Инфекционные болезни, иммунология и иммунотерапия

Инфекционные
болезни,
иммунология
и иммунотерапия
УДК 616 - 002.5 - 053.2 - 07
Л.И. Мордовская1, М.А. Владимирский3, В.А. Аксенова3, Ф.А. Захарова2
СОВРЕМЕННЫЙ ПОДХОД К ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ
ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ
Научно-практический центр «Фтизиатрия» МЗ PC (Я)1;
Медицинский институт Якутского государственного университета им. М.К. Аммосова,
677000, ул. Белинского, 582; НИИ фтизиопульмонологии
Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова3, г. Москва
Интерферон-гамма (ИФН-γ) — один из ключевых
факторов протективного иммунитета при туберкулезной
инфекции. Существуют ряд новых иммунологических
тестов для определения туберкулезной инфекции, в том
числе у детей, основанных на анализе индукции ИФН-γ
в образцах цельной крови, инкубированных в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза (МБТ) [2-5,
8]. В такого рода тест-системах измеряют продукцию
ИФН-γ с помощью количественного иммуноферментного анализа («QuantiFERON-TB-Gold») [2] или определяют количество ИФН-γ продуцирующих Т-лимфоцитов
(T-SPOT.TB) [3]. В качестве специфических антигенов
МБТ-индукторов ИФН-γ в последние годы используют
рекомбинантные антигены ESAT-6 (ранний секретируемый антиген с молекулярной массой 6 кд) и CFP-10
(белок фильтрата культуры МБТ). Эти тест-системы
используют главным образом для определения латентной туберкулезной инфекции [6, 7, 9]. Поскольку антигены отсутствуют у микобактерий вакцинного штамма
M.bovis(BCG) и большинства нетуберкулезных видов
микобактерий [1], такие тест-системы могут использоваться, в том числе, и для обследования лиц, вакцинированных BCG.
Мы разработали отечественную тест-систему для определения туберкулезного инфицирования у детей и подростков на основе индукции ИФН-γ в образцах цельной
крови in vitro. В отличие от тест-системы «QuantiFERONTB-Gold» для индукции ИФН-γ, мы используем как
традиционный туберкулин PPD, так и комплекс специфических антигенов ESAT-6 и СFР-10.
Эта тест-система позволяет дифференцировать первичную туберкулезную инфекцию у детей и подростков
и поствакцинную БЦЖ аллергию, следить за уровнем
специфического иммунного ответа у больных подростков с различными формами туберкулеза легких.
Материалы и методы
Обследованы 277 детей и подростков в возрасте от
1 г. до 14 лет, проходивших обследование и лечение в
Детском противотуберкулезном диспансере г. Якутска,
клинике НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.
Сеченова и Детской поликлинике УД президента РФ с
установленными диагнозами: конверсия («вираж») туберкулиновой пробы (52 пациента); поствакцинальная
аллергия (40 пациентов); туберкулез внутригрудных
лимфатических узлов (25 пациентов). Обследовали также 31 здорового ребенка с отрицательной или сомнительной пробой Манту, 46 ранее инфицированных детей,
находившихся под наблюдением у фтизиопедиатра на
основании конверсии туберкулиновой пробы, 10 ранее
инфицированных детей, находившихся на стационарном
лечении по поводу пневмонии, и 73 ребенка и подростка,
проходивших стационарное лечение по поводу различных форм туберкулеза легких.
Для исследования были (с согласия родителей) взяты
образцы венозной крови по 3,5 мл с гепарином (10 ед./мл).
Образцы крови были разлиты по 1 мл в три различные
маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и две опытные пробы, в которые вносили по 10 мкл
туберкулина PPD в концентрации по белку 1 мг/мл и смесь
37
(равные объемы) рекомбинантных антигенов ESAT-6 и
CFP-10 в концентрациях по белку 1 мг/мл. Конечная концентрация всех антигенов по белку составляла 10 мкг в мл
крови. Образцы крови в стерильных пробирках объемом
5 мл с герметично закрывающимися крышками инкубировали при 37°С в течение 20-24 ч. На следующий день
отбирали по 200 мкл образцов плазмы, в которых определяли концентрацию ИФН-γ с помощью разработанной нами иммуноферментной тест-системы. Результаты анализа
обрабатывали, используя специальную компьютерную
программу Zemfira фирмы «БиоРад» для обсчета количественного ИФА. В некоторых опытах образцы плазмы замораживали и хранили при 20°С в течение 2 нед.
