На правах рукописи КОРЖИКОВ Виктор Александрович 02.00.06 – высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ
реклама
На правах рукописи КОРЖИКОВ Виктор Александрович БИОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНО-НЕОРГАНИЧЕСКИЕ НОСИТЕЛИ ДЛЯ ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ 02.00.06 – высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской высокомолекулярных соединений РАН академии наук Научный руководитель: доктор химических наук Тенникова Татьяна Борисовна Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Власов Геннадий Петрович Институте кандидат химических наук, доцент Домнина Нина Семёновна Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) Защита диссертации состоится « 9 » апреля 2009 года в 10.00 час. на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004, г. СанктПетербург, Большой пр. В. О., д. 31, конференц-зал. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института высокомолекулярных соединений РАН. Автореферат разослан « 2 » марта 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.229.01 кандидат физ.-мат. наук Долотова Н. А. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В настоящее время высокомолекулярные соединения широко используются в различных областях биологии и медицины благодаря возможности варьировать свойства материала в зависимости от состава и структуры используемых макромолекул. Разработано огромное количество полимерных биоматериалов, удовлетворяющих требованиям биосовместимости и выполняющих различные функции, в частности, имплантантов для замены поврежденного или утраченного участка костной ткани. Особый интерес представляет использование высокомолекулярных соединений в методе инженерии костной ткани, основанном на помещении клеток, полученных из тканей пациента, на трехмерный носитель (скаффолд), где происходит образование ткани за счет роста и дифференциации клеток. Развитие данного метода продемонстрировало, что для направления процесса в сторону образования костной ткани скаффолды должны функционировать в качестве системы контролируемой доставки биологических сигналов, управляющих поведением клеток. Поэтому возникает фундаментальный интерес изучения условий прочного связывания биологических молекул (лигандов) с поверхностью скаффолда. Несмотря на интенсивные исследования различных полимерных носителей на основе синтетических полимеров (полилактид, полигликолид) и природных биополимеров (хитозан, коллаген), к настоящему моменту не существует скаффолдов, удовлетворяющих как требованиям механической прочности, так и предоставляющих возможности биофункционализации. Кроме полимеров, в качестве каркасов для инженерии костной ткани используются макропористые керамические матрицы, обладающие достаточной механической прочностью и сходством со структурой неорганической составляющей костей. В связи с вышесказанным, актуальной задачей представляется создание нового типа скаффолдов, сочетающих в себе керамическую и полимерную составляющие. При этом использование в качестве последней гидрофильных полимеровносителей, ковалентно модифицированных специальными биологическими молекулами, открывает новые возможности применения полимеров в инженерии костной ткани. Подобный подход является оригинальным и не имеет описанных в литературе аналогов. Предложенный в работе подход к созданию «интеллигентных» гибридных носителей клеток основан на идее адсорбционного покрытия трехмерной макропористой керамической матрицы биосовместимым полимером, способным к ковалентному связыванию биологических молекул (лигандов) без разрушения основной цепи. Биологическая полифункциональность должна обеспечиваться связыванием с полимерной составляющей конструируемого скаффолда лигандов различной специфичности. Минеральная составляющая, в данном случае, обеспечивает механическую прочность и поддержку трехмерного роста клеток, в то время как биофункционализированный полимерный компонент ответствен за передачу клеткам сигналов, управляющих их поведением на поверхности гибридной матрицы. Таким образом, целью работы являлось создание полимерной системы, несущей биолиганды, и адсорбированной на поверхности неорганической матрицы с образованием материала, пригодного для использования в качестве скаффолдов для инженерии костной ткани, обеспечивающих интенсивную адгезию и рост клеток. 3 Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи: синтез и исследование полимеров-носителей, содержащих контролируемое количество реакционноспособных групп, способных к ковалентному связыванию биолигандов; контролируемое ковалентное связывание биолигандов различной функциональности с полученными полимерами-носителями; получение полифункционального полимерного «вектора», содержащего биолиганды различных типов; изучение гидродинамических характеристик исходных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами различных молекулярных размеров; сравнительное исследование адсорбции полученных полимеров-носителей на различных неорганических материалах и выбор матрицы для создания гибридных скаффолдов; изучение адсорбции и десорбции синтезированных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами на выбранной неорганической матрице; оценка цитотоксичности полимеров-носителей и их конъюгатов с целевыми биологическими молекулами, а также исследование влияния введения различных биолигандов в полимерную составляющую гибридного скаффолда на поведение живых клеток. В качестве методов исследования использовались свободно-радикальная полимеризация и сополимеризация, периодатное окисление α-гликолей и снятие диэтилацетальной защиты, N-алкилирование; вискозиметрия и светорассеяние; ЯМР спектроскопия, а также спектроскопия в ИК-, УФ- и видимой областях; полиакриламидный гель-электрофорез, флуоресцентный и фотометрический анализ, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия; аффинная хроматография; специальные биологические методы работы с культурами клеток, а также методы обработки данных, полученных в биологических экспериментах. Научная новизна. Разработана новая стратегия создания биофункциональных полимернонеорганических скаффолдов для инженерии костной ткани, заключающаяся в использовании гидрофильного полимера-носителя в качестве подвижного макромолекулярного спейсера, адсорбционно связанного с поверхностью неорганической макропористой подложки и модифицированного биомолекулами, способными интенсифицировать процессы адгезии и роста клеток. Впервые получены гидрофильные полимеры-носители на основе поливинилсахаридов, содержащие контролируемое количество реакционноспособных альдегидных групп. Впервые проведено контролируемое ковалентное связывание биолигандов различной функциональности с полученными полимерами-носителями и доказана возможность создания полифункциольнального полимерного «вектора», содержащего несколько биолигандов различной специфичности. Показано наличие адсорбции полученных полимеров и конъюгатов на поверхности керамических матриц. 