Посмотреть файл - Российский НИИ гематологии и
реклама
на правах рукописи СТЕПАНОВ АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ОПТИМИЗАЦИЯ ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ПОЛУЧЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВКИ И ПОДГОТОВКИ К ХРАНЕНИЮ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЛЯ АУТОЛОГИЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПАЦИЕНТАМ С МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ 14.01.21 – гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРЕАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2015 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) Научные руководители: Бессмельцев Станислав Семенович, доктор медицинских наук, профессор Рабинович Владислав Ильич, доктор медицинских наук Официальные оппоненты: Зубаровская Людмила Степановна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела детской онкологии, гематологии и трансплантологии НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачёвой, ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Калинина Наталья Михайловна, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита состоится « 2 » марта 2015 г. в __________ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.074.01 при ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России по адресу 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д.16. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России. Автореферат разослан «____» ________________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Глазанова Татьяна Валентиновна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Благодаря уникальным свойствам гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) мигрировать в костный мозг и регенерировать, трансплантация данных клеток нашла широкое применение в практической медицине в качестве метода восстановления кроветворения после высокодозной химиотерапии (ВДХТ). Успешное применение ВДХТ в сочетании с аутотрансплантацией ГСК (АутоТГСК) при множественной миеломе (ММ) делает данный метод лечения «золотым стандартом» для первичных пациентов моложе 65 лет (Бессмельцев С.С., 2013). Но пациентам с ММ часто показан повторный курс ВДХТ, что существенно повышает требования к получению и хранению ГСК, поскольку АутоТГСК необходимо осуществить дважды (Barlogie B. et al, 2008; Sonneveled P. et al, 2010). Кроме того, применение ВДХТ и АутоТГСК ограничено с одной стороны проблемами получения ГСК у пред-леченых пациентов, с другой – тяжелыми осложнениями после ВДХТ, обусловленными медленным восстановлением кроветворения. Существующие многочисленные протоколы медикаментозной мобилизации ГСК и криохранения, к сожалению, не позволяют обеспечить предсказуемые и стабильные результаты применения АутоТГСК в лечении ММ. Доля неудачных аферезов для получения ГСК периферической крови по разным данным составляет 23–34%. Но даже если трансплантационная доза получена, то в процессе хранения часто наблюдается ее значительное снижение, что может увеличить срок восстановления кроветворения до нескольких месяцев (Glaspy J.A. et al, 1997; Sola C. et al, 1999; Wahlin A. Et al, 2004 Bolwell B.J. et al, 2007). Пока не решена проблема резистентности к медикаментозной мобилизации ГСК (Грицаев С.В., Кузяева А.А., Волошин С.В. и др., 2013; Ameen R.M. et al, 2008; Mazumder A. et al, 2008; Yang S.M. et al, 2012), а это часто не позволяет получить трансплантационную дозу, достаточную для двукратной трансплантации. Трудности, связанные с резистентностью к медикаментозной мобилизации, приходится решать на этапе лейкоцитафереза. Если трансплантационную дозу не удается получить в результате обработки 3-5 ОЦК, лейкоцитаферез повторяют на следующий день. Возможно, целесообразно не откладывать операцию, а продолжить ее при достаточном содержании ГСК в кровотоке. Эффективность такого подхода пока не оценивалась. 4 Иногда при выполнении трансплантации ГСК требуется продолжительная доставка нативного трансплантационного материала к удаленному криохранилищу (Рабинович В.