На правах рукописи Торопцева Марина Владимировна РОЛЬ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В ПАТОГЕНЕЗЕ
реклама
На правах рукописи Торопцева Марина Владимировна РОЛЬ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В ПАТОГЕНЕЗЕ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ 14.00.40 – урология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Божедомов Владимир Александрович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Гамидов Сафар Исраилович доктор медицинских наук Евдокимов Валерий Васильевич Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава Защита диссертации состоится «21» декабря 2009 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.072.12 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1. Автореферат разослан «18» ноября 2009 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор 2 Хашукоева А.З. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы В 7-8% случаев причиной бесплодия являются нарушения качества спермы (WHO, 2000). Одним из факторов, способным снижать мужскую фертильность, в последние годы стали считать гиперпродукцию активных форм кислорода (АФК), к которым относятся озон, свободные радикалы, перекись водорода (Гамидов С.И. и др., 2009; Громенко Д.С. и др., 2009; Deepinder F. et al., 2008; Tremellen K., 2008). В небольших количествах АФК необходимы для нормальной регуляции функции сперматозоидов. Они способствуют окислению ядерных белков, обеспечивая уплотнение ДНК, и фосфорилированию тирозина, увеличивая на мембране сперматозоида зону, в которой сперматозоид связывается с яйцеклеткой. Также известно, что присутствие перекиси водорода необходимо для протекания акросомальной реакции (Зоркин С.Н. и др., 2009; Тандилава Р.З. и др., 2009; Aitken et al., 2008). В случае, когда образование свободных радикалов превышает нормальные значения, развивается оксидативный стресс, что приводит к повреждению сперматозоидов. На фоне оксидативного стресса происходит повреждение мембраны сперматозоидов, снижение их подвижности и нарушение оплодотворяющей способности (Jedrzejczak P. et al., 2005; Tremellen K., 2008). Кроме того, АФК непосредственно повреждают ДНК хромосом (Бойко Н.И. и др., 2009; Kao S.H., 2007) и инициируют опосредованный эндонуклеазами апоптоз сперматозоидов (Сухих Г.Т. и др., 2009; Henkel R. et al., 2005), что приводит, в конечном счете, к бесплодию. Если с помощью ИКСИ сперматозоид, содержащий значительно поврежденные ДНК, оплодотворил яйцеклетку, часто нарушается развитие зародыша (Аляев Ю.Г. и др., 2006; Zorn B. et al., 2003). Несмотря на то, что многие из полученных эмбрионов гибнут на ранних стадиях развития, есть 3 вероятность того, что ребенок с поврежденной отцовской ДНК может родиться. Последствия этого пока достоверно неизвестны, но предполагается, что поврежденная ДНК может обуславливать генетические дефекты и рак у детей. Среди причин, приводящих к повышению продукции АФК, выделяют возраст, образ жизни (курение, избыточный вес, нехватка витаминовантиоксидантов и др.), воспаление, варикоцеле, диабет, некоторые другие (Зоркин С.Н. и др., 2009; Agarwal A. et al., 2006; Tremellen K., 2008). Но значение каждого из них в развитии оксидативного стресса сперматозоидов требует уточнения. Исходя из актуальности проблемы, целью настоящего исследования явилась оценка роли активных форм кислорода в патогенезе различных форм мужского бесплодия. Задачи исследования: 1. Установить нормативы продукции АФК в сперме фертильных мужчин. 2. Установить наиболее значимые факторы риска оксидативного стресса в сперме инфертильных мужчин. 3. Охарактеризовать особенности продукции активных радикалов кислорода в сперме при воспалительных процессах в органах репродуктивного тракта. 4. Установить распространенность данного фактора при различных формах патоспермии. 