4 Методами вискозиметрии и светорассеяния определены гидродинамические параметры полученных конъюгатов поливинилсахаридов с лигандами различного молекулярного размера. На основании тестов на цитотоксичность полученных полимеров в растворе и адсорбированном состоянии, а также гибридных скаффолдов, в полимерную составляющую которых были введены биомолекулы различной функциональности, показана возможность использования конъюгированных с биолигандами выбранных полимеров-носителей в качестве фактора, управляющего поведением клеток. Практическая значимость. Разработан и экспериментально апробирован технологический принцип создания нового типа скаффолдов для инженерии костной ткани. На примере синтезированных альдегидсодержащих поливинилсахаридов показана перспективность контролируемой модификации полимеров-носителей специальными биомолекулами с возможностью получения моно-, би- и полифункциональных конъюгатов и последующем введением их путем адсорбции в состав гибридных скаффолдов для интенсификации процессов адгезии и роста клеток. Основные положения, выносимые на защиту: Создано первое поколение гибридных скаффолдов, включающих в себя полимерноситель, несущий лиганды, управляющие поведением клеток. Путем полимераналогичных превращений, а также методом сополимеризации с защищенным альдегидным мономером, возможно контролируемое введение в поливинилсахариды альдегидных групп. Разработаны условия контролируемого введения биолигандов различной функциональности и молекулярного размера в альдегид-содержащие поливинилсахариды с различной структурой реакционноспособного звена, а также условия получения полифункционального полимерного «вектора», содержащего несколько лигандов различной биологической специфичности. Альдегидсодержащие полимеры-носители на основе винилсахарида и их конъюгаты с биолигандами образуют адсорбционное покрытие на поверхности минеральной матрицы, которое не обладает цитотоксичностью и оказывает положительное влияние на адгезию и рост клеток. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих симпозиумах и конференциях: 1-й и 4-й Санкт-Петербургских конференциях молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (СанктПетербург, Россия, 2005 и 2008), The young scientists and students international scientific conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007), International symposium «European BioPerspectives 2007» (Кёльн, Германия, 2007), International symposium «20th Meeting of the European Society for Animal Cell Technology» (Дрезден, Германия, 2007), International conference «Baltic Polymer Symposium 2007» (Друскининкай, Литва, 2007), 6 th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2008). Кроме того, результаты диссертационной работы обсуждались на научнопрактических семинарах в Институте высокомолекулярных соединений РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2007) и в Институте технической химии Университета 5 Ганновера (Ганновер, Германия, 2007). Работа была поддержана грантами РФФИ (№ 05-03-32310) и Немецкого Научного Общества (DFG, KA 1784/4–1). Для выполнения части исследования на территории Германии автор получил персональную стипендию Немецкой Службы Академических Обменов (DAAD, 1.09.2006 28.02.2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано тринадцать печатных работ, включающих 4 статьи и 9 тезисов докладов. Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации и обсуждении полученных результатов, а также в подготовке публикаций. Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы. Материалы диссертации изложены на 166 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 61 рисунком, список цитируемой литературы включает 197 источников. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обоснована актуальность проводимых исследований, сформулированы цели и задачи работы, определена научная новизна, охарактеризована практическая значимость полученных результатов, изложены основные положения, выносимые на защиту, а также приведена структура диссертации. Глава 1. Литературный обзор состоит из пяти частей. В первой части описан метод тканевой инженерии, приведены литературные данные по материалам, предлагаемым для регенерации костной ткани, и проанализированы различные подходы к созданию скаффолдов. Во второй части рассмотрены методы синтеза и введения реакционно-способных групп в гидрофильные полимеры с целью их использования в качестве полимеров-носителей. Третья часть посвящена описанию основных закономерностей адсорбции полимеров как стадии создания гибридного материала. В четвертой части проведена оценка перспективности использования различных биомолекул (биолигандов) для управления поведением клеток на поверхности скаффолда. Рассмотрены химические методы ковалентного связывания аминосодержащих молекул с реакционно-способными гидрофильными полимерами и особенности иммобилизации белков. В пятой части приведены типы используемых клеточных культур и стадии образования костной ткани. Обзор литературы завершается постановкой задач исследования. Глава 2. В Экспериментальной части описаны синтез и функционализация альдегид-содержащих полимеров-носителей, методы их исследования, проведения экспериментов по адсорбции и экспериментов в культуре клеток. Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1. Синтез полимеров-носителей Основной задачей синтетической части работы являлся синтез реакционноспособного полимера-носителя, пригодного для создания на его основе полифункционального полимерного вектора, содержащего несколько типов биомолекул. В качестве основы для получения полимера-носителя был выбран винилсахарид – 2деокси-N-метакрилоиламидо-D-глюкоза (МАГ). Наличие в его полимерах боковых сахаридных остатков позволяет предполагать проявляемое ими сродство к клеточ6 ным мембранам. Для ковалентного введения в полимер биолигандов наиболее перспективными представляются альдегидные группы, так как они позволяют связывать аминосодержащие биологические вещества в мягких условиях без выделения нежелательных побочных продуктов. В связи с этим возникла необходимость синтеза сополимера, содержащего звенья МАГ и звенья, несущие альдегидные группы. Существует две экспериментальные возможности получения подобных сополимеров (Рис. 1.). Рис. 1. Схемы синтезов альдегид-содержащих полимеров-носителей на основе 2деокси-N-метакрилоиламидо-D-глюкозы (МАГ, I). Реакции: 1 – синтез МАГ; 2а – гомополимеризация МАГ; 2б – периодатное окисление полиМАГ (пМАГ); 3а – сополимеризация МАГ с N-винилпирролидоном (ВП); 3б - периодатное окисление звеньев МАГ в сополимере МАГ с ВП; 4 – сополимеризация МАГ с диэтилацеталем акролеина (ДААк); 5а – сополимеризация МАГ с ВП и ДААк; 5б – удаление диэтилацетальной защиты. Продукты: I – МАГ; II – пМАГ; III – окисленная пМАГ; IV – сополимер МАГ с ВП (п(МАГ-соВП)); V – окисленный п(МАГ-со-ВП); VI – сополимер МАГ с ВП и ДААк (п(МАГ-со-ВП-со-ДААк)); VII - п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) после удаления диэтилацетальной защиты с - п(МАГ-со-ВП-со-Ак). Первый метод заключается в полимераналогичном превращении предварительно синтезированного гомополимера МАГ (пМАГ) в альдегид-содержащий сополимер путем периодатного окисления (Рис. 1, реакция 2б) сахаридных звеньев. Также было проведено окисление сополимера МАГ с N-винилпирролидоном (п(МАГ-со-ВП)) (Рис. 1, реакция 3б), синтезированного, исходя из предположения о положительном влиянии винилпирролидона на адсорбцию полимера на минеральной матрице. Вторым методом является сополимеризация МАГ с альдегидсодержащим мономером (в нашем случае, диэтилацеталем акролеина, ДААк). Было установлено, что прямая сополимеризация МАГ с ДААк (Рис. 1, реакция 4) приводит к образованию практически гомополимера МАГ, содержащего следовые количества ДААк. С другой стороны, известно, что ДААк и МАГ достаточно легко образуют 7 сополимеры с N-винилпирролидоном. Поэтому ВП был использован в качестве интермедиата для введения ДААк в структуру поливинилсахарида (Рис. 1, реакция 5а). Образование сополимеров п(МАГ-со-ВП) и п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) (Рис. 1, продукты IV и VI) было доказано методами ЯМР спектроскопии. Наличие альдегидных групп в продуктах III, V и VII (Рис. 1) было качественно подтверждено методом ИК-спектроскопии путем идентификации полос в области 1740 – 1755 см-1. При синтезе полимерной составляющей гибридного скаффолда необходимо обеспечить оптимальную величину ее молекулярной массы (ММ), гарантирующую, с одной стороны, адсорбцию на матрице, но, с другой, не препятствующую выводу полимера из организма при его возможной десорбции. Обычно значения ММ биологически значимых полимеров лежат в пределах 10000-30000. Для пМАГ это требование выполнялось путем подбора условий синтеза ([МАГ] = 10 масс%, [АИБН] = 5 масс%, ДМФА, выход 98%), в случае п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) учитывалось введение ДААк, которое приводит к уменьшению ММ продуктов сополимеризации. Необходимая биофункционализация поверхности полимерно-неорганического скаффолда достигается, в первую очередь, контролируемым введением альдегидных групп в синтезированный водорастворимый полимер. Экспериментально показано, Таблица 1 что увеличение концентрации периоОкисление пМАГ дата при окислении гомополимера [NaIO [CHO], 4]:[ МАГ], № Полимер МАГ приводит к увеличению количемоль моль% ства генерируемых альдегидных 1 пМАГ 2.0 55 групп (Таблица 1). Более высокая ре2 -“ 1.0 40 акционная способность МАГ приво3 -“ 0.7 30 дит к тому, что сополимеры МАГ с 4 -“ 0.3 10 ВП и ДААк в большей степени насыщены звеньями МАГ. Содержание ДААк в тройных сополимерах значительно ниже, чем в исходной мономерной смеси, что может быть объяснено его способностью к деградационному переносу в процессе роста цепи, приводящему к уменьшению выхода продукта и его молекулярной массы. Однако, количество введенного в сополимер ДААк, и, следовательно, альдегидных групп, можно варьировать путем изменения количества ВП в исходной реакционной смеси (Таблица 2). Таблица 2 Сополимеризация МАГ (М1) с ВП (М2) и ДААк (М3) № 5 6 7 8 Сополимер п(МАГ-со-ВП) п(МАГ-со-ВПсо-ДААк) п(МАГ-со-ВПсо-ДААк) п(МАГ-со-ВПсо-ДААк) Условия сополимеризации Соотношение мо- [M1+M2 [АИБН], номеров, (+M3)], масс% от моль% масс% [M1+M2(+M3)] 50 : 50 10 4 Характеристики сополимеров Выход % [m1]:[m2](:[m3]) Mη• моль% 10-4 60 77 : 23 2.40 30 : 30 : 40 40 1 39 82 : 15 : 3 2.00 20 : 40 : 40 40 1 31 79 : 16 : 5 1.75 15 : 45 : 40 40 1 22 75 : 18 : 7 1.35 8 Таким образом, использование двух описанных подходов позволило получить новые альдегид-содержащие полимеры, принадлежащие к классу поливинилсахаридов, со значениями ММ, удовлетворяющими требованиям к полимерам-носителям. 3.2. Биофункционализация полученных полимеров-носителей Согласно предложенной стратегии получения полимерно-неорганических скаффолдов, в его состав должен входить адсорбированный на поверхности компонент, управляющий поведением клеток (так называемый полибиофункциональный полимерный «вектор»). Создание такого «вектора» основано на ковалентном связывании с полученными альдегид-содержащими полимерами специальных биологических молекул (биолигандов), оказывающих различное влияние на клетки. Для повышения эффективности процесса выращивания костной ткани в лабораторных условиях существует необходимость интенсифицирования стадий прикрепления (адгезии), миграции, роста и дифференциации клеток на поверхности используемых для этой цели каркасов. В данной работе были использованы три типа биолигандов, способных оказывать влияние на перечисленные процессы, а именно: положительно заряженный поли-L-лизин в качестве фактора, повышающего неспецифическую адгезию клеток