МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ Источник: http://www.ssmu.ru/ofice/f4
реклама
МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ Источник: http://www.ssmu.ru/ofice/f4/micro/guide/Content/ecology/Eco1.html ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Микроорганизмы обитают во всех природных средах и являются обязательными компонентами любой экологической системы и биосферы в целом. Качественный и количественный состав микроорганизмов, обнаруживаемых в почве, воде, воздухе, на растениях, пищевых продуктах, в организме человека и животных, различен. Выяснение экологии микроорганизмов служит основой для понимания явлений паразитизма, природно-очаговых и зоонозных заболеваний, а также для разработки противопаразитических мероприятий в борьбе с различными инфекционными болезнями. Микрофлора почвы Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов, которые принимают участие в процессах формирования и очищения почвы, а также круговорота веществ в природе. Жизнедеятельность микроорганизмов в почве, их качественный и количественный состав определяется почвенными условиями: наличием питательных веществ, влажностью, аэрацией, реакцией среды, температурой и т.д. Большое влияние, как на общую численность, так и на соотношение отдельных систематических групп микроорганизмов оказывает тип почвы. Различаясь по физическим и химическим свойствам почва представляет различную среду для жизнедеятельности микроорганизмов. Их больше в увлажненной и обработанной почве (4,2-5,2 млрд/г), меньше в лесной почве, в песках (0,9-1,2 млрд/г). Наиболее обильна микрофлора в верхнем горизонте почвы глубиной 2,5-15 см. В этом слое протекают основные биохимические процессы превращения органических веществ, обусловленные жизнедеятельностью микроорганизмов. На глубине 4-5 м число микроорганизмов значительно снижается, так как уменьшается количество питательных веществ и ухудшаются условия аэрации В составе микрофлоры почвы выделяют следующие группы микроорганизмов: бактерии аммонификаторы, вызывающие гниение трупов животных, остатков растений, разложение мочевины с образованием аммиака и других продуктов: аэробные бактерии - B . subtilis , B . mesentericus , Serratia marcescens ; бактерии рода Proteus ; грибы рода Aspergillus , Mucor , Penicillium ; анаэробы - C . sporogenes , C . putrificum ; уробактерии - Urobacillus pasteuri , Sarcina urea , расщепляющие мочевину; нитрифицирующие бактерии: Nitrobacter и Nitrosomonas ( Nitrosomonas окисляют аммиак до азотистой кислоты, образуя нитриты, Nitrobacter превращают азотистую кислоту в азотную и нитраты); азотфиксирующие бактерии: усваивают из воздуха свободный кислород и в процессе своей жизнедеятельности из молекулярного азота синтезируют белки и другие органические соединения азота, используемые растениями; бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов серобактерии, железобактерии и т.д. (серобактерии окисляют сероводород до серной кислоты, железобактерии окисляют соединения железа до гидрата окиси железа, фосфорные бактерии способствуют образованию легко растворимых соединений фосфора); бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие брожение (молочнокислые, спиртовые, маслянокислые, уксусные, протионовые и др.). С выделениями человека и животных, с фекально-бытовыми сточными водами в почву могут попадать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы (возбудители грибковых заболеваний, ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы, бруцеллеза, лептоспироза, кишечных инфекций и др.). Санитарно-бактериологическое исследование почвы При исследовании почвы может проводиться полный или краткий анализ. Полный санитарно-бактериологический анализ почвы проводится: для подробной и глубокой характеристики санитарного состояния почвы; для определения пригодности почвы при размещении жилья, мест отдыха, детских учреждений и водопроводных сооружений; для эпидемиологических исследований. Краткий анализ рекомендуется при осуществлении текущего санитарного надзора и включает определение общего количества сапрофитных бактерий, БГКП (коли-титр и коли-индекс), клостридий (перфрингенс-титр), термофильных бактерий, нитрифицирующих. В полный санитарно-бактериологический анализ входят дополнительно: определение актиномицетов, грибов, сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, бруцеллеза, сибирской язвы. Подготовка почвы Почву освобождают от включений - камней, осколков стекла и др. Крупные агрегаты почвы дробят. Навеску почвы в количестве 30 г заливают стерильной водопроводной водой в соотношении 1:10. Полученную суспензию встряхивают 10 мин и отстаивают 2-5 мин. Из первого разведения 1:10 готовят ряд последующих 10-ти кратных разведений от 1:10 до 1:1000 при исследовании чистых почв и до 1:10 000 при исследовании сильно загрязненных почв. Определение общего количества сапрофитных бактерий Микробное число почвы - общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы. Посев почвенной суспензии производят на МПА в чашки Петри по 1 мл из каждого разведения. Затем в чашки выливают по 7-10 мл расплавленного и остуженного до 45 ° С агара. Посевы инкубируют при 28-30 ° С в течение 72 ч и подсчитывают количество выросших колоний. Если на чашке Петри вырастает более 150 колоний, то подсчет ведется на ¼ площади с последующим перерасчетом на всю площадь. Из суммы колоний, подсчитанных на всех чашках Петри, выводится среднее арифметическое и затем определяют количество микроорганизмов в 1 г почвы с учетом разведений. Определение бактерий группы кишечной палочки Коли-индекс - количество жизнеспособных E . coli в 1 г почвы. При анализе малозагрязненных почв используют метод мембранных фильтров. При предполагаемой невысокой степени фекального загрязнения рекомендуется применение титрационного метода. При высокой степени фекального загрязнения рекомендуется метод прямого посева почвенной суспензии (1:10) на среду Эндо. Метод мембранных фильтров . Почвенную суспензию 1:10 центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, затем 5-10 мл суспензии фильтруют через мембранные фильтры ©3 в аппарате Зейтца. После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии. Чашки Петри инкубируют при 37 ° С 24 ч. При наличии в почве БГКП на фильтрах появляются колонии типичные для кишечных палочек - темно-красные с металлическим блеском или розовые с красным центром. Из таких колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Для отличия бактерий семейства Enterobacteriaceae от Pseudomonadaceae ставят оксидазный тест. Для этого на культуру микроорганизмов в чашке Петри наносят индикатор - 1% раствор диметилпарафенилендинитролазы. В положительном случае через 15-20 мин появляется темно-синее окрашивание. Колонии учитывают как БГКП, если они образованы грамотрицательными палочками, ферментирующими глюкозу до кислоты и газа и не обладающие протеолитической активностью. Колонии подсчитывают на тех фильтрах, на которых из соответствующего разведения почвенной суспензии выросло не более 30-50 колоний. Пересчитывают количество выросших колоний на фильтрах на 1 г почвы и определяют коли-индекс. Коли-титр почвы - наименьшее количество почвы, в котором обнаруживается жизнеспособная E . coli . Титрационный метод . Из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы в питательную среду Кесслера (1% пептона, 5% желчи, 0,25% лактозы, генциановый фиолетовый). Из разведений 1:10 10 мл засевают во флакон с 50 мл среды, что соответствует 1 г почвы. Посев меньших количеств (0,1 и 0,01) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл среды. Отсутствие во всех пробирках роста и газообразования указывает на отсутствие БГКП. Если в посевах обнаруживается рост или рост и газообразование, делают высев в чашки Петри со средой Эндо или в пробирки с розоловым агаром, инкубируют 24 ч при 37 ° С и проводят дальнейшую идентификацию выделенных бактерий. Результат выражают в коли-титре. Определение перфрингенс-титра Перфрингенс-титр почвы - наименьшее весовое количество почвы, выраженное в граммах, в котором обнаруживается жизнеспособная клетка C . perfringens . Определение перфрингенс-титра является важным критерием для санитарной оценки почвы и ее самоочищения, так как в почве, загрязненной фекалиями, уже через 4-5 мес эшерихии исчезают, а C . perfringens обнаруживаются в титре 0,01. Перфрингенс-титр дает возможность судить о давности фекального загрязнения. Из приготовленных разведений почвенной суспензии по 1 мл переносят в два параллельных ряда пробирок. Один ряд прогревают при 80 ° С 15 мин. Затем во все пробирки наливают по 9-10 мл расплавленной и охлажденной до 45 ° среды Вильсона-Блер. Инкубацию посевов проводят при 43 ° 24 ч, но уже через 2-3 ч при положительном результате можно наблюдать в толще агара образование круглых колоний черного цвета. В мазках приготовленных из колоний видны характерные грамположительные палочки. Определение термофильных бактерий Учет термофильных бактерий производят на МПА, разлитом в чашки Петри более толстым слоем, чем обычно. Посев делают из разведений 1:10, 1:100, 1:1000, причем из каждого разведения рекомендуется засевать по 2-3 параллельные чашки. Термофильные бактерии выращивают при температуре около 60 ° . Результат учитывают через 24 ч после посева. Подсчет количества бактерий проводят на 1 г почвы. Санитарно-микробиологическая оценка почвы Ее производят по комплексу показателей. Для санитарной оценки почвы необходимо пользоваться показателями таблицы 1. Таблица 1 Схема санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям Титры Категория почв Чистая Загрязненная Сильно загрязненная Число термофильных бактерий в 1 г 1 и выше 0,9-0,01 перфрингенститр 0,01 и выше 0,009-0,0001 0,09 и ниже 0,00009 и ниже 100 000-4 000 000 коли-титр 100-1 000 1 000-100 000 Микрофлора воды Вода является естественной средой обитания разнообразных микроорганизмов. Микрофлора воды делится на две группы: автохтонную и аллохтонную. Автохтонная или собственная микрофлора представлена микроорганизмами, постоянно живущими и размножающимися в воде. В состав этой группы входят Micrococcus candicans , Sarcina lutea , Pseudomonas fluorescens , Bacillus cereus и др. Аллохтонная или заносная микрофлора попадает в открытые водоемы из почвы, воздуха, организмов животных и человека и резко изменяет микробный биоценоз и санитарный режим. Количественный и качественный состав микрофлоры воды зависит от состава и концентрации минеральных и органических веществ, температуры, рН, скорости движения воды, массивности поступления ливневых, фекально-бытовых и промышленных сточных вод. Количество микробов прямо пропорционально степени загрязненности водоемов. Особенно богаты микроорганизмами пруды, ручьи, озера густо населенных