5. Показать роль оксидативного стресса в патогенезе мужского бесплодия при варикоцеле. Научная новизна 1. По результатам клинико-лабораторных данных получены нормативы продукции АФК в сперме фертильных мужчин. 4 2. Впервые количественно охарактеризованы степени абсолютного и относительного риска развития оксидативного стресса у мужчин из бесплодных пар с патоспермией, варикоцеле и воспалительными заболеваниями органов репродуктивного тракта мужчин. 3. Обоснована необходимость оперативного лечения варикоцеле любой степени выраженности на фоне гиперпродукции АФК. 4. Обоснована диагностическая значимость определения АФК в сперме всех мужчин из бесплодных пар. Практическая значимость работы 1. Выявленный высокий риск оксидативного стресса в эякуляте инфертильных позволил обосновать диагностическую значимость определения АФК в сперме мужчин из бесплодных пар, что существенно повышает эффективность диагностики мужского бесплодия, ассоциированного с гиперпродукцией АФК. 2. Определение закономерности продукции АФК на фоне варикоцеле отражает необходимость оперативного лечения на фоне оксидативного стресса при любой степени расширения вен семенного канатика. Основные положения, выносимые на защиту 1. У мужчин из бесплодных пар, по сравнению с фертильными мужчинами, установлено достоверное увеличение активных форм кислорода в эякуляте. 2. Оксидативный стресс в эякуляте обычно сопровождается ухудшением качественных показателей спермограммы и в половине случаев нарушениями акросомальной реакции даже при нормозооспермии. 3. Наиболее значимыми причинами оксидативного стресса сперматозоидов являются инфекционно-воспалительные заболевания мужских репродуктивных органов, иммунное бесплодие и варикоцеле. 5 4. Выраженность оксидативного стресса в эякуляте мужчин с варикоцеле не зависит от степени расширения вен семенного канатика. 5. Для азооспермии оксидативный стресс не характерен: при гипергонадотропной азооспермии продукция АФК ниже нормативных значений, при нормогонадотропной – не отличается от уровня АФК в эякуляте фертильных мужчин. Внедрение результатов исследования в практику Полученные результаты исследования внедрены в практику работы кафедры эндоскопической урологии РМАПО, ФГУ «КБ Росздрава», ЛПУ МГБ №2 г.Королева. Апробация работы Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на Российской научной конференции с международным участием «Фундаментальные исследования в уронефрологии» (Саратов, 2009); на IV Международном Конгрессе по андрологии (Сочи, Дагомыс, 2009); на XVIII международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (Самара, 2008); на XIX международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (Иркутск, 2009) и на совместной научно-практической конференцией сотрудников кафедры эндоскопической урологии ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава» и врачей урологического отделения ЦКБ №1 ОАО «РЖД» г. Москвы 5 июня 2009 года. Публикация результатов работы По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, 6 практических рекомендаций и списка литературы, включающего 262 источника, в том числе 50 отечественных и 212 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 38 рисунками. Содержание работы Материалы и методы исследования Комплексное исследование проводили на базе ФГУ «КБ Росздрава» и ФГУ НЦ АГиП Росмедтехнологий. В работу включены данные клинико-лабораторного обследования 804 мужчин, из них 768 - из бесплодных пар. 36 фертильных мужчин составили контрольную группу. Ретроспективно проанализированы истории болезни 686 пациентов, проспективно – 118 человек. Критерием отбора в основную группу явилось отсутствие беременности в браке в течение одного года у лиц репродуктивного возраста при регулярной половой жизни без применения контрацептивных средств. Среди пациентов из бесплодных пар у 130 мужчин был диагностирован хронический простатит в стадии обострения, у 294 – варикоцеле. Контрольная группа была представлена 36 мужчинами, у жен которых была диагностирована