Цитогенетические методы

Цитогенетические методы
Методы основаны на микроскопическом исследовании хромосом
человека. Наиболее распространенным методом в цитогенетике является
световая микроскопия. Большинство цитогенетических исследований
выполняется на делящихся соматических клетках. В ходе исследования
оценивается число хромосом и структура хромосом. Цитогенетический метод
применяется для определения хромосомных болезней.
Чаще всего для приготовления препаратов используются культуры
клеток. Культуру тканей можно получать из кусочков кожи (растут
фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток
амниотической жидкости. Наиболее удобна культура лимфоцитов крови. 1-2
мл венозной крови добавляют к питательной среде с фитогемаглютинином
(белок бобовых растений). Фитогемагглютинин вызывает деление
лимфоцитов. Далее клеточное деление останавливают на стадии метафазы
при помощи колхицина (или других подобных веществ). Далее лейкоциты
обрабатывают солевым раствором (гипотонический шок). В гипотоническом
растворе клетки набухают, ядерная оболочка разрывается и хромосомы
свободно распределяются в цитоплазме. После приготовления препаратов
осуществляется его окраска. Наиболее распространена простая (рутинная)
окраска, или окраска по Гимзе. При такой окраске хромосомы окрашиваются
равномерно по всей длине. Простой окраски достаточно чтобы подсчитать
число хромосом или оценить достаточно крупные хромосомные перестройки.
Для точной идентификации хромосомных мутаций используется
дифференциальная окраска. При дифференциальном окрашивании
хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Исчерченность
выражается в чередовании темных и светлых полос (эу- и
гетерохроматические районы). Каждая хромосома имеет характерный только
для нее набор полос, что позволяет идентифицировать каждую хромосому и
любую хромосомную мутацию. После окрашивания хромосомы изучают с
использованием светового микроскопа.
Нормальный кариотип человека
Кариотип- хромосомный комплекс вида со всеми его особенностями:
числом хромосом, их формой, деталями строения.
Кариотип человека содержит 46 хромосом (23 пары). 22 пары
называются аутосомами, 23-я пара – половыми хромосомами. Метафазная
хромосома состоит из двух хроматид, соединенных центромерой.
Центромера делит хромосому на два плеча – длинное (q) и короткое (р).
В кариотипе человека различают следующие типы хромосом:
1. Метацентрические (равноплечие). У метацентрических хромосом
плечо р равно по длине плечу q.
2. Субметацентрические (неравноплечие). У субметацентрических
хромосом плечо р короче плеча q.
3. Акроцентрические. У акроцентрических хромосом плечо р имеет
спутники, представляющие собой районы ядрышкового организатора. Здесь
находятся гены рРНК. Спутники соединяются с коротким плечом
спутничной нитью.
По морфологическим признакам и размерам хромосомы в кариотипе
человека делятся на 7 групп.
Группа А (1- 3 пары) – большие метацентрические хромосомы;
Группа В (4,5 пары) – большие субметацентрические, различаются
только при специальном (дифференциальном окрашивании);
Группа С (6 – 12 пары) – средние субметацентрические, различаются
при дифференциальном окрашивании;
Группа D (13 -15 пары) – большие акроцентрические, различаются при
дифференциальном окрашивании;
Группа Е (16 – 18 пары) – средние метацентрические (16) и
субметацентрические (17, 18), 17 и 18 пары хорошо различимы при
дифференциальном окрашивании.
Группа F (19 и 20 пары) – маленькие метацентрические хромосомы;
различаются при дифференциальном окрашивании;
Группа G (21 и 22 пары) – маленькие акроцентрические, различаются
при дифференциальном окрашивании;
Половые хромосмы (23-я пара). У женщин это две Х-хромосомы, у
мужчин – Х и У хромосомы. Х-хромосома при стандартном окрашивании
неотличима от аутосом группы С.
У-хромосому дифференцируют от
хромосом группы G (она не имеет спутников, длина короткого плеча
изменчива и наследуется от отца к сыну). У-хромосому можно выявить
специфическим окрашиванием акрихин-ипритом. При таком окрашивании
концевой участок длинного плеча выявляется в виде яркого пятна диаметром
0,3-1,0 мкм.
Хромосомные мутации
Хромосомные мутации могут быть связаны с изменением числа
хромосом или изменением структуры хромосом.
Мутации, связанные с изменеием числа хромосом делятся на две
группы:
1. Изменеия, касающиеся всего хромосомного набора в целом.
К этой группе относятся полиплоидии, при которых число наборов
негомологичных хромосом в кариотипе отличается от двух (3n, 4n и т.д.).
Причиной возникновения полиплоидий является нарушение митотического
цикла, при котором удвоение хромосом происходит без последующего
деления ядра и клетки. Такие мутации чаще всего приводят к гибели плода
на ранних стадиях эмбриогенеза. Очень редко наблюдается рождение детей с
триплоидией. В этих случаях наряду с триплоидными в организме
присутствуют и диплоидные клетки (мозаики). У детей с триплоидией
наблюдаются множественные пороки развития, они погибают в первые дни
жизни.