районов. В закрытых водоемах (озера, пруды) наблюдается определенная закономерность в распределении бактерий. Состав микроорганизмов различен на поверхности воды и на дне водоемов. Наиболее обильно заселена микроорганизмами вода на глубине 10-100 см. В более глубоких слоях их количество значительно снижается. Ключевые воды и воды артезианских колодцев наиболее чисты. Хотя вода и является неблагоприятной средой для существования условнопатогенных и патогенных микроорганизмов, отдельные их представители способны существовать в ней определенное время, а в некоторых случаях и размножаться. Многие годы в воде могут сохраняться споры возбудителя сибирской язвы, несколько месяцев - энтеровирусы, сальмонеллы, лептоспиры, несколько недель - возбудители холеры, дизентерии, бруцеллы. Санитарно-бактериологическое исследование воды Исследованию подлежит вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов, бассейнов, сточные воды. Отбор проб водопроводной воды . Кран стерилизуют обжиганием с последующим стоком воды в течение 10 мин при полностью открытом кране. Пробу воды забирают в стерильную стеклянную посуду с плотно закрывающимися пробками. Доставка воды производится в контейнераххолодильниках при температуре 4-10 ° С. Для оценки санитарно-бактериологического состояния воды используют следующие показатели: определение общего микробного числа (ОМЧ); определение бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий; определение спор сульфитредуцирующих клостридий; определение колифагов; определение патогенных бактерий кишечной группы. Исследование питьевой воды на наличие колифагов, патогенных бактерий кишечной группы проводится по эпидемиологическим показателям. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий проводится при оценке эффективности технологий обработки воды. Определение общего микробного числа (ОМЧ) Для определения ОМЧ вносят два объема воды по 1 мл в стерильные чашки Петри, в которые выливают по 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45 ° С МПА. Содержимое чашки смешивают, оставляют до застывания агара и помещают в термостат на 24 ч. Подсчитывают количество колоний на чашках, вычисляют среднее арифметическое. Результат выражают числом КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл воды. Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками бактерий семейства Enterobacteriaceae , но они способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 °С в течение 24 ч. Для выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий используют два метода: метод мембранных фильтров и титрационный метод. Метод мембранных фильтров . Необходимый объем воды - 300 мл -фильтруют через мембранные фильтры по 100 мл. Фильтры переносят на среду Эндо в чашке Петри и инкубируют при 37 ° С 24 ч. Подсчитывают число красных и красных с металлическим блеском колоний. Идентификацию бактерий проводят по оксидазному тесту и тесту образования кислоты и газа при ферментации лактозы (маннита) для чего исследуют не менее 10 колоний. Так как, микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae и термотолерантные колиформные бактерии не обладают оксидазной активностью, то оксидазоположительные культуры дальше не исследуются. Все лактозоположительные колонии засевают в две пробирки с одной из лактозных сред и 1 пробирку инкубируют при 37 ° (для культивирования микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae ), а другую при 44 ° (для культивирования термотолерантных колиформных бактерий). Учитывают бактерии семейства Enterobacteriaceae - показатели давнего фекального загрязнения воды и термотолерантные колиформные бактерии - показатели свежего фекального загрязнения. Результаты анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий в 100 мл воды. Титрационный метод . Принцип метода заключается в посеве установленного объема воды (300 мл - 3 объема по 100 мл - качественный анализ и 333 мл - 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл, 3 объема по 1 мл - количественный анализ) в лактозно-пептонную (или глюкозо-пептонную) среду, с последующим пересевом в среду Эндо и идентификацией культуры по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам для определения бактерий семейства Enterobacteriaceae . Для выявления термотолерантных колиформных бактерий делают посев 2-3 изолированных колоний в пробирки с лактозной средой, нагретой на водяной бане или в термостате до 44 ° С. При обнаружении бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий хотя бы в одном из трех объемов делают заключение - об обнаружении колиформных бактерий в 100 мл воды. Определение спор сульфитредуцирующих бактерий Сульфитредуцирующие клостридии, преимущественно C . perfringens - спорообразующие анаэробные палочки, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 ° в течение 24 ч. Определение сульфитредуцирующих клостридий проводят двумя методами: метод мембранных фильтров и прямым посевом. Метод мембранных фильтров . Метод основан на фильтровании воды через мембранные фильтры, выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в анаэробных условиях и подсчете черных колоний. Результаты анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды. Метод прямого посева . Производят посев 20 мл воды в пробирки с железо-сульфитным агаром (2 объема по 10 мл в 2 пробирки или 4 объема по 5 мл в 4 пробирки) инкубируют при 44 ° С 24 ч и посчитывают черные колонии. Результаты выражают числом КОЕ в 20 мл воды. Определение колифагов Колифаги - вирусы, лизирующие кишечную палочку и образующие зоны лизиса (бляшки) на бактериальном газоне.Определение колифагов проводят прямым и титрационным методами. Прямой метод . Исследуемую воду вносят в 5 стерильных чашек по 20 мл. В 6-ю контрольную воду не берут. Затем во все чашки заливают расплавленный и остуженный до 45 ° агар с добавлением суточной культуры E .сoli , штамм К 2 (1,5 мл смыва E .сoli в концентрации 10 9 на 150 мл агара). Перемешивают, оставляют для застывания и инкубируют при 37 ° С 24 ч. Учитывают результат подсчетом бляшек в чашках Петри в БОЕ (бляшкообразующих единицах) в 100 мл воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать. Титрационный метод . В основе метода - предварительное подращивание колифагов в среде обогащения в присутствии E .сoli и последующее выявления бляшек колифага на газоне E .сoli . Определение бактерий родов сальмонелла и шигелла Для выявления патогенных энтеробактерий исследуемый объем воды (не менее 2-3 мл) засевают в среды обогащения (Мюллера-Кауфмана, магниевая среда) с последующим высевом на плотные селективные и дифференциально-диагностические среды Плоскирева, Эндо, Левина, висмут-сульфитный агар. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и серологическим свойствам. Оценка воды по микробиологическим показателям Критерии оценки воды разработаны дифференциально в зависимости от ее категории и назначения. Вода плавательных бассейнов по своим качествам должна соответствовать ГОСТу питьевой воды (табл. 2). Таблица 2 Нормативы качества питьевой воды Показатели 1. Общее микробное число 2. Бактерии семейства Enterobacteriaceae 3. Термотолерантные колиформные бактерии 4. Споры сульфитредуцирующих клостридий 5. Колифаги Единицы измерения КОЕ в 1 мл воды Число кишечных бактерий в 300 мл воды Число кишечных бактерий в 300 мл воды Число спор в 20 мл воды Нормативы Не более 50 Отсутствие Число БОЕ в 100 мл воды Отсутствие Отсутствие Отсутствие Примечание. КОЕ - колониеобразующая единица;БОЕ - бляшкообразующая единица Микрофлора воздуха Микроорганизмы в воздухе находятся постоянно, несмотря на то, что атмосфера является неблагоприятной средой для их размножения, что обусловлено отсутствием питательных веществ и недостатком влаги. Жизнедеятельность микроорганизмов в воздухе обеспечивают взвешенные частицы воды, слизи, пыли и т.д. Атмосферный воздух и воздух закрытых помещений значительно различаются по количественному и качественному составу микрофлоры. Состав микрофлоры атмосферного воздуха зависит от интенсивности солнечной радиации, ветра, метеоосадков, покрова почвы, плотности населения и др. Меньше всего микробов в воздухе над лесами, морями, снегами. Больше приходится на слои воздуха, расположенные над промышленными городами. В атмосферном воздухе находятся споры грибов, актиномицетов, бацилл, дрожжи, микрококки, сарцины, стафилококки др. Обсемененность микроорганизмами воздуха закрытых помещений превышает бактериальную загрязненность атмосферного воздуха. Особенно велико число микроорганизмов в многолюдных общественных помещениях. Воздух закрытых помещений содержит в основном микрофлору дыхательных путей и кожи человека, многие представители которой способны переживать в воздухе в течение времени, достаточного для инфицирования людей. Микроорганизмы, находящиеся в воздушной среде, могут явиться причиной различных инфекционных заболеваний - гриппа, ангины, кори, скарлатины и др Санитарно-бактериологическое исследование воздуха Микробиологическое исследование атмосферного воздуха, а также воздуха жилых помещений, занимает важное место при осуществлении его очистки от бактериального загрязнения, как мера борьбы с аэрогенными инфекциями. Объектами санитарно-бактериологического исследования являются: воздух лечебнопрофилактических и детских учреждений, мест массового скопления людей, промышленных районов (табл. 3). Для оценки работы вентиляции проводят исследование воздуха на различных этажах жилых зданий. Исследование воздуха включает определение общего числа сапрофитных бактерий, стафилококков, стрептококков, которые являются показателями биологической контаминации воздуха микрофлорой носоглотки человека. При исследование воздуха родильных домов, хирургических клиник определяют УПМ, вызывающие внутрибольничные инфекции. Методы отбора проб воздуха можно разделить на седиментационные и аспирационные. Седиментационный метод . Основан на оседании бактериальных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытых чашек Петри. Их устанавливают в точках отбора на горизонтальной поверхности. Для определения общей микробной обсемененности воздуха чашки Петри с МПА оставляют открытыми на 5-10-15 мин в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения. Для выявления санитарнопоказательных микроорганизмов экспозиция чашек с элективными средами увеличивается до 30-60 мин. Инкубацию посевов проводят при 37 ° 24 ч, затем чашки Петри оставляют при комнатной температуре на 48 ч для образования пигмента пигментообразующими бактериями. Для определения микробного числа подсчитывают колонии выросшие на чашках Петри (площадь поверхности агара в чашке равна 75 см 2 ) и расчет ведут по правилу В.