Для статистической обработки полученных результатов применяли программы Microsoft Excel и SAS с
использованием параметрических и непараметрических
методов анализа. Определяли среднее значение, стандартное отклонение, медиану и межквартильный (25-75%)
диапазон результатов. Достоверность различий в изучаемых группах анализировали по критерию Вилкоксона.
Рез ю ме
Разработана тест-система определения туберкулезного инфицирования, проводимого путем количественного
анализа интерферона-гамма (ИФН-γ) в образцах плазмы
крови в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза: туберкулина PPD и смеси специфических для М.
tuberculosis рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10.
Диагностическая чувствительность определения первичной туберкулезной инфекции составляет 97,6% при 94,4%
специфичности, позволяющей дифференцировать туберкулезную инфекцию от поствакцинной аллергии. При
распространенных формах туберкулеза легких уровень
антиген-индуцированного ИФН-γ снижается.
Ключевые слова: туберкулезная инфекция, поствакцинная аллергия, интерферон-гамма, туберкулин PPD, специфические антигены, ESAT-6 и CFP-10.
L.I. Mordovskaya, M.A. Vladimirsky,
V.A. Aksenova, F.A. Zacharova
CURRENT APPROACH TO IMMUNOLOGICAL
DIAGNOSTICS OF TUBERCULOSIS INFECTION
IN CHILDREN AND TEENAGERS
Результаты и обсуждение
Результаты исследования индукции ИФН-γ в образцах
крови антигенами МБТ в изученных группах пациентов
представлены в таблице. В результате анализа индукции
ИФН-γ в образцах цельной крови 123 пациентов с первичной туберкулезной инфекцией (группы 3, 4 и 6) установлено, что чувствительность определения первичной
туберкулезной инфекции у детей и подростков при пороговом значении концентрации ИФН-γ (более 70 пг/мл)
составила 97,6%.
The science-practical centre «Phthisiology» MHC RS (Y);
Medical institute of the Yakut state university, Yakutsk;
Scientific research institute of phthisiopulmonology
of the Moscow medical academy after I.M. Setchenov, Moscow
Summar y
The test-system diagnosing tuberculosis infection performed by the quantitative analysis of interferon-gamma
(IFN-γ) in samples of blood plasma at presence of tuberculosis
mycobacterium antigens: tuberculin PPD and mixes specific
for M. tuberculosis recombinant antigens ESAT-6 and CFP10 is developed. Diagnostic sensitivity of primary tuberculosis
infection diagnostics makes up 97,6% with 94,4% specificity,
allowing differentiating tuberculosis infection from post vaccine allergy. In widespread forms of pulmonary tuberculosis
the level of the antigen induced IFN-γ can be low.
Key words: tuberculosis infection, post vaccine allergy, interferon-gamma, tuberculin PPD, specific for M. tuberculosis
recombinant antigens ESAT-6 and CFP-10.
Индукция ИФН-γ у детей и подростков в образцах крови
при различных формах туберкулезной инфекции
Концентрация ИФН-γ, пг/мл - медиана,
25-75% межквартильные величины
Группа
Диагноз
1
PPD
Р, критерий
Вилкоксона
ESAT-6
+CFP-10
Р, критерий Вилкоксона
Туберкулинотрицательные здоровые (n=31)
85
(48-181)
P1-2<0,001
0 (0-0)
P1-2
-н.д.
2
Поствакцинная БЦЖаллергия
(n=40)
282
(208-440)
Р2-3<0,001
0 (0-0)
Р2-3
<0,001
3
Впервые
инфицированные
- «вираж»
пробы Манту (n=52)
552
(338-862)
Р3-6<0,001
351
(152-537)
Р3 - 4,5,6
- н.д.
4
Ранее инфицированные
(n=46)
552
(294-720)
Р3-4 - н.д.