беременность, наступившая в естественном цикле. Возраст наблюдаемых нами мужчин из бесплодных пар колебался от 22 до 45 лет, средний возраст составил 33,4+6,2 года. Возрастные различия между мужчинами из бесплодных пар и контрольной группы отсутствовали. Клинические методы диагностики включали данные анамнеза, физического и урогенитального обследования. При этом оценивали характер бесплодия, его продолжительность, предшествующее обследование и/или лечение. Особое внимание уделяли семейному анамнезу, возрасту пациентов, особенностям полового развития, перенесенным заболеваниям, включая инфекционные, хирургическим вмешательствам по поводу крипторхизма, варикоцеле, а также профессиональным вредностям и видам терапевтического лечения, способным отрицательно влиять на сперматогенез. 7 Критериями исключения были: системные заболевания, глубокие эндокринные нарушения и неадекватная сексуально-эякуляторная функция. При оценке соматического статуса обращали внимание на своевременное конституциональное и половое развитие, определение типа телосложения, массо-ростового коэффициента, вторичные половые признаки и наличие гинекомастии. Урогенитальный статус включал осмотр и пальпаторное исследование органов мошонки с указанием положения, консистенции и размеров яичек, придатков и семявыносящих протоков. При этом нормальные размеры яичка соответствовали 15 мл. и больше и определялись с помощью орхидометра Прадера. Для выявления состояния придаточных половых желез выполняли ректальное пальцевое исследование предстательной железы и семенных пузырьков, которые в норме не пальпируются. Всем пациентам проводилось УЗИ яичек, в том числе допплерометрия сосудов семенного канатика для исключения субклинических форм варикоцеле. Оценка эякулята проводилась в соответствии с требованиями ВОЗ (1999). Определение интенсивности свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности проводилось методом люминолзависимой хемилюминесценции (люминометр «LKB-Wallac 1256», Финляндия; «Хемилюминометр-003», Россия). Верхней границей нормы продукции АФК мы считали 0,64 мВ/с. Для оценки аутоиммунных реакций против сперматозоидов и определения процента гамет в эякуляте, покрытых антиспермальными антителами, использовали MAR-тест, выпускаемый фирмой «Ferti Pro» (Бельгия). Определение количества антител на сперматозоидах выполнялось с помощью метода проточной цитофлуометрии (ПЦМ). У пациентов с симптомами нижних мочевых путей и/или пиоспермией проводили исследование секрета предстательной железы методом световой микроскопии с обязательным бактериальным исследованием, для чего 8 выполняли посев секрета простаты и эякулята. Для исключения инфекций, передающихся половым путем, применяли методы ПЦР и ИФА. Определение содержания уровня гормонов (ФСГ, тестостерон и др.) в периферической крови выполняли методами ИФА, РИА. Биопсию яичек проводили при азооспермии и нормальной концентрации ФСГ в плазме крови. Исследование биоптатов яичек проводили методом световой микроскопии. Обработка данных проводилась с применением методов описательной статистики с использованием программ Excel и STATISTICA. Степень взаимосвязи между признаками оценивали по корреляции R. Средние значения по группам представляли в виде M+S с исключением значений, отклоняющихся от средней арифметической более чем на +3S. Значимость различий между группами проверяли с помощью t-критерия Стьюдента для независимых и парных значений. Различия считали достоверными при р<0,05. Результаты собственных исследований и их обсуждение Проведенное клиническое и лабораторное обследование фертильных мужчин позволило получить нормативные критерии сперматогенной функции и уровня продукции АФК, которая составила, по нашим данным, от 0,01 до 0,64 мВ/с (M+S=0,29+0,17 мВ/с; медиана – 0,30 мВ/с). На эти данные мы ориентировались в дальнейшем при выполнении исследования. По полученным критериям продукция АФК в