Л. Омелянского: на поверхность площадью 100 см 2 за 5 мин оседает такое количество микробов, которое содержится в 10 л воздуха. А х 100 х 100 Х = ———————— 75 см 2 Х - количество микробов в 1 м 3; А - количество колоний на агаре в чашке Петри. Аспирационный метод . Основан на принудительном оседании микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость. Для этой цели используются аппарат Кротова, бактериоуловитель Речменского, прибор ПОВ-1 и др. Для определения общего числа бактерий забирают две пробы по 100 л каждая. Посевы инкубируют в термостате 24 ч, а затем оставляют на 48 ч при комнатной температуре. Подсчитывают количество колоний на чашках, вычисляют среднее арифметическое и делают перерасчет на количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха. Определение стафилококков Обнаружение патогенных стафилококков в воздухе закрытых помещений имеет санитарно-показательное значение и свидетельствует об эпидемическом неблагополучии (табл. 4). Отбор проб проводят с помощью аппарата Кротова в количестве 250 л воздуха на 2 чашки Петри с молочно-солевым агаром и на чашку с кровяным агаром. Посевы инкубируют при 37 ° С 48 ч. Из подозрительных на стафилококк колоний выделяют чистую культуру на скошенном агаре. После 24 ч инкубации при 37 ° проверяют плазмокоагулирующую активность культуры. При необходимости установления источника возникновения стафилококковой инфекции и путей ее распространения проводят фаготипирование культуры. Подсчитывают количество выросших колоний стафилококка в 1 м 3 воздуха. Определение стрептококков Отбор проб воздуха при исследовании на наличие a- и b- гемолитических стрептококков проводят аппаратом Кротова на чашках Петри с кровяным агаром. Исследуют 250 л воздуха. Посевы выдерживают в термостате 24 ч, а затем еще 48 ч при комнатной температуре. Подсчет количества выросших колоний проводят на 1 м 3 с последующим контрольным микроскопированием и выборочным пересевом колоний на кровяной агар или сахарный бульон. Таблица 3 Критерии оценки воздуха жилых помещений Оценка воздуха Лето чистый загрязненный Зима чистый загрязненный Общее количество бактерий в 1 м 3 Количество стрептококков до 1500 до 2500 до 16 до 36 до 4500 до 7000 до 36 до 124 Таблица 4 Критерии оценки воздуха лечебно-профилактических учреждений Наименование объекта Условия работы Операционная до операции после операции Послеопера-ционные палаты Отделение реанимации - Допустимые показатели в 1 м 3 микробное патогенных стрепточисло стафилококков кокков до 500 не должно не должно быть быть не должно не должно до 1000 быть быть до 750 не должно не должно быть быть до 750 не должно не должно быть быть Родильные залы при поступлении рожениц, приеме родов Послеродовые палаты Палаты новорожденных Перевязочные до начала работ до 1500 не должно быть не должно быть до 2000 до 1500 до 16 суммарно до 12 суммарно до 750 Послеоперационные летом палаты зимой до 3500 не должно быть до 24 не должно быть до 16 до 5000 до 52 до 36 Микрофлора организма человека Микрофлору человека составляет совокупность микробных биоценозов, встречающихся в организме здоровых людей и сформировавшихся в процессе эволюции. Данные биоценозы характеризуются относительным постоянством, однако, качественный и количественный состав микрофлоры организма человека меняется в течение жизни и зависит от пола, возраста, питания, климата и др. Кроме того, изменения микробных биоценозов могут быть обусловлены возникновением заболеваний, применением химиотерапевтических и иммунологических средств. Микроорганизмы заселены в кожные покровы и слизистые оболочки многих органов и полостей, сообщающихся с внешней средой. Кровь, лимфа, внутренние органы, головной и спинной мозг, спинномозговая жидкость стерильны. Микрофлору организма человека можно условно разделить на две группы: облигатную (или резидентную, аутохтонную) и факультативную (или транзиторную). К облигатной микрофлоре относятся микроорганизмы максимально приспособленные к существованию в организме человека и закономерно встречающиеся в его органах и полостях. Факультативная микрофлора является временной, необязательной и определяется микробной обсемененностью окружающей среды и состоянием резистентности организма человека. В состав резидентной и транзиторной микрофлоры входят сапрофитные и условно-патогенные микроорганизмы. В последнее время все большее значение в патологии человека приобретают внутрибольничные или госпитальные инфекции, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы, относящиеся к резидентной микрофлоре человека. Их патогенность реализуется при ослаблении резистентности макроорганизма. Микрофлору отдельных биотопов тела человека различна и требует раздельного рассмотрения. Микрофлора кожи Поверхность кожи человека, особенно открытые ее части, обсеменены различными микроорганизмами, здесь определяется от 25 000 000 до 1 000 000 000 особей микробов. Собственная микрофлора кожи человека представлена сарцинами, стафилококками, дифтероидами, некоторыми видами стрептококков, бациллами, грибами и др. Кроме характерной для кожи микрофлоры здесь могут присутствовать транзиторные микроорганизмы, быстро исчезающие под влиянием бактерицидных свойств кожи. Большой способностью к самоочищению обладает чисто вымытая кожа. Бактерицидность кожи отражает общую резистентность организма. Неповрежденные кожные покровы для большинства микроорганизмов, в том числе и патогенных, непроницаемы. При нарушении их целостности и понижении резистентности организма могут возникать заболевания кожи. Санитарно-бактериологическое исследование кожи Санитарно-бактериологическое исследование кожи проводится двумя методами: Посев отпечатков пальцев рук на МПА в чашках Петри с последующим макроскопическим и микроскопическим изучением выросших колоний. Посев смывов с кожи для определения общего микробного числа и кишечной палочки. Тампоном, смоченным в 10 мл стерильного физиологического раствора, тщательно протирают ладони, подногтевые, межпальцевые пространства обеих рук. Тампон прополаскивают в пробирке с физиологическим раствором и исходный смыв исследуют на общее микробное число и наличие кишечной палочки. Определение общего микробного числа 1 мл смыва помещают в стерильную чашку Петри, наливают 12-15 мл расплавленного и остуженного до 45 °МПА, перемешивают содержимое чашки и после застывания агара посевы инкубируют при 37 °С 24-48 ч. Подсчет выросших колоний на поверхности и в глубине агара можно производить при помощи лупы. Определение кишечной палочки Оставшееся количество смыва помещают в пробирку с глюкозопептонной средой. Посевы инкубируют при 43 ° С 24 ч. При наличии газообразования производят высев на среду Эндо. Рост на этой среде красных колоний укажет на наличие в смыве кишечной палочки, свидетельствующей о фекальном загрязнении рук. Микрофлора полости рта В ротовой полости имеются благоприятные условия для развития микроорганизмов: наличие питательных веществ, оптимальная температура, влажность, щелочная реакция слюны. В поддержании качественного и количественного постоянства нормальной микрофлоры полости рта главную роль играет слюна, обладающая антибактериальной активностью за счет содержащихся в ней ферментов (лизоцим, лактоферрин, пероксидаза, нуклеаза) и секреторных иммуноглобулинов. В ротовой полости новорожденных к концу первой недели обнаруживаются стрептококки, нейссерии, лактобактерии, дрожжеподобные грибы, актиномицеты. Количественный и видовой состав микробов полости рта находится в зависимости от диеты и возраста ребенка. Во время прорезывания зубов появляются облигатные грамотрицательные анаэробы. В ротовой полости обнаруживаются более 100 видов микроорганизмов, большинство из которых аэробы и факультативные анаэробы. Основная масса микроорганизмов полости рта локализуется в зубном налете: в 1 мг сухой массы зубного налета содержится около 250 млн микробных клеток. Большое количество микроорганизмов обнаруживается у шейки зуба, в промежутке между зубами и в других участках полости рта, малодоступных обмыванию слюной, а также на слизистых глоточных миндалин. Индивидуальные колебания в качественном и количественном составе микрофлоры полости рта зависят от возраста, диеты, гигиенических навыков, резистентности слизистой оболочки, наличия патологических процессов в зубах и деснах. Резидентную группу бактерий полости рта составляют стрептококки ( Streptococcus salivarius ), непатогенные стафилококки, сапрофитные нейссерии, коринобактерии, лактобациллы, бактероиды, фузиформные бактерии, дрожжеподобные грибы, актиномицеты, микоплазмы ( M . orule ), простейшие ( Entamoeba buccalis ). Среди факультативных микроорганизмов встречаются энтеробактерии (роды Esherichia , Klebsiella , Enterobacter , Proteus ), синегнойная палочка, спорообразующие бактерии (роды Bacillus , Clostridium ), микроорганизмы рода Campylobacter ( C . consicus , C . sputorum ). Для качественного и количественного изучения микрофлоры полости рта используют бактериоскопический и бактериологический методы исследования. Бактериоскопический метод . Исследуемым материалом является зубной налет. Мазок окрашивают по Граму или Бурри и изучают морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов. Бактериологический метод . Материалом для исследования является слизь из зева, которую забирают при помощи стерильного ватного тампона. Делают посев этим же тампоном штрихами на чашку Петри с кровяным агаром. После суточной инкубации при 37 ° С, из выросших колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и изучают морфологические и тинкториальные свойства, выделенной культуры микроорганизмов. Микрофлора желудочно-кишечного тракта При нормальном функционировании желудка микрофлора в нем почти отсутствует, вследствие кислой реакции желудочного сока и высокой активности гидролитических ферментов. Поэтому в желудке могут быть обнаружены в небольшом количестве кислотоустойчивые виды - лактобактерии, дрожжи, Sarcina ventriculi и др (10 6 -10 7 клеток на 1 мл содержимого). В двенадцатиперстной и верхних отделах тонкой кишки микроорганизмов встречается мало, несмотря на то, что кислая среда желудка сменяется щелочной. Это объясняется неблагоприятным воздействием на микробы присутствующих здесь ферментов. Тут обнаруживаются энтерококки, молочнокислые бактерии, грибы, дифтероиды (10 6 клеток на 1 мл содержимого). В нижних отделах тонкой кишки, постепенно обогащаясь, микрофлора сближается с микрофлорой толстой кишки. Микрофлора толстой кишки наиболее разнообразна по числу видов (более 200 видов) и количеству обнаруживаемых микробов (10 9 -10 11 клеток на 1 мл содержимого). Микробы составляют 1/3 сухой массы фекалий. Облигатная микрофлора представлена анаэробными (бактероиды, бифидумбактерии, вейлонеллы) бактериями (96-99%) и факультативными анаэробами ( E . coli , энтерококки, лактобациллы - 1-4%). Транзиторная микрофлора представлена следующими родами и видами: протей, клебсиеллы, клостридии, синегнойная палочка, кампилобактер, дрожжеподобные грибы рода Candida и др. Микроорганизмы рода Campylobacter ( C. fennelliae, C. cinaedi, C. hyointestinalis ) встречаются в толстом кишечнике человека при иммунодефицитных состояниях различной природы. Состав микрофлоры кишечника меняется в течение жизни человека. У новорожденных в первые часы после рождения меконий стерилен - асептическая фаза. Вторая фаза - фаза возрастающей обсемененности (первые три дня жизни ребенка). В этот период в кишечнике преобладают эшерихии, стафилококки, энтерококки, дрожжеподобные грибы. Третья фаза - фаза трансформации флоры кишечника (начиная с 4 дня жизни). Устанавливается молочнокислая микрофлора, лактобактерии, ацидофильные бактерии. После окончания грудного вскармливания начинает постепенно формироваться постоянный биоценоз в пищеварительном тракте. В микрофлоре желудочно-кишечного тракта различают мукозную (М) и просветную (П) микрофлору, состав которой различен. М-флора тесно ассоциирована со слизистой оболочкой, более стабильна и представлена бифидумбактериями и лактобактериями. Мфлора препятствует пенетрации слизистой оболочки патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. П-флора наряду с бифидум- и лактобактериями включает и других постоянных обитателей кишечника. Для изучения микрофлоры толстого кишечника исследованию подвергают испражнения, которые забирают стерильной деревянной или стеклянной палочкой и помещают в пробирку с консервантом. Материал доставляют в лабораторию в течение 1 часа, так как при более длительном хранении значительно нарушаются взаимоотношения между видами. Проводят микроскопическое исследование мазков и фекалий, окрашенных по Граму, а так же производят посев испражнений на питательные среды: Эндо, кровяной агар, молочносолевой агар, агар Сабуро. Посев производят с таким расчетом, чтобы можно было подсчитать количество колоний с различной характеристикой и определить число микробных клеток разных видов микроорганизмов в данной пробе. При необходимости проводят биохимическую идентификацию и серологическое типирование видов. Микрофлора дыхательных путей В дыхательные пути вместе с воздухом попадают пылевые частички и микроорганизмы, 3/4-4/5 которых задерживаются в полости носа, где и погибают через некоторое время вследствие бактерицидного действия лизоцима и муцина, защитной функции эпителия, деятельности фагоцитов. В состав облигатной микрофлоры носовых ходов входят стафилококки, коринебактерии. Факультативная микрофлора представлена золотистым стафилококком, стрептококками, непатогенными нейссериями. Микрофлора носоглотки представлена стрептококками, бактероидами, нейссериями, вейлонеллами, микобактериями. Слизистая оболочка трахеи и бронхов стерильна. Мелкие бронхи, альвеолы, паренхима легких человека свободны от микроорганизмов. Для микробиологического исследования материал из носа берут стерильным тампоном, а из носоглотки - стерильным заднеглоточным тампоном. Делают посев на кровяной агар и желточно-солевой агар. Выделенную культуры идентифицируют. Материал, оставшийся на тампоне, используют для приготовления мазков, которые окрашивают по Граму и Нейссеру. Микрофлора конъюнктивы В значительном проценте случаев микрофлора конъюнктивы отсутствует, что обусловлено бактерицидными свойствами слезной жидкости. В отдельных случаях на конъюнктиве глаза могут обнаруживаться стафилококки, коринебактерии ( Corinebacterium xerosis ), микоплазмы. При снижении естественной защиты организма, нарушении зрения, гиповитаминозах нормальная микрофлора слизистых оболочек глаз может вызывать различные заболевания: конъюнктивиты, блефориты и другие нагноительные процессы. Микрофлора уха В наружнем слуховом проходе обнаруживаются непатогенные стафилококки, коринебактерии, дрожжеподобные и плесневые грибы ( Aspergillus ), которые в определенных условиях являются возбудителями патологических процессов. Во внутреннем и среднем ухе микробы в норме не содержатся. Микрофлора мочеполовой системы Почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре стерильны. В мочеиспускательном канале мужчин обитают стафилококки, дифтероиды, бактероиды, микобактерии, грамотрицательные непатогенные бактерии. Уретра женщин стерильна. На наружных половых органах мужчин и женщин обнаруживаются микобактерии смегмы ( M . smegmatis ), стафилококки, коринебактерии, микоплазмы ( M . hominis ), сапрофитные трепонемы. Состав влагалищной микрофлоры разнообразен, непостоянен и зависит от уровня гликогена в клетках эпителия и рН влагалищного секрета, что связано с функцией яичников. Заселение влагалища лактобактериями происходит сразу после рождения. Затем в микробиоценоз включаются энтерококки, стрептококки, стафилококки, коринебактерии. Кокковая флора становится ведущей и характерной для периода детства вплоть до наступления полового созревания. С наступлением половой зрелости в составе микрофлоры преобладают аэробные и анаэробные молочнокислые бактерии, доминирует группа бактерий Додерлейна. Различают несколько категорий чистоты влагалища здоровых женщин: 1-я категория - в мазках-препаратах обнаруживаются палочки Додерлейна, других видов микроорганизмов почти нет; 2-я категория - кроме молочнокислых бактерий встречается небольшое количество грамположительных диплококков; 3-я категория - уменьшается количество молочнокислых бактерий, увеличивается количество лейкоцитов и другой микрофлоры; 4я категория - обильное количество лейкоцитов и различной микрофлоры, палочки Додерлейна почти отсутствуют. 1 и 2 категории наблюдаются у здоровых женщин, 3 и 4 у женщин с воспалительными процессами во влагалище. Полость матки у здоровых женщин стерильна. Значение нормальной микрофлоры организма человека Эволюционно сложившиеся отношения человека с его микрофлорой играют важную роль в нормальном функционировании организма. Положительная роль нормальной микрофлоры связана с витаминизирующим, ферментативным, антагонистическим и другими свойствами. Облигатная микрофлора (кишечная палочка, лактобактерии, бифидумбактерии, некоторые виды грибов) обладает выраженными антагонистическими свойствами в отношении некоторых возбудителей инфекционных заболеваний. Антагонистические свойства нормальной микрофлоры связаны с образованием антибиотических веществ, бактериоцинов, спиртов, молочной кислоты и других продуктов, ингибирующих размножение патогенных видов микроорганизмов. Некоторые энтеробактерии ( E . coli ) синтезируют витамины группы В, витамин К, пантотеновую и фолиевую кислоты, в которых нуждается макроорганизм. Активными продуцентами витаминов также являются молочнокислые бактерии. Велика роль микрофлоры в формировании резистентности организма. При нарушении состава нормальной микрофлоры у гнотобионтов (безмикробных животных) наблюдается гипоплазия лимфоидной ткани, снижение клеточных и гуморальных факторов иммунитета. Микрофлора желудочно-кишечного тракта оказывает влияние на морфологическую структуру слизистой оболочки кишечника и ее адсорбционную способность; расщепляя сложные органические вещества эти микроорганизмы способствуют пищеварению. Установлено, что такой постоянный обитатель кишечника как C . perfringens , обладает свойством вырабатывать пищеварительные ферменты. Для нормального функционирования организма человека важным является взаимоотношение макроорганизма и населяющей его микрофлоры. При нарушении сложившихся взаимоотношений, причиной которых могут быть переохлаждение, перегревание, ионизирующая радиация, психические воздействия и др, микробы из мест своего обычного обитания распространяются, проникая во внутреннюю среду и вызывая патологические процессы. Дисбиоз Дисбиоз - качественное и количественное нарушение экологического баланса между микробными популяциями в составе микрофлоры организма человека. Дисбиоз возникает при воздействии дестабилизирующих факторов, таких как, нерациональное использование антибиотиков широкого спектра действия, антисептиков, резкое снижение резистентности организма, вследствие хронических инфекций, радиации и др. При дисбиозах происходит подавление микробов-антагонистов, регулирующих состав микробного биоценоза и размножение условнопатогенных микроорганизмов. Таким путем происходит нарастание и распространение микроорганизмов из родов Pseudomonas , Klebsiella , Proteus , являющихся причиной внутрибольничных инфекций, дрожжеподобных грибов Candida albicans , вызывающих кандидозы, E . coli , являющейся возбудителем колиэнтеритов и др. Для лечения дисбиозов применяются эубиотики, препараты, получаемые из живых микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры организма человека. К этим препаратам относятся колибактерин (живые бактерии кишечной палочки, штамм М-17), бифидумбактерин (взвесь живых B . bifidum , штамм n 1), лактобактерин (взвесь живых штаммов Lactobacterium ), бификол (комплексный препарат состоящий из взвеси живых бифидумбактерий, штамм n 1 и кишечных палочек, штамм М-17). Микрофлора пищевых продуктов Многие пищевые продукты являются благоприятной средой не только для сохранения, но и для размножения микроорганизмов. Всю микрофлору пищевых продуктов условно делят на специфическую и неспецифическую. К специфической микрофлоре относятся штаммы микроорганизмов, применяющихся в процессе технологического производства продуктов питания (молочнокислые продукты, хлебные изделия, пиво, вина и др). К неспецифической микрофлоре относится случайная микрофлора, попадающая в пищевые продукты при их заготовке, доставке, переработке и хранении. Источником этих микробов может быть сырье, воздух, вода, оборудование, животные, человек. Инфицирование пищевых продуктов микроорганизмами может приводить к возникновению у людей пищевых токсикоинфекций и др. заболеваний. Микробиологические критерии безопасности пищевых продуктов делятся на четыре группы: Санитарно-показательные микроорганизмы: БГКП, при этом учитываются бактерии рода Escherichia , Klebsiella , Citrobacter , Enterobacter , Serratia . Потенциально-патогенные микроорганизмы: коагулазоположительные стафилококки, бактерии рода Proteus , сульфитредуцирующие клостридии, B . cereus . Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы. Микроорганизмы - показатели микробиологической стабильности продукта (дрожжи, грибы-плесени). Санитарно-бактериологическое исследование пищевых продуктов Взятие проб. Отбор проб проводят стерильно, стерильными приспособлениями, в стерильную посуду. Пробы помещают в соответствующую тару, пломбируют. Транспортировку осуществляют в сумках-холодильниках в кратчайшие сроки. Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает определение общего микробного числа и титра санитарно-показательных микроорганизмов. Определение общего микробного числа (ОМЧ) ОМЧ - общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г (см 3 ) продукта. Для его определения используют метод кратных разведений. Метод кратных разведений . При исследовании плотных субстратов навеску измельчают в гомогенизаторе или растирают в ступке с кварцевым песком и готовят исходную взвесь в разведении 1:10. Из полученной взвеси или исходного жидкого материала готовят ряд последующих разведений с таким расчетом, чтобы при посеве двух последних разведений на чашке Петри в агаре выросло от 50 до 300 колоний. Из последних двух разведений по 1 см 3 вносят в чашку и заливают 10-15 мл расплавленного и остуженного до 45 ° С МПА. Чашки инкубируют при 37 ° С 48 ч, подсчитывают количество выросших колоний. ОМЧ определяют с учетом разведения исследуемого материала. Метод предельных разведений (титр ). Из исходного жидкого материала готовят ряд десятикратных разведений до тех пор, пока в последней пробирке можно будет предположить наличие одной бактериальной клетки. Посев делают в жидкую селективную среду с последующим выделением микроорганизмов на твердой питательной среде и изучением их характеристики. За титр принимают, то наименьшее количество субстрата, в котором обнаружена одна особь искомого микроорганизма. Определение санитарно-показательных микроорганизмов Санитарно-показательные микроорганизмы характеризуют продукт с точки зрения эпидемической опасности. Основными санитарно-показательными микроорганизмами считают БГКП и для количественного учета используют методы определения количества и титра. При этом под количеством понимают определение наиболее вероятного числа (НВЧ) БГКП в единице массы или объема продукта. Определение НВЧ БГКП. Для определения НВЧ из жидкого продукта или исходной взвеси плотного, последовательно делают разведения 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , из которых по 1 см 3 засевают в три пробирки со средой Кесслера для каждого разведения. Через 24 ч инкубации при 37 ° С в пробирках регистрируются изменения цвета среды и газообразование. В зависимости от количества проросших пробирок определяют НВЧ колиформных бактерий. Определение титра БГКП Готовят десятикратные разведения анализируемого материала и высевают на среду Кесслера для выявления наименьшего количества продукта, в котором присутствует кишечная палочка. Посевы термостатируют при 43 ° С в течение 18-24 ч. Из каждой пробирки производят высев на чашки Петри со средой Эндо так, чтобы получить рост отдельных колоний. Посевы инкубируют при 37 ° С - 18-24 ч, после чего из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек, колонии пересевают на среды Гисса с глюкозой. Наличие газообразования в пробирках с посевами указывает на присутствие БГКП. Титр устанавливают по наименьшему количеству продукта, в котором обнаружены БГКП или по стандартным таблицам. В оценке пищевых продуктов по микробиологическим показателям необходимо учитывать возможность обнаружения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Продукты питания анализируют на наличие сальмонелл, сульфитредуцирующих клостридий, стафилококков, протея. При более широком исследовании продукты исследуют на грибковую флору. Для исследования на сальмонеллы из анализируемых продуктов готовят суспензию и засевают на среды накопления (селенитовый, хлористо-магниевый бульоны). После суточной инкубации при 37 ° С производят пересев на среды Эндо, Левина, Плоскирева или висмут-сульфит агар. Далее колонии идентифицируют путем учета характеристики роста на средах Гисса, Ресселя, Олькеницкого и в реакции агглютинации с монорецепторными сыворотками. Для выявления сульфитредуцирующих клостридий проводится посев исследуемого материала в 2 пробирки со средой Китта-Тароцци, Вильсона-Блер или казеиново-грибную среду. Одну пробирку прогревают при 80 ° С для уничтожения сопутствующей микрофлоры. Инкубируют посевы при 37 ° С 5 сут. При наличии характерного роста достаточно констатировать в мазках специфическую микрофлору и при необходимости провести проверку токсинообразования в биопробе на белых мышах. Для выявления стафилококков исследуемый материал засевают на желточно-солевой агар. Посевы инкубируют в термостате 24 ч. Подозрительные на стафилококки колонии окрашивают по Граму, делают их пересев на молочный агар и проводят дальнейшую идентификацию выделенной культуры. Для выявления протея производят посев исследуемого материала на скошенный агар методом Шукевича. После суточной инкубации с верхнего края роста делают мазки и при наличии в них грамотрицательных полиморфных бактерий делают заключение о выделении протея, при необходимости используют биохимическое и антигенное типирование. Микрофлора лекарственных растений. Микроорганизмы являются постоянными спутниками не только человека и животных, но и, в равной степени, высших растений, в том числе используемых в качестве лекарственного сырья. Микроорганизмы поселяются и ведут активный образ жизни, как на поверхности, так и внутри зеленых частей растений, их корней, семян, плодов. Для приготовления лекарств служат самые разнообразные растения и работники аптечных учреждений, фармацевтических фабрик и заводов должны обеспечивать сохранность лекарственного сырья от микробной порчи. Все микроорганизмы, населяющие лекарственные растения, можно разделить на две группы: представители нормальной микрофлоры растений; фитопатогенные микроорганизмы - возбудители заболеваний растений. Нормальная микрофлора растений представлена ризосферными и эпифитными микробами. Зона почвы, находящаяся в контакте с корневой системой растений, носит название ризосферы , а микроорганизмы, развивающиеся в данной зоне, называются ризосферными. Условно различают два типа ризосферы: ближнюю и отдаленную. Ближняя располагается непосредственно на поверхности корней и извлекается вместе с ними, отдаленная начинается на расстоянии нескольких миллиметров от корней и распространяется в радиусе 50 см от них. Количество микроорганизмов в ближней и отдаленной ризосфере различно: на поверхности корней их от 50 млн до 10 млрд, на расстоянии 15 см от корней до 5 млн в 1 г. почвы. Число микроорганизмов в ризосфере в 100 раз больше, чем в почве, где растения не произрастают, что связано с выделением корнями растений различных питательных веществ. В свою очередь, почвенные микробы могут оказывать благоприятное воздействие на жизнь растений, что обусловлено: минерализацией органических веществ и растительных остатков; образованием витаминов, аминокислот, ферментов и других факторов роста, усиливающих ферментативные процессы в растениях и способствующих усилению корневого питания и более энергичному обмену веществ растений; антагонистической ролью в отношении фитопатогенных микроорганизмов. Качественный и количественный состав микрофлоры ризосферы специфичен для каждого вида растений. Основная масса прикорневой микрофлоры представлена неспороносными грамотрицательными бактериями рода Pseudomonas , микобактериями и грибами, главным образом, базидиомицетами, реже фикомицетами, аскомицетами. Указанные грибы образуют симбиоз с корнями растений, в том числе и лекарственных, называемый микоризой. В зависимости от морфологических особенностей сожительства грибов с растениями различают эктотрофные и эндотрофные микоризы. Эктотрофные ассоциации, при которых гриб не проникает внутрь корней, а поселяется на их поверхности, образуя своего рода чехол из мицелия. При эндотрофных микоризах мицелий гриба располагается в клетках коры корней растений, где образует скопления в виде клубков. Микориза рассматривается как симбиотическое сожительство далеких организмов. Особенно это сожительство благоприятно для развития растений: увеличивает поглощающую поверхность корней за счет разветвлений гиф гриба; грибы своими ферментами разлагают богатые азотом органические соединения, обеспечивая растения аминокислотами, минеральными веществами и водой; микоризные грибы снабжают растения ростовыми веществами. Растения в свою очередь выделяют ряд ростовых веществ, стимулирующих развитие гриба. Кроме этого, грибы получают от растений углеводы, служащие источником энергии. Эпифитная микрофлора . Эпифитной называется микрофлора, находящаяся на поверхности надземных частей растений. По качественному составу она довольно однообразна и типичными ее представителями являются Pseudomonas furbicola aurum грамотрицательные короткие подвижные палочки, образующие колонии золотистого цвета на МПА; Pseudomonas fluorescens - полиморфные грамотрицательные палочки с полярными жгутиками, дающие флуоресценцию на МПА и МПБ. Реже встречаются споровые бактерии Bacillus mesentericus , Bacillus vulgatus , бесспоровые молочнокислые бактерии E . coli , грибы плесневые и дрожжевые. Эпифитные микроорганизмы являются антагонистами фитопатогенных бактерий, тем самым, предохраняя растения от заболеваний. Фитопатогенные микроорганизмы Инфекционные болезни растений вызываются фитопатогенными бактериями. Заражение растений происходит через инфицированные семена, почву, грунтовые и дождевые воды, насекомых. Главным источником инфекции является почва, так как в ней могут содержаться остатки неперегнивших полностью больных растений. Фитопатогенные микроорганизмы сравнительно легко могут проникать в растения через естественные образования (чечевички, нектарники, желёзки, корневые волоски) и искусственные повреждения, даже ничтожные царапины. Некоторые микроорганизмы, способны вырабатывать ферменты, гидролизирующие кутикулу растений и облегчающие внедрение возбудителя. Попав в растение и достигнув критической концентрации в количественном отношении, микроорганизмы вызывают заболевания, называемые бактериозами. Различают общие бактериозы - поражение всего растения вследствие распространения возбудителя в сосудистой системе; и местные или очаговые - поражения на листьях, стволах, ветвях, корнях и корневищах, возникающие при интрацеллюлярном распространении микроба. От начала заражения до момента проявления у растения симптомов болезни проходит инкубационный период, длительность которого различна и зависит от многих факторов: температуры, влажности, света, питания и др. По совокупности анатомических и физиологических изменений определяют тип болезни растений: Камедетечения, смолотечения, слизетечения. Чаще всего вызываются бактериями рода Erwinia и грибами (класс Ascomycetes ), в большинстве наблюдаются у лиственных и хвойных деревьев. Сухая и мокрая гниль. При этом размягчаются и разрушаются отдельные участи тканей и органов растения за счет жизнедеятельности бактерий (род Pectobacterium ) и грибов (класс Ascomycetes и Fungi imperfecti ). Мучнистая роса. На листьях и побегах возникает белый