за счет электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными мембранами клеток; GRGDSP-пептид, способствующий специфическому прикреплению клеток посредством комплементарного взаимодействия с поверхностными белками клеточных мембран; фактор роста и дифференциации клеток – костный морфогенетический белок (bone morphogenetic protein, BMP-2). В связи с высокой стоимостью BMP-2, в модельных in vitro экспериментах использовали доступный аналог - рибонуклеазу А (РНКазу), обладающую близкими физикохимическими свойствами (значениями изоэлектрической точки и молекулярной массы). Конъюгаты с одним лигандом (моноконъюгаты) Связывание GRGDSP-пептида. Схема ковалентного связывания данного лиганда с окисленной пМАГ и п(МАГ-со-ВП-со-Ак) представлена на Рис. 2. Для получения количественных данных использовали введение в пептид флуоресцентной метки. На основании полученных результатов сделан вывод о том, что данная реакция контролируется диффузией пептида к СНО-группам полимера. Рис. 2. Экспериментальная схема изучения процесса ковалентного связывания GRGDSP- пептида с альдегид-содержащими полимерами. 9 В случае окисленного гомополимера МАГ, практически полная конверсия альдегидных групп достигается при двукратном избытке пептида, тогда как для тройного сополимера тот же результат достигался только при десятикратном избытке лиганда (Таблица 3). Таким образом, количество введенного в полимер пептидного лиганда можно легко регулировать, подбирая необходимое молярное соотношение [CHO]ПОЛИМЕР : [NH2]ПЕПТИД. Модификация пМАГ и п(МАГ-co-ВП-co-Ак) GRGDSP пептидом Таблица 3 [CHO]полим:[NH2]GRGDSP , моль 1.0 0.5 1.0 0.5 0.2 0.1 Конверсия CHO групп, моль% пМАГ 75 94 п(МАГ-co-ВП-co-Ак) 40 50 63 93 пМАГ - 30 моль% CHO-групп, MM 20000; п(МАГ-со-ВП-со-Ак) - 7 моль% CHO-групп, MM 13500. Условия реакции: 0.01 M натрий-боратный буфер, pH 10.0, 25°C, 2 ч при перемешивании (550 rpm). Очистка: ультрафильтрация (MWCO: 3,000) против воды. Конверсия альдегидных групп, измеряемая количеством конъюгированного с полимером пептида, определялась флуорометрически (λex.= 355 нм, λem.= 485 нм), используя значения флуоресценции данзилкадаверина. Связывание РНКазы (BMP-2) (Рис. 3). Доступность альдегидных групп полимеров для аминогрупп белка ограничена вследствие стерических препятствий, обусловленных структурой реагирующих макромолекул в растворе. Рис. 3. Схема, использованная для изучения связывания модельного белка РНКазы с альдегид-содержащими полимерами. Кроме того, оба типа реагирующих макромолекул содержат в своем составе достаточное количество реакционно-способных групп (СНО и NH2), способных образовывать межмолекулярные сшивки, в том числе, с образованием нерастворимых продуктов реакции. Исходя из этого, для снижения риска межмолекулярного взаимодействия групп и увеличения конверсии РНКазы использовали избыток полимеров, а, следовательно, альдегидных групп, по отношению к белку. Из данных Таблицы 4 очевидно, что при одинаковых массовых соотношениях большее количество РНКазы связывается с сополимером п(МАГ-со-ВП-со-Ак), чем с окисленной пМАГ. Данный результат можно объяснить большей стерической до10 ступностью для аминогрупп белка альдегидных групп п(МАГ-со-ВП-со-Ак) по сравнению с окисленной пМАГ. Полученные данные подтверждают возможность контролируемого введения фактора роста и дифференциации клеток BMP-2 в состав создаваемых скаффолдов путем регулирования избытка альдегидных групп полимера по отношению к белку. Известно, что для эффективной биофункционализации необходимо введение небольшого количества фактора клеточного роста. Поэтому создание полифункционального полимерного вектора желательно проводить постадийно, с введением в его структуру BMP-2 на первой стадии. С одной стороны, связывание нескольких мкг белка приведет к незначительной конверсии альдегидных групп, а с другой, избыток последних при присоединении BMP-2 на первой стадии создания смешанного конъюгата должен обеспечить наиболее полное связывание фактора роста и дифференциации клеток. Таблица 4 Количественные характеристики ковалентного связывания РНКазы с окисленной пМАГ и сополимером п(МАГ-со-ВП-со-Ак) [полимер]:[РНКаза], [CHO]:[РНКаза], Конверсия белка, масс. соотношение мольн. соотношение моль% окисленная пМАГ 2 33 4 5 83 7 10 166 31 20 337 43 п(МАГ-со-ВП-со-Ак) 2 9 13 5 23 25 10 45 37 20 93 85 пМАГ: 30 моль% CHO-групп, MM 20000; п(МАГ-со-ВП-со-Ак): 7 моль% CHO-групп, MM 13 500. Условия реакции: 0.01 M натрий-боратный буфер, pH 10.0, 25°C, перемешивание в течение 2 ч. (550 rpm). Очистка: диализ против воды (MWCO: 20000). Конверсия белка определена методом флуорометрии (λex.= 485 нм, λem.= 538 нм), с использованием флуоресценции ФИТЦ. Связывание поли-L-лизина. Аналогичным образом было исследовано связывание с полимерами поли-L-лизина (пЛиз, ММ~10000). Как и в случае белка, использовали избыток полимера. Необходимо отметить, что расчет количества связанного лиганда в данном случае проводился на звено лизина, поскольку молекулярная масса полимерного лиганда является средней величиной. Из Таблицы 5 видно, что максимальная конверсия аминогрупп достигается в случае окисленной пМАГ, содержащей наибольшее число альдегидных групп. С учетом мольных соотношений альдегидных групп полимеров и аминосодержащих звеньев лизина в исходной реакционной смеси, конверсия аминогрупп, а, следовательно, и реакционная способность альдегидных групп, для обоих полимеров практически совпадают. Это можно объяснить наличием в более «рыхлой» по сравнению с белком макромолекуле пЛиз значительного количества стерически доступных ε-аминогрупп, что позволяет преодолеть диффузионные ограничения реакции с альдегидными группами полимера, имеющие место в случае РНКазы. 