2. Изменение числа отдельных хромосом (анеуплоидии).
К этой группе относятся:
 Моносомии. При моносомии утрачивается одна хромосома из пары (2n1);
 Полисомии. При полисомии к кариотипу добавляется одна или
несколько хромосом набора. Частным случаем полисомии является
трисомия (2n+1), когда вместо двух гомологов их становится три;
 Нуллисомия. При нуллисомии отсутствуют оба гомолога какой-либо
пары хромосом.
К мутациям, связанным с изменением структуры хромосом
(хромосомным аберрациям) относятся:
 Делеции – утрата какого-либо участка хромосомы. Различают концевые
и интерстициальные делеции.
Концевые делеции (дефишенси)
заключаются в потере теломерных районов и прилежащих к ним
районов хромосом. При интерстициальных делециях происходит
потеря внутреннего участка хромосомы.
 Дупликации – перестройки, приводящие к удвоению определенного
участка хромосомы. Обычно дупликациям предшествуют делеции в
идентичных участках хромосом, либо они являются результатом
неравного кроссинговера.

Инверсии – переворот участка хромосомы на 180о. Различают
перицентрические и парацентрические инверсии. Перицентрические
инверсии захватывают центромеру. Парацентрические инверсии
захватывают участок плеча без центромеры. Инверсии нарушают
порядок расположения генов в хромосоме.

Транслокации – перемещение участка хромосомы в другое место
внутри хромосомы, на другую хромосому или обмен участками между
хромосомами. Различают реципрокные и нереципрокные транслокации.
При реципрокных транслокациях две хромосомы обмениваются
участками, при нереципрокных участок одной хромосомы переносится
на другую хромосому. В особый тип выделяют Робертсоновские
транслокации (названы в честь У. Р. Робертсона, исследовавшего
механизм слияния хромосом). Робертсоновские транслокации
происходят
между
акроцентрическими
хромосомами.
Акроцентрические хромосомы могут терять спутники и соединяться
между собой с образованием одной хромосомы, несущей генетический
материал двух хромосом.
 Изохромосомы. При нарушении митоза иногда может происходить
разделение центромеры не вдоль, а поперек. При этом образуются две
хромосомы, одна из которых состоит из двух коротких плеч, а другая –
из двух длинных плеч.
 Кольцевые хромосомы. При потере теломерных участков хромосомы
замыкаются в кольцо, что препятствует разрушению хромосомы.
Различают методы полного кариотипирования и экспресс-методы.
При полном кариотипировании определяется общее число хромосом и
наличие или отсутствие хромосомных аббераций. Для общего подсчета числа
хромосом достаточно простой (рутинной) окраски, для выявления
хромосомных аббераций применяют и распределения хромосом по парам
применяют
дифференциальное
окрашивание.
Дифференциальное
окрашивание приводит к появлению линейного рисунка по длине хромосомы
(темные и светлые полосы). Каждая хромосома имеет характерный только
для нее набор полос.
При помощи экспресс-методов можно быстро определить генетический
пол человека (число и соотношение половых хромосом). Обычно для этой
процедуры берут соскоб с обратной стороны щеки, помещают материал на
предметное стекло и окрашивают. Для определения количества Х-хромосом
подсчитывают количество телец Барра. Тельца Барра представляют собой
глыбки хроматина под ядерной мембраной клеток. Они образуются при
инактивации всех Х-хромосом, кроме одной. У женщины активна только
одна Х-хромосома, а вторая инактивирована и представляет собой тельце
Барра. Обе Х-хромосомы одновременно работают только на ранних этапах
эмбриогенеза. У мужчин только одна Х-хромосома и телец Барра под
мембранами клеток не обнаруживается. Таким образом, у нормальной
женщины в большинстве клеток обнаруживается 1 тельце Барра, а у
нормального мужчины телец Барра не обнаруживается.
Если при мужском фенотипе в большинстве клеток обнаруживается
одно телеце Барра, то число Х-хромосом равно двум (число телец Барра + 1),
а мужской фенотип говорит о наличии У-хромосомы. В данном случае
диагностируется синдром Клайнфельтера (47,ХХУ).
Если при женском фенотипе в ядрах клеток не обнаруживается телец
Барра, то в кариотипе присутствует только одна Х-хромосома и
диагностируется синдром Тернера (45,ХО).
При наличии двух телец Барра в ядрах большинства клеток (фенотип
женский) диагностируется синдром трисомии Х (47,ХХХ).
С помощью специальных методов окрашивания можно определить
количество У-хромосом.
Таким образом, к возможностям цитогенетического метода относится:
1. Изучение нормального кариотипа человека.
2. Выявление хромосомных мутаций.