сперме фертильных мужчин превышала верхнюю границу доверительного интервала (ДИ) в 8 случаях (22,2%); в 4-х из 8 случаев у этих мужчин диагностировано варикоцеле, у 4-х – обнаружены АСАТ. Оксидативный стресс характеризуется повышенной продукцией АФК, которые приводят к снижению качества спермы. Путем статистического анализа мы установили, что именно является источником гиперпродукции АФК. Оказалось, что корреляция между количеством сперматозоидов и продукцией АФК статистически слабая (R=0,12; р=0,005). Величина АФК в 9 большей степени зависит от концентрации незрелых клеток сперматогенеза (R=0,16; р=0,001). Наиболее сильно величина АФК связана с концентрацией в сперме лейкоцитов (R=0,29; р<0,00001). Это подтверждает точку зрения, что именно лейкоциты являются основным источником активных радикалов в сперме (Aitken et al., 2008; Tremellen 2008). Средние значения продукции АФК различается у мужчин различных возрастных групп: у мужчин старше 40 лет уровень АФК выше, чем у 20-29летних в 1,52 раз (р<0,01). Оценивая инфертильности распространенность мужчин, чаще различных всего факторов отмечались риска воспалительные заболевания репродуктивных органов, травмы и оперативные вмешательства в анамнезе. Варикоцеле, в том числе и субклинические формы, было диагностировано у 294 мужчин (38,3%), иммунное бесплодие (MAR Ig>50%) - у 82 мужчин (10,6%), наличие хронического бактериального простатита в фазе активного воспаления - у 130 (16,9%). Высокую частоту встречаемости варикоцеле, по сравнению с данными других исследователей (ВОЗ, 2000; Нишлаг Э., Бере Г.М., 2005), мы объясняем включением в группу пациентов с субклинической степенью расширения вен семенного канатика. Рассматривая структуру показателей спермограмм всех мужчин из бесплодных пар, мы установили, что нормозооспермия выявлена у 23,1% мужчин. Для «нормозооспермии» у мужчин из бесплодных пар характерно содержание АФК в диапазоне от 0,01 до 139,0 мВ/с, в среднем 0,41+0,32 мВ/с (при исключении значений, отличающихся на +3S), медиана – 0,39 мВ/с, диапазон невыпадающих значений от 0,01 до 2,4 мВ/с. Значимые различия средних и частот случаев гиперпродукции АФК по сравнению с группой фертильных мужчин отсутствуют (p>0,05). У пациентов с нормозооспермией на фоне гиперпродукции АФК в половине случаев (52,9%) имелись нарушения акросомальной реакции. 10 В остальных случаях (n=591) имело место снижение концентрации, подвижности, доли нормальных форм и/или имелись антиспермальные антитела. Причем у 38 пациентов диагноз соответствовал «азооспермии», у 43 – грубой олигозооспермии на фоне гипергонадотропного гипогонадизма, у 151 – олигоастенотератозооспермии, у 82 мужчин диагностировано иммунное бесплодие. наличие АСАТ в арикоцеле простатит кисты в придатках отсутств ие семяв ыносящих протоков 0% 10% 20% 30% 40% 50% Рис.1. Наиболее частые патологические состояния у мужчин из бесплодных пар с гиперпродукцией АФК. В целом, гиперпродукция АФК, по нашим данным, имеется у 38,2% пациентов с различными нарушениями качества спермы. Среди мужчин с гиперпродукцией АФК мы чаще всего выявляли варикоцеле (38,9% случаев) и хронический бактериальный простатит в фазе активного воспаления (25,1% случаев); у 8,9% мужчин – кисты в придатках, у 1,2% - отсутствие одного или обоих семявыносящих протоков. В 52,2% случаев на фоне гиперпродукции АФК мы обнаруживали аутоиммунные реакции против сперматозоидов, выработкой АСАТ (рис.1). 