11 Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при постадийном синтезе полифункционального полимерного вектора целесообразно введение пЛиз в структуру смешанного конъюгата на второй стадии процесса, после связывания полимера с РНКазой (или BMP-2). В данном случае, достаточно большое число оставшихся после связывания белка альдегидных групп будут обеспечивать конъюгирование необходимого количества пЛиз, но, вместе с этим, после образования бинарного конъюгата полимер-РНКаза-пЛиз, количество свободных альдегидных групп все еще будет достаточным для связывания GRGDSP-пептида. Таблица 5 Количественные характеристики ковалентного связывания пЛиз с окисленной пМАГ и п(МАГ-со-ВП-со-Ак) [полимер] : [пЛиз], [CHO] : [звено Лиз], Конверсия NH2-групп, масс. соотношение мольн. соотношение моль% окисленная пМАГ 5 0.85 49 10 1.70 59 20 3.39 75 40 6.78 82 п(МАГ-со-ВП-со-Ак) 5 0.23 23 10 0.47 29 20 0.94 64 40 1.87 68 пМАГ: 30 моль% CHO-групп, MM 20 000; п(МАГ-со-ВП-со-Ак): 7 моль% CHO-групп, MM 13 500. Условия реакции: 0.01 M натрий-боратный буфер, pH 10.0, 25°C, перемешивание в течение 2 ч. (550 rpm). Очистка: диализ против воды (MWCO: 3000). Конверсия белка определена методом флуорометрии (λex.= 485 нм, λem.= 538 нм), с использованием флуоресценции ФИТЦ. «Смешанные» конъюгаты На основании полученных данных и разработанных количественных методов для характеристики моноконъюгатов был осуществлен контролируемый количественно синтез «смешанного» конъюгата. Процесс проводили путем постадийного введения лигандов в структуру полимерного «вектора» (Рис. 4). Рис. 4. Экспериментальная схема получения смешанного конъюгата путем последовательного ковалентного связывания биолигандов. 12 Обнаруженная конверсия вводимых биомолекул на каждой стадии конъюгирования подтвердила принципиальную возможность получения сложных конъюгатов, содержащих лиганды различной природы и функциональности. На первых двух стадиях в структуру полимера-носителя вводили макромолекулярные лиганды, а именно, РНКазу и пЛиз, реакции которых с полимерами испытывают пространственные затруднения, а также требуют избытка альдегидных групп. На последней стадии в реакционную смесь, содержащую полимер, модифицированный указанными макромолекулами, вводили избыток низкомолекулярного GRGDSP-пептида. Количественный контроль процесса смешанного конъюгирования отражен в Таблице 6. Таблица 6 Количественные характеристики постадийного синтеза смешанного конъюгата, содержащего РНКазу, пЛиз и GRGDSP-пептид Стадия I Стадия II Стадия III [полимер]:[РНКаза], Конверсия [полимер]:[пЛиз], Конверсия [СНО]:[NH2], Конверсия масс. белка, масс. NH2-групп, моль. пептида, моль% моль% моль% окисленная пМАГ 20 : 1 47 20 : 1 33 2.11 39 п(МАГ-со-ВП-со-Ак) 30 : 1 58 30 : 1 15 0.61 25 Следует отметить, что при образовании «смешанного» конъюгата на каждой стадии модификация используемых полимеров биолигандами подчиняется закономерностям, полученным для моноконъюгатов. Этот факт позволяет контролируемо и воспроизводимо вводить необходимое количество лигандов в создаваемый полифункциональный полимерный «вектор» без дополнительного подбора условий для каждого случая. 3.3. Гидродинамические характеристики полимеров носителей и их конъюгатов с лигандами различного молекулярного размера Исследование гидродинамических характеристик полимеров-носителей и их конъюгатов с модельными лигандами различного молекулярного размера (глицин и РНКаза) осуществляли методами визкозиметрии, а также динамического и статического светорассеяния. Величины гидродинамических радиусов, полученные методом вискозиметрии, свидетельствуют о том, что макромолекулы полимеров двух типов альдегидсодержащих полимеров на основе МАГ, а также их конъюгатов с глицином и РНКазой, обладают достаточно свернутой конформацией, обусловленной, по-видимому, внутримолекулярными взаимодействиями. На основании анализа концентрационных зависимостей ηуд/c альдегид-содержащих форм обоих типов полимеров было установлено наличие полиэлектролитного эффекта, а также, в случае окисленной пМАГ, образование ассоциатов при повышении концентрации полимера в растворе. Кроме того, поведение и структура конъюгатов полимер-глицин и полимер-РНКаза в водных растворах существенно зависят от химической структуры полимеров, распределения альдегидных групп в полимерной цепи и количества связанного лиганда (Таблица 7). 13 Данные, полученные методом светорассеяния (Таблица 8), позволили сделать вывод о наличии ассоциативных структур, как в случае исходных полимеров, так и конъюгатов, вероятно, обусловленных межмолекулярными взаимодействиями звеньев МАГ. При этом введение альдегидных групп и последующее их замещение лигандами различного молекулярного размера приводит к изменению гидродинамических параметров, что является еще одним свидетельством образования конъюгатов. Таблица 7 Значения характеристической вязкости и рассчитанные гидродинамические параметры исходных и активированных полимеров, а также их конъюгатов с глицином и РНКазой № образца Название образца Растворитель [η], дл•г -1 RG[ ] h2 1/ 2 RH[ ] нм 1 1 2 5 6 7 пМАГ пМАГ окисленная пМАГ пМАГ-глицин (20 %)* пМАГ-глицин (100 %)* пМАГ-РНКаза пМАГ Na2SO4, 0.1 М б/б, pH 10.0 б/р-р, pH 7.0 б/р-р, pH 7.0 б/р-р, pH 7.0 б/р-р, pH 7.0 0.12 0.15 0.11 0.28 0.40 0.24 4.5 4.9 4.4 6.0 6.7 5.8 11.3 12.1 10.9 14.9 16.8 14.5 3.6 3.9 3.5 4.8 5.4 4.7 8 пМАГ-РНКаза-глицин б/р-р, pH 7.0 0.22 5.6 14.1 4.5 п(МАГ-ВП-ДААк) 3 п(МАГ-ВП-ДААк) Na2SO4, 0.1 м. 0.10 3.8 9.4 3.0 4 п(МАГ-ВП-Ак) б/р-р, pH 7.0 0.10 3.8 9.4 3.0 п(МАГ-ВП-Ак)-глицин 9 б/р-р, pH 7.0 0.12 4.0 10.0 3.2 (15 %)* п(МАГ-ВП-Ак)-глицин 10 б/р-р, pH 7.0 0.18 4.6 11.4 3.7 (100 %)* 11 п(МАГ-ВП-Ак)-РНКаза б/р-р, pH 7.0 0.21 5.0 12.4 4.0 12 п(МАГ-ВП-Ак)-РНКаза-глицин б/р-р, pH 7.0 0.23 5.1 12.8 4.1 *- указана степень конверсии альдегидных групп Обозначения: б/б, pH 10.0 – натрий-боратный буфер, рН 10.0; б/р-р, рН 7.0 - натрий-боратный буфер, рН 10.0, рН которого доведен до 7.0 добавлением борной кислоты Таблица 8 Размеры макромолекул полимеров и конъюгатов, полученные методами статического и динамического светорассеяния Образец Растворитель RH(1), нм RН(общ.), нм пМАГ б/б рН 10.0 3.9 45 п(МАГ-со-ВП) б/б рН 10.0 4.2 40 окисл. пМАГ б/р-р рН 7.0 6.2 82 пМАГ-глицин б/р-р рН 7.0 5.3 68 пМАГ-(РНКаза-глицин) б/р-р рН 7.0 7.8 122 RH(1) – гидродинамический радиус, определенный по быстрой моде; RН(общ.) – гидродинамический радиус, усредненный по обеим модам; RG – радиус инерции RG, нм 33 38 70 80 101 Кроме того, оказалось возможным обозначить предпочтительные для адсорбции полимеров и конъюгатов условия. Так как при покрытии поверхности минеральной матрицы желательно получение адсорбционного слоя, обеспечивающего доступ14 ность сигнальных молекул для клеточных рецепторов, необходимо проводить процесс при низких концентрациях полимеров и их конъюгатов (меньше 1 г/дл), т. е. в условиях минимальной концентрации ассоциативных структур. 