И., 2011). Экспериментально показано, что транспортировка может негативно влиять на способность ГСК к кроветворению (Shlebak A.A. et al, 1999). В России регламентирует транспортировку нативных ГСК Приказ Минздрава РФ №325 «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации». Однако он касается только транспортировки пуповинной крови и предполагает только количественную оценку ГСК. Следовательно, существует необходимость оценить влияние продолжительной транспортировки и на функциональные свойства ГСК, полученные при лейкоцитаферезе. Некоторые характеристики продукта лейкоцитафереза не позволяют криоконсервировать его в нативном виде. Например, большой объем лейкоконцентрата содержит значительное количество продуктов гемолиза и криопротектора, что может вызвать осложнения (Miniero R. et al, 1992; Corso S. et al, 1993; Benekli M. et al, 2000; Higman M.A. et al, 2000; Hoyt R. et al, 2000; Hequet O. et al, 2002; Windrum P. et al, 2003). Поэтому на этапе подготовки материала к криохранению используют редукцию его объема. Однако это может вести к потерям и повреждению ГСК. Кроме того, увеличение концентрации лейкоцитов в результате редукции объема трансплантата, снижает сохранность ГСК при криоконсервации (Liseth K. et al, 2005). Пока не разработаны однозначные методические подходы, сохраняющие ГСК в подобных ситуациях. Целью исследования, с учетом описанной проблематики, является оптимизация методического подхода к получению, транспортировке и подготовке к хранению гемопоэтических стволовых клеток периферической крови для аутологичной трансплантации пациентам с множественной миеломой. Для достижения данной цели поставлены следующие задачи: 1. Повысить эффективность лейкоцитафереза при резистентности к медикаментозной мобилизации у пациентов с множественной миеломой, которым показана аутотрансплантация гемопоэтических стволовых клеток. 5 2. Выявить оптимальные условия транспортировки нативного лейкоконцентрата, содержащего гемопоэтические стволовые клетки для аутотрансплантации. 3. Оценить влияние продолжительности транспортировки на трансплантационный материал, содержащий гемопоэтические стволовые клетки для аутотрансплантации. 4. Оценить влияние редукции объема трансплантационного материала на гемопоэтические стволовые клетки. Научная новизна исследования. Выявлено, что компенсаторные возможности костного мозга в условиях медикаментозной мобилизации позволяют сохранить высокую концентрацию ГСК в периферической крови, несмотря на их интенсивный отбор при выполнении аппаратного лейкоцитафереза. Впервые установлено, что при продолжительной транспортировке в течение суток, пролиферативный потенциал ГСК снижается по линейной зависимости от времени, несмотря на сохранение их абсолютного количества. Получены новые данные о влиянии концентрации лейкоцитов на сохранность ГСК при введении криопротектора в трансплантационный материал. Выяснено, что высокий лейкоцитоз ведет к низкой сохранности ГСК после введения криопротектора с диметилсульфоксидом (ДМСО). Малый относительный объем плазмы в материале с гиперлейкоцитозом обуславливает высокую начальную концентрацию ДМСО в момент его введения. Это ведет к гиперосмолярности и цитолизу ГСК. Практическая значимость. Разработан протокол выполнения лейкоцитафереза с учетом динамики мобилизации ГСК из костного мозга в периферическую кровь. Установлено, что в конце стандартной программы лейкоцитафереза концентрация ГСК в периферической крови позволяет продолжить операцию и получить достаточную трансплантационную дозу. При проведении клинической апробации пациентам резистентным к медикаментозной мобилизации удалось уменьшить кратность лейкоцитафереза и сократить продолжительность курса применения препаратов гранулоцитарных колониестимулирующих факторов (Г-КСФ). 6 Разработан метод расчета трансплантационной дозы ГСК, которую необходимо заготовить с учетом снижения их пролиферативного потенциала при продолжительной транспортировке нативного лейкоконцентрата. Оптимизированы показания к редукции объема нативного лейкоконцентрата по методу Rubinshtein с учетом снижения количества ГСК и их пролиферативного потенциала при данном методе обработки. Разработан способ повышения сохранности ГСК при высоком лейкоцитозе нативного лейкоконцентрата путем добавления в него предварительно заготовленной аутоплазмы. Объем аутоплазмы, который необходимо добавить в трансплантат точно рассчитывается по формуле. Основные положения, выносимые на защиту 1. У пациентов с множественной миеломой, имеющим резистентность к медикаментозной мобилизации, выполнение лейкоцитафереза при концентрации ГСК в периферической крови < 45 ГСК/мкл не позволяет получить двукратную трансплантационную дозу (6×106/кг). 2. Концентрация ГСК в периферической крови ≥ 10 ГСК/мкл по окончанию программы лейкоцитафереза позволяет пролонгировать операцию с целью получения двукратной трансплантационной дозы. Данный подход сокращает продолжительность медикаментозной мобилизации и исключает необходимость в повторном лейкоцитаферезе на следующий день. 3. Транспортировка лейкоконцентрата при температуре +24°С, в сравнении с температурой +4°С, позволяет уменьшить цитолиз лейкоцитов на 9% через 12 часов и на 12% через 24 часа. Низкочастотные вибрации, возникающие при транспортировке, не влияют на цитолиз лейкоцитов, на количество ГСК и их пролиферативный потенциал. 