11 сопровождающиеся 60% На фоне гиперпродукции АФК нормоспермия выявлена в 19,3% случаев. Таким образом, нами установлено, что оксидативный стресс в 80,7% случаях сопровождался ухудшением качества спермы. Причем чаще всего наблюдалась астенозооспермия – 71,4% случаев, затем тератозооспермия – 36,3%, олигозооспермия - 28,3%, пиоспермия – 21,3%, иммунное бесплодие, когда антителами покрыты более половины подвижных сперматозоидов, – 10,6%; в 5% случаев – азооспермия. Следует отметить, что обычно имело место сочетание нескольких диагнозов. Нарушение акросомальной реакции на фоне оксидативного стресса отмечено более чем в половине всех случаев. Учитывая высокую частоту встречаемости отдельных патологических состояний у мужчин из бесплодных пар, актуальной задачей явилась необходимость выяснить степень риска развития оксидативного стресса на фоне различных этиопатогенетических факторов (рис.2). Нами установлено, что инфекционно-воспалительные заболевания мужских репродуктивных органов, в частности, хронический бактериальный простатит, приводят к оксидативному стрессу сперматозоидов в 64,1% случаев, относительный риск - 2,9. На фоне иммунного бесплодия абсолютный риск оксидативного относительный - 1,5-2,9 стресса составляет 40,2-71,0%, (в зависимости от количества АСАТ). При варикоцеле абсолютный риск оксидативного стресса сперматозоидов составил 29,3-68,1%, относительный – 1,6-2,6 соответственно. Таким образом, наиболее значимыми причинами развития оксидативного стресса явились хронический бактериальный простатит в фазе активного воспаления, аутоиммунные реакции против сперматозоидов и варикоцеле. Эти патологические состояния наиболее часто диагностировались при мужском бесплодии, и на их фоне отмечался высокий риск развития оксидативного стресса. Мы изучили особенности оксидативного стресса в группах с различными причинами снижения фертильности. Нами установлено, что при варикоцеле (n=294) продукция АФК составила 0,48+0,40 мВ/с при 12 индивидуальном разбросе значений от 0,01 до 66,15 мВ/с, что в 1,9 раза выше, чем у фертильных пациентов при отсутствии АСАТ и в 8 раз - при наличии аутоиммунных реакций. Иммунное бесплодие (MAR IgG>50%) 71% *** Воспалительный простатит (пиоспермия без АСАТ) 64% *** Варикоцеле левостороннее (без АСАТ и пиоспермии) 29% 22% Фертильные 0% 20% 40% 60% 80% 100% Доля мужчин с гиперпродукцией АФК в сперме, % Рис.2. Абсолютный риск оксидативного стресса сперматозоидов при различных этиопатогенетических факторах мужского бесплодия. Примечание: *** - различия по сравнению с группой фертильных мужчин достоверны по критерию ХИ-квадрат с p<0,001 В то же время корреляционный анализ не обнаружил взаимосвязи между выраженностью варикоцеле, с одной стороны, и уровнем АФК, в сперме - с другой (R=-0,004; gamma=-0,004; t=-0,003; р>0,05). Нами проведен анализ особенности продукции АФК в эякуляте мужчин при различных формах варикоцеле. Получили, что гиперпродукция активных радикалов при субклинической форме расширения вен семенного канатика отмечалась в 31,2% случаях, при первой – 33,9%, при второй – 25,5%, 42,9% при третьей. Таким образом, статистически значимых различий в частоте случаев гиперпродукции активных форм кислорода не выявлено (p>0,05). 13 Исходя из полученных нами данных, проведение УЗИ органов мошонки является обязательным при обследовании мужчин из бесплодных пар с целью вывления субклинических форм варикоцеле. Установленный диагноз варикоцеле является абсолютным показанием для определения уровня АФК. На фоне гиперпродукции АФК при варикоцеле показано, по нашему мнению, оперативное лечение вне зависимости от степени варикоцеле. При одинаковой степени расширения вен семенного канатика продукция АФК возрастала с увеличением продолжительности бесплодия (p<0,04-0,01); в среднем по группам у пациентов с варикоцеле степенью +1 при продолжительности бесплодия от 12 до 36 мес. она составляла 0,39+0,23 мВ/с, при бесплодии больше 36 мес – 0,64+0,45 мВ/с (p<0,05). Исходя из этого, прогноз оперативного лечения в раннем возрасте в плане восстановления фертильности более благоприятный, а выжидательная тактика ведения пациентов с варикоцеле не является обоснованной, учитывая высокий риск оксидативного стресса. На фоне хронического простатита (n=130) нами установлена прямая зависимость продукции активных радикалов кислорода от количества лейкоцитов в секрете простаты (R=0,24; р=0,04). При