3.4. Адсорбция полимеров и конъюгатов Адсорбция полимеров Для определения возможности создания полимерно-неорганических композитов было проведено изучение адсорбции полученных полимеров на следующих минеральных носителях: гидроксиапатит (ГА), биокерамических матрицах Bio-Oss и Sponceram. Сравнительное исследование количества адсорбированного вещества показало, что исходные полимеры адсорбируются в максимальном количестве (Рис. 5) на керамической матрице Sponceram, который был выбран для дальнейших исследований. Данный коммерчески доступный носитель, специально разработанный для культивирования клеток в биореакторах, представляет собой неорганическое твердое вещество на основе ZrO2, допированного гидроксиапатитом. Из кинетических кривых адсорбции исходных полимеров видно (Рис. 6), что процесс протекает достаточно Рис. 5. Морфологическая быстро и достигает максимума примерно через 100 мин. структура керамической матрицы Sponceram Рис. 6. Кинетические кривые (а) и изотермы адсорбции (б) исследуемых полимеров на носителе Sponceram. Условия адсорбции: объем раствора - 1.5 мл; 0.01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25°С; навеска Sponceram (монолит) – 50 ± 10 мг, концентрация полимеров (а) 1 мг/мл, (б) 0.25 – 3.5 мг/мл; Время инкубации полимера с минеральным носителем в случае построения изотермы адсорбции составляло 4 часа. Для исследованных полимеров способность к адсорбции не имела особых отличий. Вероятно, адсорбция осуществляется в основном за счет звеньев МАГ, что объясняется их способностью образовывать водородные связи с отрицательно заряженными атомами кислорода на поверхности керамики. Таким образом, дальнейшее исследование влияния введения лигандов на процесс адсорбции проводили с использованием в качестве полимера-носителя только окисленной пМАГ. Адсорбция конъюгатов Представленные на Рис. 7 данные демонстрируют аналогию форм кинетических кривых и изотерм адсорбции конъюгатов окисленной пМАГ с макромолеку15 лярными лигандами (РНКазой и пЛиз) с формами, установленными для исходного полимера. Можно предположить, что взаимодействие этих конъюгатов с поверхностью Sponceram определяется структурой полимерной составляющей конъюгата (пМАГ). В то же время, количество адсорбированного вещества зависит от наличия в структуре окисленной пМАГ ковалентно-связанных лигандов. Так, незначительное увеличение адсорбции пМАГ-РНКаза по сравнению с окисленной пМАГ, по всей видимости, обусловлено влиянием белка на адсорбционные характеристики конъюгата. Как и ожидалось, наибольшее количество адсорбированного вещества наблюдалось в случае конъюгата пМАГ-пЛиз, что связано с положительным зарядом цепи полиаминокислоты, обуславливающим дополнительное электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженной поверхностью Sponceram. При этом на изотерме адсорбции пМАГ-пЛиз отсутствует ярко выраженное плато насыщения, что можно объяснить полимолекулярной природой адсорбции данного конъюгата. Рис. 7. Кинетические кривые (а) и изотермы адсорбции (б) на Sponceram окисленной пМАГ и её конъюгатов с РНКазой, пЛиз и GRGDSP-пептидом. Условия адсорбции: (а) концентрация окисленной пМАГ и конъюгатов – 1 мг/мл; объем раствора - 1.5 мл; 0.01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25°С; навеска Sponceram (монолит) – 50 ± 10 мг. (б) концентрация окисленной пМАГ и конъюгатов 0.25 – 3.5 мг/мл; объем раствора - 1.5 мл; 0.01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25°С; навеска Sponceram (монолит) – 50 ± 10 мг; время инкубации растворов полимера с минеральным носителем - 4 часа. Напротив, в случае конъюгата окисленной пМАГ с GRGDSP-пептидом наблюдается значительное уменьшение количества адсорбированного вещества и изменение вида зависимостей. Эти явления, вероятно, вызваны изменением макроструктуры полимера в результате связывания с низкомолекулярным лигандом и, как следствие, изменением способности к адсорбции данного конъюгата, что согласуется с результатами, полученными методами вискозиметрии и светорассеяния. Учитывая аналогичность вида кинетической зависимости и изотермы адсорбции конъюгата пМАГ-РНКаза-пЛиз-GRGDSP и пМАГ-пЛиз, можно сделать вывод о том, что значительный вклад в адсорбцию «смешанного» конъюгата вносит наличие в его структуре пЛиз. Также была исследована десорбция полимеров и конъюгатов в течение 14 суток, т. е. в течение времени, когда происходит адгезия и наиболее интенсивный рост клеток. Данные по максимальной адсорбции, определенные по плато на изотермах и 16 по количеству десорбированных полимеров и конъюгатов, представлены в Таблице 9. Таблица 9 Параметры адсорбции и десорбции полимеров и конъюгатов окисленной пМАГ с различными лигандами Количество десорбированного Qмакс, полимера, мг/г Sponceram Образец мг/г Sponceram 8 суток 14 суток окисленная пМАГ 16.5 0.2 0.3 п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) 14.1 0.3 0.5 пМАГ-пЛиз 18.2 0.3 0.4 пМАГ-РНКаза 17.0 0.2 0.3 пМАГ-GRGDSP 6.1 0.0 0.1 пМАГ-(РНКаза)-(пЛиз)17.7 0.1 0.2 (GRGDSP) Очевидно, что десорбция полимеров и их конъюгатов в указанный промежуток времени незначительна, что позволило рекомендовать обсуждаемые образцы для клеточных экспериментов. Образование адсорбционного слоя с толщиной менее 10 нм на поверхности Sponceram в случае окисленной пМАГ и ее конъюгата с пЛиз показано методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС). Таким образом, результаты, полученные при исследовании адсорбции и десорбции исходных полимеров-носителей и синтезированных на их основе конъюгатов с различными лигандами, подтвердили возможность создания полимернонеорганических материалов для инженерии костной ткани путем адсорбционного покрытия поверхности минеральной матрицы (Sponceram) полифункциональным полимерным вектором, выполняющим к тому же роль гибкого макроспейсера, повышающего доступность для клеток сайтов биоспецифического взаимодействия. 