3. Определение генетического пола человека.
Хромосомные болезни
К хромосомным болезням относится большая группа врожденных
наследственных
болезней,
характеризующихся
множественными
врожденными пороками развития.
Причиной хромосомных болезней
являются различные типы хромосомных мутаций. Хромосомные мутации
вызывают нарушение общего генетического баланса, патологические
эффекты проявляются на всех этапах онтогенеза. Предполагают, что
хромосомные мутации являются причиной 45% случаев внутриутробной
гибели плода. Практически все хромосомные мутации (кроме
сбалансированных) ведут к врожденным порокам развития. Общим для всех
хромосомных болезней является множественность поражения (черепнолицевые аномалии, врожденные пороки развития внутренних органов,
отставание в психическом развитии и др.). Вариации в проявлениях
патологии могут быть очень широкими: от летальных случаев до
незначительных отклонений от нормы.
В таблицах приведены названия основных хромосомных синдромов,
кариотипы и некоторые фенотипические признаки больных.
Синдромы, вызванные изменением числа аутосом
Название
1. Синдром Дауна
Кариотип
Частота
встречаемост
и
Признаки
47,ХХ+21
1:700-1:800
Монголоидный разрез глаз,
круглое
уплощенное
лицо,
крупный язык, низкий рост,
задержка умственного развития,
врожденные пороки развития.
1:5000-1:7000
Множественные
врожденные
пороки развития внутренних
органов, головного мозга, глаз и
лицевой
части
черепа
(расщелины верхней губы и
неба).95% детей умирают до 1
года.
47,ХХ+18
1:5000-1:7000
47,ХУ+18
(соотношение
мальчиков и
девочек 1:3)
Множественные
врожденные
пороки развития лицевой части
черепа (низко расположенные
деформированные
ушные
раковины), сердца и др. органов,
костной
системы
(стопакачалка), половых органов. 90%
детей умирают до 1 года.
47,ХХ+8
1:5000
47,ХУ+8
(соотношение
мальчиков и
девочек 5:2)
47,ХУ+21
2. Синдром Патау
47,ХХ+13
47,ХУ+13
3. Синдром Эдвардса
4. Синдром трисомии 8
(90% мозаичные
формы)
Отставание
в
умственном
развитии,
отсутствие
надкленника,
вывернутая
нижняя губа, оттопыренные
ушные раковины с упрощенным
рисунком,
пороки
опорнодвигательного
аппарата
и
мочевой
системы.
Редко
доживают до 17 лет.
Синдромы, вызванные изменением числа половых хромосом
Название
1. Синдром
Кариотип
47, ХХХ
трисомии Х
2.Синдромы
полисомии Х
3.Синдром
Клайнфельтера
4.Синдром
ШерешевскогоТёрнера
5. Синдром дисомии по
У-хромосоме
48,ХХХХ
Частота
встречаемости
1:1000
У
некоторых женщин
новорожденных нарушения
девочек
репродуктивной функции,
повышен риск спонтанных
абортов.
Редко
49,ХХХХХ
47,ХХУ
Признаки
Отклонения в умственном
развитии, аномалии зубов,
скелета и половых органов.
Высокий
рост,
гинекомастия, женский тип
48,ХХХУ новорожденных
телосложения
и
мальчиков
оволосения
на
лобке,
49,ХХХХУ
бесплодие.
49,ХХХУУ
45,ХО
47,ХУУ
1:500 – 1:700
1:2000 – 1:5000 Гипогонадизм,
недоразвитие
половых
новорожденных
органов
и
вторичных
девочек
половых
признаков,
врожденные
пороки
развития, низкий рост,
крыловидные складки на
шее.
?
Высокий рост, нормальное
умственное и физическое
развитие,
предположительно
склонность
к
агрессивности.
Синдромы, вызванные изменением структуры хромосом
Название
Кариотип
Частота
встречаемости
Признаки
кошачьего
5р-
1:45 000
Плач детей напоминает
кошачье
мяуканье
(изменение
хрящей
гортани).
Лунообразное
лицо,
микроцефалия,
эпикант, антимонголоидный
разрез глаз, плоская спинка
носа, врожденные пороки
сердца.
10%
больных
достигают
10-летнего
возраста.
2.Синдром
ВольфаХиршхорна
4р-
1:100 000
Многочисленные
врожденные
пороки
развития с последующей
резкой
задержкой
физического
и
психомоторного развития.
Наблюдается микроцефалия,
аномальные
ушные
раковины,
клювовидный
нос, расщелины верхней
губы
и
неба
и
др.
Большинство умирают до 1
года.
3.Синдром частичной
трисомии 9
9р+
Описано около
200 больных
Задержка роста, умственная
отсталость,
антимонголоидный разрез
глаз, глубоко посаженые
глаза,низко расположенные
уши. Прогноз для жизни
благоприятный.
1.Синдром
крика