налет, который является следствием размножения грибов (класс Ascomycetes ). Пожелтение, увядание, засыхание. Это заболевание чаще всего вызывается грибами ( Fungi imperfecti ), реже бактериями (род Corynebacterium ), в ряде случаев заболевание носит неинфекционный характер. Чернь. На листьях и побегах появляется черная пленка вследствие развития сумчатых и несовершенных грибов или бактерий рода Erwinia . Ожог. Листья, молодые побеги, цветы, плоды буреют, чернеют. Возбудителями ожога являются бактерии рода Erwinia . Пятнистость. Некоторые бактерии (род Pseudomonas ), грибы (класс Ascomycetes и Fungi imperfecti ), вызывают образование пятен разного цвета, формы, размеров на листьях, семенах и плодах. Опухоли. Местное увеличение объема стволов, ветвей, корней, корневищ в виде наростов, вздутий, утолщений за счет гиперплазии клеток. Эти заболевания вызываются бактериями (род Agrobacterium ), грибами и механическими повреждениями. Язвы. Проявляются в виде углублений, часто окруженных наплывом. Вызываются бактериями (род Erwinia ), грибами, механическими повреждениями, низкой температурой. Мозаика листьев. На листьях появляются бледно окрашенные пятна, чередующиеся с нормально окрашенными участками. Вызываются вирусами. Ведьмины метлы. Образование побегов из спящих почек в результате развития бактерий (род Rhisobium ), грибов (класс Ascomycetes ) и вирусов. Деформация. Проявляется в изменении формы органов растения (искривление побегов, курчавость листьев, карликовость) вследствие поражения грибами (класс Ascomycetes и Fungi imperfecti ), вирусами (семейство Reoviridae ). Существенно важным является, то обстоятельство, что в больных растениях заметно отклоняются от нормы обменные процессы вплоть до качественных изменений клеточных структур, что приводит к нарушению химического состава тканей и снижению содержания действующих начал в лекарственных растениях, и использование их в качестве сырья в аптечных и заводских условиях становится невозможным. Растительный организм обладает защитными механизмами, противодействующими внедрению и размножению фитопатогенных бактерий. К ним можно отнести особенности покровных тканей, высокую кислотность клеточного сока, образование биологически активных веществ - фитонцидов, подавляющих развитие микробов. Меры профилактики. Заключаются в дезинфекции семян и посадочного материала, дезинфекции почвы, опрыскивании растений химическими веществами, уничтожении растительных остатков, переносчиков возбудителей, удалении больных растений и изоляции здоровых. Существующая классификация фитопатогенных бактерий несовершенна, не всегда определена их родовая и видовая принадлежность. Фитопатогенные бактерии относятся к родам: Erwinia , Pseudomonas , Xanthomonas , Corynebacterium , Pectobacterium , Rhisobium (табл. 5). Известно, что вирусы вызывают более 20% болезней растений. Большинство вирусов относится к семейству Reoviridae , родам Phytoreovirus , Fijvirus . Из фитопатогенных грибов следует отметить два класса - аскомицеты ( Ascomycetes ), и несовершенные грибы ( Fungi imperfecti ). Таблица 5 Фитопатогенные бактерии - возбудители инфекционных заболеваний лекарственных растений Роды Erwinia Pseudomonas Xanthomonas Corynebacterium Pectobacterium Rhisobium Agrobacterium Вызываемые заболевания E. amylovora Ожог, увядание P. syringae Пятнистость X. heterocea Пятнистость, увядание C. insidiosum, C. fasciens Увядание P. phetophtorum, P. aroidae Гнили R. legyminosorum Язвы A. tumefaciens Опухоли Виды СОДЕРЖАНИЕ Введение Литературный обзор 1 Микрофлора почвы 1.1 Факторы, влияющие на качественный и количественный состав микроорганизмов почвы 1.2 Физиологические группы микроорганизмов 1.3 Процессы самоочищения в почве 2 Санитарная характеристика почв 3 Отбор проб и предварительная обработка почвенных образцов для анализа 3.1 Отбор образцов почвы 4 Определение в почве бактерий Результаты и обсуждение ВВЕДЕНИЕ Почва — это смесь частиц органических и неорганических веществ, воды и воздуха. Неорганические частицы почвы — это минеральные вещества, окруженные пленкой коллоидных веществ органической или неорганической природы. Органические частицы почвы — остатки растительных и животных организмов, т.е. гумус. Почва обильно заселена микроорганизмами, так как в ней есть все необходимое для жизни: органические вещества, влага, защита от солнечных лучей. В почве встречаются все формы микроорганизмов, которые есть на Земле: бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие, растения. Общее микробное число в 1 г почве может достигать 1— 5 млрд. В 1 га почвы содержится 1 тонна живого веса бактерий, однако в разных слоях количество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое почвы микроорганизмов очень мало (слой « 0,5 см). На глубине 1—2—5 см до 30— 40 см число микроорганизмов больше всего. В этом слое ОМЧ в среднем 10—50 млн в 1 г. В относительно чистых почвах этот показатель равен 1,5—2 млн в 1 г. Глубже 30— 40 см число микроорганизмов снижается и в более глубоких слоях их опять мало. 1 МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ 1.1 Факторы, влияющие на качественный и количественный состав микроорганизмов почвы На численность и вещевой состав микроорганизмов влияют следующие факторы: 1. Тип почвы (тундровая, подзолистая, черноземная, сероземная). Наиболее богаты микроорганизмами черноземные почвы, в которых до 10% органических веществ от сухого веса почвы. В 1 г черноземной почвы более 3,5 млн микробных клеток. На микробный пейзаж в таких почвах влияет обильная растительность с богатой корневой системой. Корни выделяют в почву белковые и азотистые вещества, минеральные соли, органические кислоты, витамины. В результате этого вокруг корней создаются ризосферы, т. е. скопления микроорганизмов. Микроорганизмы, в свою очередь, влияют на биохимические процессы в почве, на плодородие. Истощенные, гористые и песчаные почвы бедны микроорганизмами. В таких почвах органических веществ 1% от сухого веса почвы. 2. Влажность почвы. Во влажных почвах микроорганизмы размножаются лучше, чем в сухих, но в почвах торфяных болот, несмотря на большое количество влаги и органических веществ (до 50%), микроорганизмов мало, так как эти почвы имеют кислую реакцию и в них проявляется антагонистическое влияние мхов. 3. Аэрация. Почвы, богатые влагой, плохо аэрируются. В этих условиях преобладают анаэробы, а песчаные почвы аэрируются лучше, поэтому в них больше аэробов. 4. Температура почвы. В теплые периоды года микроорганизмов во много раз больше, чем зимой. Зимой развитие микроорганизмов прекращается, и они погибают. Наблюдаются суточные колебания количества микроорганизмов в почве. Наиболее благоприятная температура 20—30°С, а при температуре 10°С и ниже развитие замедляется. 5. Адсорбционная способность почв. Наибольшая адсорбирующая способность почв наблюдается у горноземных (гумусовых), она зависит от содержания в почве илистых частиц, количества средней и мелкой пыли, рН почвы. Эти почвы богаты кальцием. Характер почв влияет и на глубину проникновения микроорганизмов. В более влажных северных почвах жизнь микроорганизмов как бы «прижата» к поверхности, а в легких, щелочных южных почвах — жизнь микроорганизмов «углубляется». Они могут быть обнаружены на глубине 10 м и более. 1.2 Физиологические группы микроорганизмов В составе микрофлоры почвы принято выделять так называемые физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах и на разных этапах постепенного разложения органических веществ. Бактерии-аммонификаторы, являющиеся гнилостными микроорганизмами, вызывают гниение остатков растений, трупов животных, разложение мочевины. В процессе гниения участвуют аэробные бактерии-B. Subtilis, B. Mesentericus, бактерии рода Proteus, грибы рода Aspergillus, Mucor и др. Нитрифицирующие бактерии, которые обладают автотрофными свойствами и исключительной специфичностью. При их деятельности азотистая кислота окисляется до азотной и превращается в нитраты. Азотфиксирующие бактерии, которые обладают исключительной способностью усваивать из воздуха атмосферный азот и в процессе жизнедеятельности образуют из молекулярного азота белки и другие органические соединения азота, которые используются растениями. Бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожений, наблюдаемые при разложении микробами органических соединений углерода (молочно-кислое, спиртовое, масляно0кислое, уксусное, пропионовое). Бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов- серобактерии, железобактерии, разнообразные виды которых осуществляют окисление и восстановление этих соединений в природе. С выделениями человека и животных, с различными хозяйственнобытовыми и промышленными отходами в почву поступает большое количество разнообразных микроорганизмов. Преобладающе флорой являются анаэробы до 96% всех видов: бифидобактерии, лактобактерии, пептококки, бактероиды; в меньшем количестве встречаются эшерихии, энтерококки, протей, клостридии и другие микроорганизмы. Попадая в почву, представители нормальной микрофлоры тела человека и животных, а также и патогенные микроорганизмы, как правило, длительно не выживают и рано или поздно погибают. Одноко многие представители нормальной флоры человека вступают в биоценоз почвы, участвуют в ее биохимических процессах, а отдельные виды бактерий остаются постоянными обитателями почвы. На сроки выживания патогенных бактерий в почве оказывают влияние многие факторы: состав и тип почвы, температура, влажность, воздействие атмосферных осадков. К первой группе патогенных микроорганизмов. Постоянно обитающих в почве, относится небольшое количество микроорганизмов. Среди особое внимание заслуживают клостридии ботулизма, которые попадают в почву с испражнениями человека и животных, образуя споры, остаются в ней неопределенно долго. Вторая группа включает спорообразующие патогенные микроорганизмы (бациллы сибирской язвы, клостридии столбняка, газовой гангрены), которые попадают в почву с фекалиями человека и животных, а также с трупами погибших животных. Почва для них является вторичным резервуаром, поскольку при благоприятных условиях клостридии могут размножаться и сохраняться в виде спор длительное время. В третью группу включены патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделениями человека и животных и сохраняющиеся в течение нескольких недель и месяцев. Все эти микроорганизмысальмонеллы, шигеллы, вибрионы, бруцеллы, лептоспиры и др. не образуют спор и поэтому быстро гибнут в результате воздействия различных физических и биологических факторов. Особенное влияние на выживание патогенных микроорганизмов оказывают антагонистические свойства представителей микрофлоры почвы. Именно на этом свойстве микрофлоры основаны работы, направленные на повышение антибиотических свойств почвы. Простое способствующее озеленение травами территорий населенных размножению бактерий-актиномицетов, мест, улучшает антибактериальные свойства и повышает активность самоочищения почвы. Таким образом, естественные процессы, протекающие в почве под влиянием ее микрофлоры, обусловливают самоочищение почвы от попавших в нее микроорганизмов, обезвреживание и уничтожение нечистот. При правильном управлении этими процессами опасность передачи инфекционных болезней через почву может быть сведена к минимуму. Основная масса патогенной микрофлоры в почве постепенно отмирает, однако длительность переживания патогенной микрофлоры зависит от следующих факторов: * свойств микроба; * типа почв; * температуры и влажности почв; * микробов биоцинеозов; * бактериофагов; * антагонистов-сапрофитов; * микроорганизмов, продуцирующих антибиотики; от токсикоза почв. В почвах периодически появляются токсические вещества, их природа не совсем изучена, но предполагается, что это метаболиты некоторых микроорганизмов. Токсические вещества почвы губительно действуют на микроорганизмы почвы, в том числе и на полезную микрофлору. Дизентерийная палочка при 18°С выживает в различных типах почв от 3 до 65 дней, S. typhi и paratyphi — 19—101 день. Споровая микрофлора сохраняется дольше, даже годами и, напротив, холерные вибрионы, палочки чумы, бруцеллеза, вирусы полиомиелита — от нескольких часов до нескольких месяцев. 