повышении числа лейкоцитов в секрете простаты пиоспермия наблюдалась в 36,1% случаев. Зависимость продукции АФК от концентрации в сперме лейкоцитов (R=0,29; p<0,00001) сильнее, чем от содержания лейкоцитов в секрете простаты. Пациенты с диагнозом «пиоспермия» отличались высоким содержанием АФК в сперме: в среднем по группе продукция составляла 9,81+/-25,56 мВ/с (при выбраковке значений +3S - 1,15+1,34 мВ/с) с индивидуальным разбросом от 0,07 до 153,50 мВ/с; медиана – 0,925 мВ/с, диапазон невыпадающих значений – от 0,07 до 9,52 мВ/с, что существенно больше (3,9 раз), чем у фертильных мужчин (p<0,001). Значимая корреляция имеется между концентрацией в сперме лейкоцитов и выраженностью бактериоспермии (R=0,23; p=0,033), выраженностью бактериоспермии и продукцией АФК (r=0,35; p<0,01). 14 На основании полученных данных нами установлена положительная взаимосвязь между продукцией АФК и агглютинацией сперматозоидов у мужчин из бесплодных пар с патозооспермией. Причем при исключении образцов с пиоспермией коэффициент корреляции заметно снижался: R=0,13 (p>0,05), Gamma=0,30 (p=0,05). Представленные данные позволяют считать гиперпродукцию АФК в сперме следствием воспалительной реакции в ответ на присутствие в репродуктивном тракте избыточного количества микроорганизмов. Исключение из анализа образцов с концентрацией сперматозоидов менее 10 млн/мл и выпадающих значений (+2S) позволило более точно определять продукцию АФК и активность аутоиммунных реакций. При этих условиях у мужчин с хроническим простатитом, сопровождающимся пиоспермией, продукция АФК в 8,8 раз больше, чем у фертильных, и наблюдается более выраженная (R=0,44), чем для всей выборки, взаимосвязь между содержанием в сперме АФК и лейкоцитов. Роль воспалительного процесса в повышении продукции АФК в сперме подтверждают результаты антибиотикотерапии хронического простатита (табл. 1). Показано, что уже через 2 недели лечения на фоне снижения количества лейкоцитов в секрете простаты на 39,1% (p<0,01) и на 35,2% в сперме (p>0,05) происходит более чем двукратное снижение продукции АФК (-58,1%; p<0,05). Одновременно происходит улучшение жизнеспособности (p<0,05) и подвижности (p<0,05), нормализация акросомальной реакции сперматозоидов в виде уменьшения доли гамет, преждевременно утративших целостность акросомальной мембраны (p<0,05), а у пациентов с АСАТ – снижение процента MAR-позитивных сперматозоидов (p<0,01). Таким образом, анализ данных обследования мужчин из бесплодных пар с простатитом показал, что повышенное количество лейкоцитов в сперме на фоне простатита служит основным источником гиперпродукции активных форм кислорода, приводит к оксидативному стрессу и изменению функциональных свойств сперматозоидов. 15 У половины (51,5%) пациентов из бесплодных пар с пиоспермией обнаружены АСАТ, но только у 9,2% они покрывали более 50% подвижных сперматозоидов. Корреляция между концентрацией лейкоцитов в сперме и процентом АСАТ-позитивных подвижных сперматозоидов отсутствует (R=0,0; p>0,05). Нами установлено, что продукция свободных радикалов больше зависит от количества антител на сперматозоидах (R=0,81), чем от процента подвижных МАР-позитивных гамет (R=0,44), определяемого с помощью метода ПЦМ, который мы рекомендуем как более точно характеризующий активность аутоиммунных процессов в эякуляте. Мы проанализировали особенности продукции АФК при различных формах патоспермии. Корреляционный анализ показателей спермограммы пациентов с тератозооспермией не обнаружил зависимости между процентом патологических форм и продукцией АФК. Однако имеется взаимосвязь между процентом сперматозоидов с измененной шейкой и продукцией АФК и отсутствием АСАТ: r=0,2; p<0,01. Также в этой выборке обнаружена положительная корреляция между продукцией АФК и процентом сперматозоидов, спонтанно претерпевших акросомальную реакцию: r=0,24; p<0,05 для группы пациентов с нормальной концентрацией