336
(182-552)
Р3-4
- н.д.
5
Пневмония
-инфицированные
(n=10)
820
(520-240)
Р4-5 = 0,052
524
(280-580)
Р4-5
- н.д.
6
Туберкулез
внутригруд624
ных лимфо- (323-1033)
узлов (n=25)
Р3-6 - н.д.
377
(156-791)
Р3-6
- н.д.
Р7 - 3,4,5,6<0,01
47
(19-161)
Р7 - 3,4,5,6
<0,01
7
Туберкулез легких
(n=73)
213
(91-374)
Специфичность исследования при таком пороговом
значении индукции ИФН-γ, которую определяли при
анализе пациентов с отрицательной (сомнительной) пробой Манту и детей с поствакцинальной БЦЖ-аллергией,
составила 94,4%.
Мы провели сопоставление уровня иммунного ответа на антигены PPD и смесь специфических антигенов
ESAT-6 и CFP-10 в двух группах пациентов: больных
пневмонией, ранее инфицированных, по данным конверсии туберкулиновой пробы, и у здоровых, ранее тубинфицированных. Несмотря на определенное увеличение
уровня индукции ИФН-γ больных пневмонией, значимых
различий между этими группами выявлено не было.
В процессе исследования подростков, больных туберкулезом легких (вторичная туберкулезная инфекция),
было установлено, что, в среднем, уровень индукции
ИФН-γ в присутствии антигенов МБТ — туберкулина
Примечание. Обозначение н.д. — недостоверно.
38
PPD и специфических антигенов ESAT-6 и CFP-10 — у
этих пациентов существенно ниже, чем у лиц с первичной туберкулезной инфекцией. У значительной части
пациентов с вторичной туберкулезной инфекцией и наличием деструкции легочной ткани и бактериовыделением
уровень индукции ИФН-γ в присутствии антигенов МБТ
был угнетен настолько сильно, что в ряде случаев оказывался нулевым. В дальнейшем было установлено, что в
процессе лечения, при благоприятном течении процесса,
специфическая индукция ИФН-γ восстанавливается. Эти
данные послужили предметом отдельного исследования.
Разработанная нами тест-система существенно отличается от зарубежного аналога («QuantiFERON-TB-Gold»
In Tube) тем, что для индукции ИФН-у in vitro в нашей
системе используется как относительно неспецифический туберкулин PPD, так и смесь специфических рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10. Это позволяет
при индукции ИФН-γ исключительно в ответ на туберкулин PPD подтвердить наличие поствакцинальной аллергии и отвергнуть туберкулезное инфицирование при
одновременном отсутствии диагностического порогового уровня индукции (70 пг/мл) ИФН-γ рекомбинантными
антигенами.
В связи с довольно высокой распространенностью
туберкулезной инфекции среди взрослого населения в
нашей стране этот метод наиболее актуален для своевременного выявления первичной туберкулезной инфекции
у детей и подростков, поскольку проводимая ревакцинация БЦЖ в 6- и 14-летних возрастных группах не позволяет достоверно определить туберкулезное инфицирование
с помощью стандартной пробы Манту. Важность этого
аспекта применения таких тест-систем показана рядом
работ [3, 4, 8], использующих зарубежные аналоги. При
сравнении метода, основанного на антиген-специфической индукции ИФН-γ и кожного туберкулинового теста, по разным данным, лишь в 9-30% случаев у детей и
подростков с положительной кожной пробой наблюдали совпадение с результатами теста на основе набора
«QuantiFERON-TB-Gold». Именно эти дети и подростки,
по данным эпидемиологического обследования, имели
большую вероятность контактов с больными туберкулезом.
Возможность контроля иммунного ответа на основании специфической индукции ИФН-γ у больных туберкулезом в процессе их специфической химиотерапии имеет
существенное значение при использовании некоторых
иммуномодулирующих препаратов.
