. Лямзаев и др. // Биохимия. - 2006. Т. 71, № 1. - С. 75-84.
15. Лю, Б. Н. Пероксигеназные процессы и лейкозогенез // Успехи
современной биологии, - 2003.- т. 123.- №2.- С.147-160.
16. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты/ Ю.А.
Владимиров// Вестник РАМН. – 1998. - № 7. – С. 43–51.
17. Aruoma, O.I. Free radicals in biology and medicine: from inflammation
to biotechnology/ O.I. Aruoma, M. Grootveld, T. Bahorun// BioFactors (Oxford,
England). – 2006. – V. 27(1-4). – P.1-3.
18. Болдырев, А.А. Антиоксидантные системы в тканях мышей с
ускоренным темпом старения / А.А. Болдырев, М.О. Юнева, Е.В. Сорокина,
Г.Г. Крамаренко, Т.Н.Федорова, Г.Г. Коновалова, В.З. Ланкин// Биохимия. –
2001. – Т. 66. – С. 1157-1163.
19. Шаталин, Ю. В. Изменение антиоксидантного статуса
опухоленосителя в ходе развития асцитной гепатомы Зайделя/ Ю. В.
Шаталин// Биотехнология и бизнес, М.: 2006.
20. Штаркман, И.Н. Влияние аминокислот на образование перекиси
водорода и гидроксильных радикалов в воде и 8-оксогуанина в ДНК при
воздействии рентгеновского излучения/ И.Н. Штаркман, С.В. Гудков, А.В.
Черников, В.И. Брусков// Биохимия. – 2008. – Т. 73, № 4. – С. 576-586.