сперматозоидов и лейкоцитов. Повышение уровня АФК при тератозооспермии может объясняться выбросом активных радикалов с повреждением мембран сперматозоидов, задержке цитоплазмы, и, наоборот, что вероятней всего, является следствием продукции морфологически дефектными гаметами. При этом нарушается нормальное течение акросомальной реакции и происходит апоптоз гамет с повреждениями целостности их ДНК (Aitken et al., 1989; Saleh et al., 2003; Jedrzejczak et al., 2005; Deepinder F., 2008). Морфологически измененные сперматозоиды с дефектным ДНК обладают низкой способностью оплодотворять яйцеклетку, а в случае наступления беременности высок риск генетических патологий плода. 16 Таблица 1 Изменения продукции активных факторов кислорода, показателей спермограммы, акросомальной реакции, процента АСАТ-позитивных сперматозоидов и секрета простаты при антибиотикотерапии хронического простатита у мужчин из бесплодных пар (М+SE) Показатели Мужчины с простатитом (n=48) До лечения После 2 нед лечения Активные формы кислорода, мВ/с 22,1+6,91 9,28+4,63** Лейкоциты спермы, х106/мл 2,07+0,52 1,34+0,58 Подвижные сперматозоиды категории А, % 14,1+1,53 18,3+1,7* Живые сперматозоиды, % 73,0+2,7 77,6+2,7* Лейкоциты секрета простаты, единиц в 27,6+4,6 16,8+3,8** MAR IgG-позитивные сперматозоиды, % 31,8+6,93 26,1+6,51** Акросомальная реакция преждевременная, 23,3+2,57 18,1+2,21* Акросомальная реакция индуцированная, % 32,9+3,14 31,7+2,83 Индуцируемость акросомальной реакции, 8,8+2,6 13,6+2,3 поле зрения % % Примечание. * - различия по сравнению с исходными данными достоверны по критерию Стьюдента для парных значений с p<0,05; ** - p<0,01. Исходя из этого, мы считаем, что определение уровня АФК при тератозооспермии является необходимым методом обследования. При «гипергонадотропной форме азооспермии» в отсутствие значимых количеств АСАТ и нормальном содержании лейкоцитов продукция АФК в сперме составляет от 0,01 до 4,8 мВ/с, в среднем 0,16+0,10 мВ/с; медиана – 0,17 мВ/с, диапазон невыпадающих значений от 0,01 до 0,21 мВ/с. Это 17 существенно меньше, чем у фертильных (p<0,01). Также реже (12,1%) продукция АФК превышала верхнюю границу нормы. При «нормогонадотропной азооспермии» продукция АФК в среднем по группе, наоборот, выше, чем у фертильных: 1,06+2,86 мВ/с (от 0,01 до 11,3 мВ/с), медиана – 0,21 мВ/с, диапазон невыпадающих значений от 0,01 до 1,28 мВ/с. Различия по сравнению с фертильными несущественны (p>0,05), но среднее содержание АФК значимо выше, чем у мужчин с гипергонадотропной азооспермией (p<0,05). Учитывая, что содержание сперматозоидов, лейкоцитов и АСАТ в этих группах с азооспермией не отличаются (p>0,05), различия, очевидно, обусловлены патогенезом азооспермии. В первом случае – это секреторное бесплодие с первичным поражением гонад, во втором чаще имеет место обтурационная форма. Поэтому в этой группе, несмотря на отсутствие сперматозоидов в эякуляте, в ряде случаев (21,3%) были обнаружены АСАТ. Таким образом, проведенные нами исследования показали наличие единых звеньев патогенеза мужского бесплодия на фоне различных факторов риска, пусковым моментом которого является гиперпродукция активных форм кислорода, приводящая к оксидативному стрессу. Скрининговое определение уровня активных форм кислорода в эякуляте мужчин из бесплодных пар позволяет выявить мужской фактор бесплодия в браке, даже когда другие функциональные и морфологические характеристики сперматозоидов не имеют отклонений от нормы. Полученные результаты не претендуют на исчерпывающую характеристику патогенетических механизмов развития мужского бесплодия, но служат важным шагом к пониманию биохимических основ инфертильности мужчин и могут быть использованы для разработки патогенетически обоснованных методов ее коррекции. 18 ВЫВОДЫ 1. Уровень продукции АФК у фертильных мужчин составляет 0,3+0,17 мВ/с (95%ДИ 0,01-0,64). 