1.3 Процессы самоочищения в почве При попадании в почву органических веществ сразу же повышается общее микробное число (ОМЧ), а также общее число сапрофитов (ОЧС). Обычно в грязных почвах ОМЧ ОЧС, а в чистых ОМЧ = ОЧС или ОЧС ОМЧ. Сначала размножаются гетеротрофы, обладающие очень высокой ферментативной активностью и представленные семейством кишечных, псевдомонад, аэромонад, аэромобактерий и др. В этот период в почве много фекальных бактерий (бактерий группы кишечной палочки — БГКП, энтерококки, Cl. perfringens), много протеолитов, разлагающих белки, пептоны, желатина, много аммонификаторов, т. е. микробов, расщепляющих белки до NH3. В процессе самоочищения почвы все время меняется состав микрофлоры. По мере повышения кислотности в почве появляются ацидофильные микроорганизмы: молочнокислые бактерии, дрожжи, грибы, плесени, актиномицеты. По мере накопления аммиака в почве начинают размножаться нитрификаторы, т. е. микроорганизмы, окисляющие МН3 до нитритов и нитратов. Эти микроорганизмы завершают цикл превращений органических веществ в неорганические. За окисление NH3 до HNO2 ответственны нитрозобактерии (Nitrozomonas, Nitrosaspira), а за окисление HNO2 в HNO3 — нитробактерии. Одновременно с процессами нитрификации идут процессы денитрификации, т.е. восстановление нитратов в нитриты, а далее в газообразный азот. На этом этапе ОМЧ почвы становится низким. Видовой состав и численность микрофлоры стабилизируется. Активные вегетативные формы спорообразующих бактерий и грибов уступают покоящимся спорам бацилл, актиномицетам, грибам. В чистых почвах всегда доминируют покоящиеся споры. Спорообразование всегда говорит о законченных процессах минерализации почвы. Сочетание ОМЧ и нитрификаторов используют для распознавания и отличия чистых почв от почв, бывших загрязненными, но находящихся на стадии минерализации. Для них характерно низкое ОМЧ, но высокое число нитрификаторов. То же самое можно сказать и при сопоставлении общего числа сапрофитов и процентов споровых аэробов. Если процент споровых форм к ОЧС высок (40—60%), то это характерно для чистых почв, если же низок (25%), то почва загрязнена. Если к вышеперечисленным показателям добавить еще определение БГКП, Cl. perfringens, термофилы, то для самого свежего загрязнения характерна большая обсемененность почвы БГКП, Cl. perfringens, термофилами и отсутствие нитрификаторов. Чуть позже, когда начинаются процессы самоочищения, наряду с кишечными бактериями начинает нарастать количество нитрификаторов. В процессе самоочищения почвы происходят изменения в показателях: наиболее быстро отмирает кишечная палочка. Обнаружено, что в сильно загрязненной почве титр БГКП увеличивается за 4,5 месяца с 10"5'-6 до ЮЛ или 1 г, титры Cl. perfringens и нитрификаторов были еще низкими. Такое соотношение показателей говорит об очищении почвы только от кишечных палочек и патогенных бактерий семейства кишечных и об интенсивных процессах самоочищения. Через 9—11 месяцев в супесчаных почвах ОМЧ уменьшается от нескольких миллионов до нескольких тысяч микробных клеток в 1 г. Титры нитрификсаторов резко увеличивались. Высокие титры всех показателей говорят о законченных процессах самоочищения. 2 САНИТАРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВ Почва — одна из главных составляющих природной среды, которая благодаря своим свойствам (плодородие, самоочищающая способность и др.) обеспечивает человеку питание, работу, здоровую среду обитания. Нарушение этих процессов, вызванное загрязнением, может оказать неблагоприятное влияние на здоровье людей и животных. Наблюдается распространение инфекционных и инвазионных заболеваний, ухудшение качества продуктов питания, воды, водоисточников, атмосферного воздуха. Это понимание почвы, как одного из главных компонентов окружающей среды, от которого зависят условия жизни и здоровья населения, требует большого внимания к ее санитарной охране. Санитарное состояние почвы — совокупность физико-химических и биологических свойств почвы, определяющих качество и степень ее безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношениях. Опасность загрязнения почв определяется уровнем ее возможного отрицательного влияния на контактирующие среды (вода, воздух), пищевые продукты и прямо или опосредованно на человека, а также на биологическую активность почвы и процессы самоочищения. Санитарная характеристика почв населенньгх мест основывается на лабораторных санитарно-химических, санитар-но-бактериологических, санитарно-гельминтологических, са-нитарно-энтомологических показателях. По эпидемическим показаниям можно проводить индикацию и выделение из почвы патогенных микроорганизмов, в распространении которых почва играет важную роль. Результаты обследования почв учитывают при определении и прогнозе степени их опасности для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, разработке мероприятий по их рекультивации, профилактике инфекционной и неинфекционной заболеваемости, схем районной планировки, технических решений по реабилитации и охране водосборных территорий, при решении очередности санационных мероприятий в рамках комплексных природоохранных программ и оценке эффективности реабилитационных и санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарного контроля за объектами, косвенно воздействующими на окружающую среду населенного пункта. Оценка санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т. п.) и в санитарно-защитных зонах по санитарно-бактериологическим показателям: 1) косвенным, которые характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это — санитарно-показательные организмы группы кишечной палочки (БРКП, коли-индекс) и фекальные стрептококки (индекс энтерококков). В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика, и как следствие, высоки индексы санитарно-показательных организмов. 2) прямым санитарно-бактериологическим показателям эпидемической опасности почвы — обнаружение возбудителей кишечных инфекций (возбудители кишечных инфекций, патогенные энтеробактерии, энтеровирусы); 3) почву оценивают как чистую без ограничений по санитарнобактериологическим показателям при отсутствии патогенных бактерий и индексе санитарно-показательных микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы. О возможности загрязнения почвы сальмонеллами свидетельствует индекс санитарно-показательных организмов (БГКП и энтерококков) 10 и более клеток в 1 г почвы. Наличие кишечной палочки в титрах 0,9 и ниже свидетельствует о несомненном фекальном загрязнении почвы, притом свежем. Одновременно могут быть зарегистрированы низкие титры Cl. perfringens, нитрификаторов. Однако следует иметь в виду, что в первое время после имевшего места органического загрязнения, нитрификаторов может быть мало — необходимо время, чтобы они успели размножиться. В процессе самоочищения на разных этапах возникают различные количественные соотношения этих показателей. Наиболее быстро отмирает кишечная палочка, поэтому при сравнительно высоких ее титрах титры Cl. perfringens и нитрифицирующих бактерий низкие. Это показывает, что в почве интенсивно протекают процессы самоочищения как от патогенных микроорганизмов, так и от органического загрязнения. Высокий титр (1,0 и выше) кишечной палочки при низких титрах остальных 3 показателей характеризует почву как свободную от возбудителей кишечных инфекций, но в которой еще не закончились процессы распада и минерализации органических веществ. Высокие титры всех показателей свидетельствуют о законченных процессах самоочищения и характеризуют почву как чистую, свободную от патогенных энтеробактерии и органических загрязнений. 3 ОТБОР ПРОБ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПОЧВЕННЫХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ АНАЛИЗА Санитарное обследование, выбор точек отбора проб Основными объектами, территории которых подлежат контролю органов санитарного надзора с применением санитарно- микробиологических методов исследования, требующими проведения ряда мероприятий по предотвращению загрязнения почвы, являются: детские и лечебно-профилактические учреждения; сельские и неканализованные районы городских населенных пунктов; территории первого пояса зоны санитарной охраны источников хозяйственно-питьевого водоснабжения; зоны свалок; отвальные площадки; сельскохозяйственные поля, орошаемые водой из открытых водоемов, стоками животноводческих ферм; земледельческие поля орошения городскими и промышленными сточными водами. Обязательным предварительным этапом при санитарно- бактериологическом исследовании является санитарное обследование и составление паспорта обследуемого участка с сопроводительным талоном. Паспорт обследуемого участка: 1. Номер участка. 2. Адрес участка и его привязка к источнику загрязнения. 3. Дата обследования. 4. Размер участка. 5. Название почв. 6. Рельеф. 7. Уровень залегания грунтовых вод. 8. Растительный покров территории. 9. Характеристика источника загрязнения (характер производства, используемое сырье, мощность производства, объем газопылевых выбросов, жидких и твердых отходов, удаление от жилых зданий, игровых площадок, мест водозабора и т. д.). 10. Характер использования участка (детская площадка, предприятие и т. д.). 