3.5. Апробация полученных скаффолдов Изучение возможности применения полученных гибридных материалов для выращивания костной ткани проводили с использованием коммерческой линии клеток - предшественников остеобластов, выделенных из свода черепа мышей (MT3C3E1). Для изучения возможности использования полученных каркасов в клеточных экспериментах использовали тест на цитотоксичность, основанный на реакции восстановления бесцветной соли тетразолия (МТТ, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолбромида) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых растворимых в ДМСО кристаллов формазана. Этот высокочувствительный метод, называемый МТТ-тестом, позволяет определять количество жизнеспособных клеток при взаимодействии с чужеродным материалом. Особый интерес представляют концентрационные и временные зависимости количества живых клеток, контактирующих с материалом, указывающие на степень токсичности материала или её полное отсутствие. 17 В данной работе была проведена серия экспериментов, направленная на изучение цитотоксичности исходных полимеров-носителей и полученных биофункциональных скаффолдов. Кроме этого, использование МТТ-теста позволило оценить влияние покрытия поверхности Sponceram полимерными конъюгатами с биолигандами на адгезию и рост клеток. Как уже было сказано выше, создаваемые гибридные скаффолды состоят из двух компонентов: минеральной матрицы и полимерной составляющей. Отсутствие цитотоксичности у Sponceram было доказано компанией–производителем (ZellWerk GmbH) и практическими исследованиями, проводимыми в Институте технической химии Университета Ганновера. Исследование альдегидных форм полученных полимеров показало значительную токсичность их растворов и полное ее отсутствие для адсорбированных форм. Более того, блокирование альдегидных групп полимеров вводимыми лигандами также приводило к получению нетоксичных растворимых продуктов. Для изучения влияния адсорбционного покрытия Sponceram конъюгатами полимеров с биолигандами использовали так называемый «короткий» МТТ-тест, когда детектирование количества жизнеспособных клеток на полученных гибридных матрицах проводили в течение первых суток после высевания (Рис. 8, а и б). Рис. 8. Результаты «короткого» МТТ-теста: количество жизнезнеспособных клеток на Sponceram и Sponceram, покрытом конъюгатами пМАГ (а) и п(МАГ-соВП-со-Ак) (б) с GRGDSP-пептидом и пЛиз в течение первых суток после высевания. Данные по оси ординат приведены в относительных единицах, рассчитанных на основе значений оптической плотности растворов формазана. В случае Sponceram, покрытого конъюгатом пМАГ-пЛиз, наблюдается увеличение количества жизнеспособных клеток на поверхности скаффолда за счет электростатического притяжения отрицательно заряженных мембран клеток (Рис. 8, а), причем введение пЛиз увеличивает адгезию клеток только в первые 2-4 часа, а затем влияние лиганда ослабляется. Следовательно, поли-L-лизин оказывает влияние только на начальный этап адгезионного взаимодействия клеток с поверхностью матрицы. В случае модификации Sponceram конъюгатом пМАГ-GRGDSP, зафиксировано большее количество жизнеспособных клеток, чем в случае чистого Sponceram. Отличие количества жизнеспособных клеток через 24 часа для конъюгатов пМАГ18 GRGDSP и пМАГ-пЛиз, по всей видимости, обусловлено различным механизмом взаимодействия клеток с лигандами. Обсужденные закономерности адгезии клеток проявляются и при покрытии поверхности Sponceram конъюгатами на основе п(МАГсо-ВП-со-Ак) (Рис. 8, б). Для исследования влияния адсорбционного покрытия Sponceram конъюгатом окисленной пМАГ с GRGDSP-пептидом, а также «смешанным» конъюгатом пМАГ-пЛиз-GRGDSP на адгезию клеток был проведен эксперимент, основанный на флуоресцентном детектировании количества прикрепленных клеток (DAPI). С этой целью клетки высевали на диски Sponceram одинакового размера, предварительРис. 9. Результаты флуоресцентного определения количества DAPI- но помещенные внутрь силиконового кольца меченных клеток на поверхности для фиксации клеток внутри матрицы. чистого Sponceram и гибридных Из зависимости количества прикрепленскаффолдов через 1, 4 и 24 часа после высевания. ных клеток Sponceram/пМАГ-GRGDSP в течение первых суток культивации видно, что адгезия клеток на поверхности гибридной матрицы протекает более интенсивно в сравнении с чистым Sponceram (Рис. 9). Этот факт аналогичен данным, полученным при использовании МТТ-теста. Изучение «смешанного» конъюгата пМАГ-пЛиз-GRGDSP показало, что совместное использование двух лигандов оказывает большее влияние на адгезию клеток, чем в случае моноконъюгатов (Рис. 9). Рис. 10. Результаты «длительного» МТТ-теста: количество жизнезнеспособных клеток на чистом Sponceram и Sponceram, покрытом конъюгатами п(МАГ-соВП-со-Ак) с GRGDSP-пептидом и BMP-2 в течение тринадцати суток после высевания. Данные по оси ординат приведены в относительных единицах, рассчитанных на основе значений оптической плотности растворов формазана. Целевыми лигандами, способными изменять динамику роста клеток на скаффолде, являются биомолекулы, специфически взаимодействующие с клетками, а именно, GRGDSP-пептид и фактор роста BMP-2. Поэтому было исследовано влия19 ние покрытия поверхности Sponceram конъюгатами этих лигандов с полимераминосителями на жизнеспособность клеток в течение первых 13-ти суток, т. е. в период их наиболее интенсивного роста. Для этого был использован «длительный» МТТтест (Рис. 10). Полученные данные на примере тройного сополимера конъюгированного с RGD-пептидом и фактором роста BMP-2, показывают (Рис. 10), что рост клеток, начиная с третьих суток эксперимента, происходит интенсивнее на поверхности полимерно-неорганических носителей, чем на чистом Sponceram. Приведенные закономерности свидетельствуют о положительном влиянии исследуемых гибридных носителей на адгезию и рост клеток по сравнению с чистой керамической матрицей Sponceram. ВЫВОДЫ 1. Разработана стратегия получения полимерно-неорганических биораспознающих носителей клеток, или скаффолдов, для инженерии костной ткани, основанная на адсорбционном покрытии макропористой керамической основы биосовместимыми (со)полимерами винилсахаридов, модифицированными управляющими поведением клеток биологическими молекулами (биолигандами). 