4. Транспортировка в течение суток не влияет на количество ГСК, но снижает их пролиферативный потенциал. Через 6 часов величина снижения пролиферативного потенциала составляет 16±1,2%, через 12 часов – 37±4,1%, через 24 часа – 62±6,1%. 5. Редукция объема трансплантационного материала ведет к потере 23% ГСК на этапе плазмоэкстракции и уменьшению их способности к кроветворению на 47%. Увеличение концентрации лейкоцитов в 7 результате редукции объема материала ведет к снижению сохранности ГСК при добавлении криопротектора ДМСО. Апробация и внедрение результатов исследования. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: 14-й Международной конференции «Новое в трансфузиологиии: нормативные документы и технологии», г. Москва, 16 мая 2013 года; II Конгресс гематологов России, г. Москва, 17-19 апреля 2014 год. Результаты работы опубликованы в материалах: I Конгресса гематологов России, 2-4 июля 2012 г., Москва; конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», 24-25 октября 2012 г., Санкт-Петербург; VI Ежегодного Международного Симпозиума «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий», 11-12 октября 2013 г., Москва; II Конгресса гематологов России, 17-19 апреля 2014 г., Москва. Апробация диссертации проведена на межлабораторном заседании в «Российском НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА», г. Санкт-Петербург, 22 мая 2014 г. На основании полученных результатов внесены изменения в Стандартные операционные процедуры Автономного учреждения «Югорский НИИ клеточных технологий» г. Ханты-Мансийска. Разработан и утвержден Протокол выполнения лейкоцитафереза. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 4 статьи – в изданиях рекомендованных ВАК РФ для публикации диссертационных материалов. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 93 источника (из них 74 в иностранных изданиях). Работа иллюстрирована 6 таблицами и 8 рисунками. Личный вклад автора. Автором лично выполнялись планирование исследований; лабораторные анализы количества ГСК и их пролиферативного потенциала, подсчет лейкоцитов с помощью микроскопии в камере Горяева; ведение первичной документации и анализ историй болезни; анализ полученных данных, статистическая обработка и обобщение результатов; разработка новых рабочих протоколов и методов; и внедрение их в практику. 8 ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для решения задачи по увеличению эффективности лейкоцитафереза было выполнено ретроспективное клиническое исследование. Для этого проанализированы 28 протоколов лейкоцитаферезов выполненных 20 пациентам с диагнозом ММ, которым была успешно проведена АутоТГСК. Среди пациентов было 11 мужчин и 9 женщин в возрасте от 32 до 63 лет. Общее состояние больных на момент назначения лечения с применением АутоТГСК по Шкале ECOG-ВОЗ – 1 балл. Для проведения мобилизации ГСК всем пациентам на фоне полной или частичной ремиссии вводился внутримышечно цитостатический препарат (Циклофосфамид) однократно 4 г/м2 поверхности тела. После достижения лейкоцитопении ниже 1×109/л, назначалось ежедневное подкожное введение ГКСФ (Филграстим) 10 мкг/кг массы тела, включительно до завершения получения трансплантационного материала на клеточном сепараторе Haemonetics MSC+ по программе «PBSC», разработанной производителем. Получение трансплантационного материала путем лейкоцитафереза начинали при концентрации ≥10ГСК/мкл в периферической крови. После завершения программы «PBSC», отбирали пробу из полученного лейкопродукта и пробу из периферической крови. Если необходимая трансплантационная доза (6 млн. ГСК/кг) не была получена, а в периферической крови сохранялась концентрация ≥10ГСК/мкл, то лейкоцитаферез продолжали. Эффективность данной тактики оценивалась по увеличению доли пациентов, у которых трансплантационная доза получена без повторного лейкоцитафереза на следующий день. Для определения оптимальных условий длительной транспортировки ГСК был проведен эксперимент с 40 образцами пуповинной крови (ПК). Полученный в результате естественных родов материал ПК помещали в моделируемые условия транспортировки. Для этого ПК делили на 4 группы. Одну часть помещали в комнатную температуру +24°С, другую – температуру, рекомендованную для хранения донорской крови +4°С в защищенном от света месте. Моделирование механических воздействий осуществлялось при той