11. Сведения об использовании участка в предыдущие годы (мелиорация, применение средств химизации и др.). Исполнитель, должность. Личная подпись. Расшифровка подписи На основании результатов санитарного обследования территории и ее описания составляется схематический план земельного участка с нанесением источников загрязнения. Это позволяет правильно обосновать выбор точек отбора проб почвы. На изучаемой территории при наличии одного источника загрязнения выделяют два участка 25 м2 каждый: один вблизи источника загрязнения (опытный), другой — вдали (контрольный). Контрольный выбирают с таким расчетом, чтобы он был заведомо незагрязненным и имел одинаковый почвенный состав с опытным. 3.1 Отбор образцов почвы Пробы почвы отбираются на каждом из участков в его пяти точках по диагонали или по «конверту» (четыре точки по углам и одна в центре). Если исследователя интересуют последствия непосредственного внесения химического вещества в почву, то пробы отбираются поверхностно (0—1 см) стерильным инструментом (нож, шпатель) в количестве 0,3—0,5 кг в одной точке. Если изучается воздействие химического вещества на микрофлору почвенного горизонта, то для отбора проб почвы пользуются следующей методикой. Каждая точка, в которой проводится отбор проб почвы, представляет собой центр выбранного для исследования 1 м2 территории. Здесь выкапывается шурф размером 0,3 х 0,3 м и глубиной 0,2 м. Поверхность одной из стенок шурфа очищают стерильным ножом. Затем из этой стенки вырезают почвенный образец, размер которого обусловлен заданной навеской. Так, если необходимо отобрать 200 г почвы, размер образца 20 см х 3 см х 3 см; 500 г — 20 см х 5 см х 30 см. Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают камни и прочие твердые предметы. Затем почву распределяют на месте ровным тонким слоем в форме квадрата. Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг. Перед посевом почву диспергируют, т.е. почву с соблюдением условий стерильности просеивают через сито диаметром 3 мм. При просевании сито сверху покрывают стерильной бумагой. Для учета почвенных микроорганизмов и энтеровирусов достаточно навески от 1 до 10 г, для санитарно-показательных микроорганизмов от 1 до 30 г, для патогенных энтеро-бактерий (50—50,5 г). Первое разведение навески почвы (1 : 10) делают в стерильной посуде, добавляя стерильную водопроводную воду в соотношении 1 : 10 к весу почвы (например: 1 г воды, 10 г почвы — в 100 мл воды и т. п.). Далее проводят предварительную обработку почвы, целью которой является извлечение клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов. Основными приемами предварительной обработки почвы являются: 1) 10-минутное вертикальное встряхивание почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками — при навеске почвы 1 г; 2) 3-минутная обработка почвенной суспензии на механической мешалке. Почвенную суспензию, содержащую в 1 мл 0,1 г почвы, через 30 секунд после предварительной обработки (за это время оседают грубые минеральные частицы) используют для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы. Для этого из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 гмл стерильной пипеткой отбирают 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 гмл почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001—0,00001 гмл. Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды с целью определения микробиологических показателей. Санитарно-бактериологическое исследование почвы К методам определения микробиологических показателей, характеризующих фекальное загрязнение почвы, относятся следующие: 1. Определение количества бактерий группы кишечных палочек, энтерококков, энтеровирусов. 2. Определение кишечных палочек в почве титрационным методом. 3. Определение кишечных палочек в почве методом мембранных фильтров. 4. Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета кишечных палочек в почве. 5. Определение в почве общего количества бактерий, 6. Определение Clostridium perfringens в почве. 7. Определение термофильных бактерий. 8. Определение в почве нитрифицирующих бактерий. 4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ПОЧВЕ БАКТЕРИЙ Из первого разведения почвенной суспензии (1 : 10) берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидких сред (Кес-слера или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида ТТХ). Посев меньших количеств (0,1 г, 0,01 гит. д.) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл тех же сред. Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном прибавляют по 0,3 мл 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон— по 1,5 мл. Методика с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восстанавливать бесцветное соединение ТТХ с трифенилформазаном, выпадающим в виде осадка и придающим среде коричневато-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микрофлоры тормозится. Посевы на среде Кесслера выращивают 48 часов при 43 °С или 37°С. Отсутствие через 48 часов газообразования и помутнения в бродильных сосудах дает окончательный отрицательный ответ на наличие бактерий группы кишечных палочек. Отрицательный ответ на лактозном бульоне с ТТХ дается через 24 часа в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился. При наличии в сосудах со средой Кесслера газообразования и помутнения или только помутнения производят высев на среду Эндо. Чашки с посевами помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°С. Отсутствие роста на чашках дает окончательный отрицательный ответ. При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и причисляют к бактериям группы кишечных палочек после подтверждения ферментации глюкозы. Для этого засевают 2—3 колонии каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4—5 и 18 часов инкубации при 37°С. Если за это время в среде происходит образование кислоты и газа, то это подтверждает наличие кишечных палочек в исследуемом разведении почвы. Результаты анализа выражают коли-титром. Определение в почве общего количества бактерий Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, присущих на мясопептонном агаре при 37°С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5% мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы для посева должно быть использовано не менее двух различных разведений. Берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки. Из каждого разведения посев производят минимум на 2 параллельные чашки. После в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15—20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды. После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в термостат при 37°С на 24 часа. После инкубации подсчитывают выросшие колонии. Определение в почве общего количества бактерий Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, растущих на мясопептонном агаре при 37 °С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5 % мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений. После тщательного перемешивания берут по 1 мл суспензии и переносят на дно двух стерильных чашек Петри. В каждую чашку вливают питательный агар в количестве 15—20 мл расплавленного и остуженного до 45°С. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды. После инкубации при температуре 37 °С 24 часа подсчитывают выросшие колонии. Определение клостридиум перфрингенс в почве Из всех приготовленных почвенных разведений (до 1 : 1000 000) по 1 мл переносится в два параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80°С в течение 15 минут или при 90°С — 10 минут. Затем во все пробирки наливают по 9—10 мл среды Вильсон—Блер. Инкубация посевов производится при 37° С в течение 24 часов. Cl. perfringens образуют колонии черного цвета, в мазках — грамположительные палочки. Определение в почве нитрифицирующих бактерий Нитрифицирующие бактерии завершают цикл превращения в почве азотсодержащих соединений, окисляя аммиак до нитритов и нитратов. Поэтому численность этих микроорганизмов довольно четко указывает на степень органического загрязнения, скорости и окончания распада органики в почве. Определение нитрификаторов можно производить посевом разведений почвенной суспензии на плотных или жидких средах. Чаще всего для этих целей применяется среда Виноградского. Для этого производят посев почвенных разведений во флаконы со средой, разлитой тонким слоем. В опыт рекомендуется включать два незараженных флакона со средой, служащей контролем на чистоту среды. Посевы инкубируют при 28°С в течение 14—15 суток. При развитии нитрифицирующих бактерий в среде постепенно образуются азотистая и азотная кислоты. Образование окисных соединений азота рекомендуется проверять на 5—7-й день после посева и вторично на 14—15-й день. Титр нитрифицирующих бактерий чаще всего устанавливают с помощью качественной пробы с дифенилаланином; в присутствии азотистой и азотной кислот этот реактив дает синее окрашивание. Для этого пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносятся на стеклянную пластинку. Затем добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте. Появление синего окрашивания указывает на присутствие в среде нитратов, как результат размножения нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов не должна давать изменения окраски. Почву всех образцов одного участка высыпали на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивали стерильным шпателем, убрали камни и прочие твердые предметы. Затем почву распределили на месте ровным тонким слоем в форме квадрата. Диагоналями почву разделили на 4 треугольника. Почву из двух противоположных перемешали. треугольников Перед посевом отбросили, почву а оставшуюся диспергировали, т.е. вновь почву с соблюдением условий стерильности просеивают через сито диаметром 3 мм. При просеивании сито сверху покрывают стерильной бумагой. Сделали навеску 1г почвы и разбавили в дистиллированной воде соотношением 1 : 4. Тщательно перемешали на механической мешалке более 30 мин. Для определения кишечных палочек в почве взяли 1 мл суспензии и перенесли на дно стерильной чашки. После чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15—20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды. После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в термостат при 37°С на 24 часа. Для микроскопирования приготовили 3 мазка. Мазки зафиксировали на предметных стеклах и окрасили, используя раствор бриллиантового зеленого. Готовый мазок микроскопировали. Рис. 1 – Мазок №1 Рис. 2 – Мазок №2 Рис.3 – Мазок №3 Во всех мазках обнаружены кишечные палочки. ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. http://www.medbookaide.ru/books/fold9001/book2046/content.php Прозоркина H.В., Рубашкина П.А. – Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. 2. http://www.pchelkam.ru/page/mikroflora-biosferi/mikroflora-pochvi-irasteniy.html 3. http://microby.ru/bakterii/ Теория микробиологии