2. Впервые методом свободно-радикальной полимеризации синтезирован гомологичный ряд полимеров на основе винилсахарида 2-деокси-N-метакрилоиламидоглюкозы (МАГ): гомополимер, сополимер с N-винилпирролидоном и тройной сополимер с N-винилпирролидоном и диэтилацеталем акролеина; в последнем случае N-винилпирролидон выполнял роль инертного интермедиата, позволяющего вводить в структуру сополимера МАГ реакционноспособные альдегидные группы. 3. Впервые методами полимераналогичных превращений и сополимеризации с защищенной формой акролеина с дальнейшей активацией альдегида в полученном сополимере синтезированы новые альдегидсодержащие полимеры, принадлежащие к классу поливинилсахаридов, а именно, окисленная периодатом натрия поли(2деокси-N-метакрилоиламидоглюкоза) и поли([2-деокси-N-метакрилоиламидоглюкоза]-со-[1-винилпирролидин-2-он]-cо-[акролеин]). Показана возможность контролируемого введения альдегидных групп в полученные макромолекулярные соединения. 4. Разработаны методы контролируемого синтеза моноконъюгатов полученных полимеров с лигандами различной биологической функциональности, а именно, фактором неспецифической адгезии клеток макромолекулярным поли-L-лизином, фактором роста и дифференциации клеток белком BMP-2, а также низкомолекулярным интегрин-связывающим RGD-пептидом. Экспериментально установленные закономерности реакций конъюгирования позволили предложить метод создания «смешанных» конъюгатов - би- и трифункциональных полимерных векторов, представляющих собой контролируемое сочетание двух или трех биолигандов в структуре выбранных полимеров. 5. Исследованы процессы адсорбции и десорбции полученных полимеров и их биоконъюгатов. Установлено влияние химического строения полимеров-носителей и присоединяемых биолигандов на процесс адсорбции. Показана практическая не20 обратимость адсорбции полимеров и конъюгатов, как в модельных экспериментах, так и в культуральной среде, используемой для роста клеток. 6. Показано, что синтезированные альдегидсодержащие полимеры на основе винилсахарида в виде их биофункциональных конъюгатов значительно стимулируют прикрепление клеток к поверхности скаффолда, ускоряют их рост и образование ткани по сравнению с немодифицированной керамической основой скаффолда. Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях: 1. Korzhikov V. A., Diederichs S., Nazarova O. V., Vlakh E. G., Kasper C., Panarin E. F., Tennikova T. B. Water-soluble aldehyde bearing polymers of 2-deoxy-2methcarylamido-D-glucose for bone tissue engineering // Journal of Applied Polymer Science. 2008. V. 108, I. 4. P.2386-2397. 2. Korzhikov V., Roeker S., Vlakh E., Kasper C., Tennikova T. Synthesis of multifunctional polyvinylsaccharides containing controllable amounts of biospecific and nonspecific ligands // Bioconjugates Сhemistry. 2008. V. 19, I. 3. P. 617-625. 3. Коржиков В. А., Филиппов А. П., Власова Е. Н., Панарин Е. Ф., Тенникова Т. Б. Физико-химическое исследование структуры полимеров на основе 2-деокси-Nметакрилоиламидо-D-глюкозы и их конъюгатов с лигандами различного молекулярного размера // Журнал Прикладной Химии. 2008. Т. 81, вып. 8. – C.1311-1319. 4. Korzhikov V., Vlakh E., Nazarova O., Panarin E., Tennikova T. Synthesis and modification of hydrophilic polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose // Proceedings of Baltic Polymer Symposium. 2007. P.40-44. 5. Коржиков В. А., Афанасьева Е. В., Назарова О. В. Синтез альдегидсодержащих полимеров на основе N-метакрилоиламиноглюкозы // Тезисы докладов I СПб Конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах». 2005. C.75. 6. Korzhikov V., Vlakh E., Panarin E., Tennikova T., Diederichs S., Roeker S., Kasper C. Construction of biofunctional polymer-mineral composites for bone tissue engineering // The Young Scientists’ and Students’ International Scientific Conference “Modern Problems of Microbiology and Biotechnology”, Odessa, Ukraine. 2007. Book of Abstracts. P.93. 7. Roeker S., Diederichs S., Korzhikov V., Scheper T., van Griensven M., Tennikova T., Kasper C. Development of «smart» scaffolds for bone tissue engineering // “European BioPerspectives 2007”. Cologne, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.284. 8. Korzhikov V., Vlakh E. G., Diederichs S., Roeker S., Tennikova T. B., Kasper C. Water-soluble polymers for construction of composite scaffolds for bone tissue engineering: synthesis and adsorption study // “European BioPerspectives 2007”. Cologne, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.298. 9. Korzhikov V., Vlakh E. G., Diederichs S., Roeker S., Tennikova T. B., Kasper C.. New water-soluble polymers for construction of biofunctionalized scaffolds for bone tissue engineering: synthesis and adsorption study // 20th Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT-2007), Dresden, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.270. 10. Roeker S., Diederichs S., Korzhikov V., Scheper T., Tennikova T., Kasper C. Biofunctional polymer-mineral composites as scaffolds for bone tissue engineering // 20th Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT-2007), Dresden, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.274. 21 11. Vlakh E., Korzhikov V., Nazarova O., Panarin E., Tennikova T. Synthesis and modification of hydrophilic polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose // Baltic Polymer Symposium 2007 (BPS 2007), Druskinikai, Lithuania. 2007. Book of Abstracts. P.75. 12. Korzhikov V. A., Vlakh E. G., Nazarova O. V., Panarin E. F., Tennikova T. B. Synthesis, biofunctionalization and adsorption of polymers based on 2-deoxy-Nmethacrylamido-D-glucose for bone tissue engineering // 4th Saint-Petersburg young scientists conference “Modern problems of polymer science”, Saint-Petersburg. 2008. Program and abstract book. P. 23. 13. Korzhikov V. A., Filippov A. P., Panarin E. F., Tennikova .T. B. Hydrodynamic properties of the polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose and their conjugates with small and macromolecular bioligands // 6th International Symposium “Molecular Order and Mobility in Polymer Systems”. Saint-Petersburg. 2008. Book of abstracts. P.147. 22 23 Бесплатно. Копировально-множительный участок отдела обслуживания учебного процесса Физического факультета СПбГУ Тираж 120 экз. 24