Заключение
Разработана тест-система определения туберкулезного
инфицирования на основе индукции in vitro ИФН-γ в образцах цельной крови антигенами микобактерий туберкулеза (PPD и специфических рекомбинантных антигенов
ESAT-6 и CFP-10). Данная система позволяет установить
первичную туберкулезную инфекцию с чувствительностью 97,6% при специфичности 94,4%. Эти характеристики обеспечивают возможность дифференцирования
первичной туберкулезной инфекции от поствакцинальной
аллергии. Поствакцинальная аллергия характеризуется
сочетанием повышенной индукции ИФН-γ к туберкулину и индукцией ИФН-γ ниже порогового уровня к спе-
цифическим антигенам. При туберкулезе легких уровень
иммунного ответа, определяемый по специфической индукции ИФН-γ, в среднем существенно снижается, в том
числе до нулевых значений, в зависимости от выраженности туберкулезного поражения.
Ли т ер ат у р а
1. Arend S.M., van Meijgaarden К.Е., de Boer K. et
al. Tuberculin skin testing and in vitro T-cell responses to
Esat-6 and culture filtrate protein 10 after infection with
Mycobacterium marinum or Mycobacterium kansasii // J.Inf.
Dis. - 2002. - Vol. 186. - P. 1797-1807.
2. Brock I., Munk M.E., Kok-Jensen A. et al. Performance
of whole blood IFN-gamma test for tuberculosis diagnosis
based on PPD or specific antigens ESAT-6 and CFP-10 // Int.
J. Tuberc. Lung. Dis. - 2001. - Vol. 5. - P. 462-467.
3. Dominguez Jose, Juan Ruiz-Manzano, Malu De SouzaGalvao et al. Comparison of Two Commercially Available
Gamma Interferon Blood Tests for Immunodiagnosis of
Tuberculosis // Clin Vaccine Immunol. - 2008. - Vol. 15(1).
- P. 168-171.
4. Eum S.Y., Lee V.J., Kwak H.K., Min J.H. et al.
Evaluation of the diagnostic utility of a whole-blood
interferon-gamma assay for determining the risk of exposure
to Mycobacterium tuberculosis in Bacille Calmette-Guerin
(BCG)-vaccinated individuals // Tuberculosis. - 2008. - Vol.
88(1). - P. 31-38.
5. Lalvani A., Millington K.A. Т cell-based diagnosis of
childhood tuberculosis infection // Curr Opin Infect Dis. 2007. - Vol. 20(3). - P. 264-271.
6. Manuel O., Kumar D. QuantiFERON-TB-GOLD assay
for the diagnosis of latent tuberculosis infection // Thorax.
- 2008. - Vol. 63(1). - P. 67-71.
7. Mazurek G.H., LoBue P.A., Daley C.L. et al. Detection
of Mycobacterium Tuberculosis Infection by Whole-Blood
Interferon-Gamma Release Assay // Clin. Infect.Dis. - 2003.
- Vol. 36(9). - P. 1207-1208.
8. Mori Т., Sakatani, M., Yamagishi F. et al. Specific
detection of tuberculosis infection; an interferon-γ based
assay using new antigens // Am J Respir Crit Care Med. 2004. - Vol. 170(1). - P. 59-64.
9. Pai M., Zwerling A., Menzies D. Systematic review:
T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis //
Ann. Intern.Med. - 2008. - Vol. 149(3). - P. 177-184.
Координаты для связи с авторами: Мордовская Лариса Ивановна — канд. мед. наук, с.н.с. ГУ НПЦ «Фтизиатрия» МЗ PC (Я), г. Якутск; e-mail: limordovskaya @mail.
ru; Владимирский Михаил Александрович — доктор мед.
наук, проф., руководитель лаборатории молекулярной
диагностики НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.
Сеченова, г. Москва, тел.:/факс. 631-33-14; 8-917-5416238, e-mail: mvladimirskij@mail.ru; Аксенова Валентина
Александровна — доктор мед. наук, проф., гл. внештатный фтизиопедиатр РФ, руководитель лаборатории по
профилактике, диагностике, лечению туберкулеза у детей и подростков НИИ фтизиопульмонологии ММА им.
И.М. Сеченова, г. Москва; Захарова Федора Апполоновна
— доктор мед. наук, профессор кафедры патологической
физиологии ГОУ ВПО «Якутский государственный университет им. М.К. Аммосова», г. Якутск, e-mail: patfiz63@
mail.ru.