2. Оксидативный бесплодия. стресс встречается Гиперпродукция АФК в в 38,2% случаев сперме обычно мужского (80,7%) сопровождается ухудшением количественных показателей спермограммы и в большинстве случаев (52,9%) нарушениями акросомальной реакции даже при нормозооспермии. 3. Высокий риск оксидативного стресса в эякуляте наблюдается при воспалительных заболеваниях органов репродуктивного тракта, иммунном бесплодии и варикоцеле. 6. На фоне патоспермии оксидативный стресс наиболее выражен при пиоспермии, наличии антиспермальных антител и тератозооспермии. Для азооспермии гиперпродукция АФК не характерна. 7. Зависимость между степенью варикоцеле и выраженностью оксидативного стресса сперматозоидов отсутствует. При одинаковом расширении вен семенного канатика (степень варикоцеле) продукция АФК тем больше, чем дольше имеет место бесплодный брак. Развившиеся на фоне варикоцеле аутоиммунные реакции против сперматозоидов существенно увеличивают продукцию АФК и усиливают отрицательное действие последних на функции сперматозоидов. 19 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Определение АФК в сперме рекомендуется выполнять всем мужчинам из бесплодных пар 2. Метод хемилюминесценции является адекватным методом определения интенсивности свободнорадикальных процессов и рекомендуется для широкого внедрения в практику при диагностике мужской инфертильности, что позволит повысить качество обследования и результаты терапии. 3. Проведение УЗИ органов мошонки мужчин из бесплодных пар необходимо для исключения субклинических форм. При варикоцеле любой степени выраженности на фоне гиперпродукции АФК показано оперативное лечение, учитывая высокий риск оксидативного стресса. 4. Выявление уровня АФК рекомендуется проводить при азооспермии с целью определения дополнительного критерия дифференциальной диагностики формы азооспермии: при гипергонадотропной азооспермии уровень АФК ниже нормы в 1,9 раз, при нормогонадотропной – не отличается от уровня АФК в сперме фертильных мужчин. 5. Определение использовании АФК в сперме вспомогательных необходимо выполнять репродуктивных при технологий (ВРТ), учитывая способность АФК повреждать ДНК хромосом и инициировать апоптоз сперматозоидов, что повышает риск развития генетических аномалий плода. 20 Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Божедомов В.А., Громенко Д.С., Ушакова И.В., Торопцева М.В., Галимов Ш.Н., Голубева Е.Л., Александрова Л.М., Теодорович О.В., Сухих Г.Т. / Оксидативный стресс сперматозоидов в патогенезе мужского бесплодия // Урология, 2009, №2, с. 51-56. 2. Божедомов В.А., Громенко Д.С., Ушакова И.В., Торопцева М.В., Галимов Ш.Н., Голубева Е.Л., Охтырская Т.А., Александрова Л.М., Сухих Г.Т. / Причины оксидативного стресса сперматозоидов // Проблемы репродукции, 2008, №6, с.67-73. 3. Божедомов В.А., Громенко Д.С., Ушакова И.В., Торопцева М.В., Галимов Ш.Н., Голубева Е.Л., Охтырская Т.А., Александрова Л.А., Сухих Г.Т. / Причины оксидативного стресса сперматозоидов // Мужское здоровье. Материалы 4-й Всероссийской конф., 12-15 ноября, 2008, С.209. 4. Торопцева М.В., Липатова Н.А., Божедомов В.А. / Роль оксидативного стресса в патогенезе мужского бесплодия // Материалы XIX международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (10-12 сентября 2009 г., Иркутск). 5. Ushakova Bozhedomov V.A., Loginova N.S., Matveeva N.K., Golubeva E.L., I.V., Lipatova N.A., Okhtirskaya T.A., Toroptseva M.V. Immunoendocrine aspects of male infertility // VI European Congress of Reproductive Immunology / Book of Abstracts. Moscow, June, 30 - July 3., 2008. P.12. 6. Bogedomov V.A., Toroptseva M.V., Uchakova I.V., Gromenko D.S., Bogedomova G.E., Golubeva E.L., Alexandrova L.M., Teodorovitch O.V., Sukhikh G.T. The role of oxidative stress in spermatozoa at different ethiological factors of men`s subfertility // III International congress on reproductive medicine / Ed. L.V.Adamyan, G.T.Sukhikh, Moscov, 2009.- p.305-306. 21