и другой температуре с помощью программируемого шейкера MultiBio 3D (Biosan, Латвия), и проводили сравнение с контрольными – неподвижно находящимися при данной температуре образцами. Отбор проб ПК для лабораторного анализа осуществлялся непосредственно перед началом 9 эксперимента, а затем через 6, 12 и 24 часа. Затем рассчитывался процент снижения количества ГСК и их пролиферативного потенциала. Результаты, полученные на модели пуповинной крови, апробированы в работе с клиническим трансплантационным материалом. С этой целью было выполнено ретроспективное клиническое исследование результатов транспортировки лейкоконцентрата, полученного у 20 пациентов с ММ. Выполнялась оценка колониеобразующей активности ГСК до и после транспортировки с целью расчета снижения данного параметра в процентах. Результаты данной оценки сравнивались с результатами, полученными при моделировании условий транспортировки на ПК. Для решения задачи по оценке влияния редукции объема трансплантата на свойства ГСК выполнялось проспективное исследование на экспериментальном материале ПК в количестве 39 образцов. Редукция объема материала выполнялось по методу Rubinstein. Седиментация эритроцитов проводилась в присутствии 6% раствора гидроксиэтиленкрахмала при центрифугировании с ускорением 50g в течение 5 минут при 10°С. Затем проводилось центрифугирование с ускорением 400 g в течение 10 минут с последующим выполнением плазмоэкстракции. В результате получали концентрат лейкоцитов. Повторное центрифугирование проводили на центрифуге Multifuge 4 KR с ротором LH-4000 (Rmax=247 мм), расчетные значения по методу Rubinstein для указанной центрифуги составили - RPM = 425 об/мин (RCF=50g), RPM = 1200 об/мин (RCF=400g). Перед первым и после повторного фракционирования выполнялся отбор проб для исследования количества ГСК и определения их колониеобразующей активности. Далее рассчитывался процент снижения сохранности данных параметров. Для оценки влияния гиперлейкоцитоза на ГСК, неизбежно возникающего при редукции объема по методу Rubinstein, проведено ретроспективное исследование протоколов криоконсервации 94 криопакетов с трансплантационным материалом, полученным у 20 пациентов с множественной миеломой. Редукция объема клинического трансплантационного материала не выполнялась, однако данный материал, как правило, характеризуется высоким лейкоцитозом, что позволило оценить влияние данного параметра на сохранность ГСК. Пробы для оценки количества жизнеспособных ГСК отбирались до и после введения криопротектора ДМСО. Затем рассчитывался процент снижения данного параметра. 10 Для решения поставленных задач были использованы лабораторные методы: Анализ количества ГСК и цитолиза лейкоцитов выполнялся на проточной цитофлуориметре Cytomics FC500 с программным обеспечением «StemCXP» с использованием заводского набора реагентов «Stem-Kit» (Beckman Coulter). Фенотип ГСК подлежащих учету: CD34+/CD45+(dim)/7AAD–. Анализ колониеобразующей активности ГСК выполняли методом культивирования в течение 14 суток на средах заводского производства Methocult H4435 (Stemcell Technologies), с последующей микроскопией на инвертированном микроскопе ЛОМО МИБ. Определение количества лейкоцитов и эритроцитов выполнялось с помощью световой микроскопии в камере Горяева на микроскопе Optika B-353. Методы математической статистики. Для оценки зависимости эффективности лейкоцитаферезов от концентрации ГСК в периферической крови и оценки сохранности ГСК в процессе криоконсервации в зависимости от концентрации лейкоцитов в трансплантационном материале применялся метод ранговой корреляции Спирмена. Для оценки влияния условий транспортировки и процесса редукции объема трансплантационного материала на свойства ГСК необходимо было выполнить сравнение результатов в контрольных и опытных группах. Для определения нормальности распределения значений в группах применялся критерий согласия Пирсона. В случае если распределение нормальное – для описания групп рассчитывались средние значения и стандартные отклонения, а для сравнения данных значений применялся параметрический критерий Стьюдента. Если распределение не подчиняется закону нормального распределения – для описания групп рассчитывались медианы и процентили, а для сравнения данных значений применялся непараметрический критерий Манна-Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В результате выполнения 20 лейкоцитаферезов только у 12 пациентов (60%) удалось получить необходимую трансплантационную дозу (6×106 ГСК/кг массы тела). У этих 12 пациентов во время лейкоцитафереза концентрация ГСК была выше 45 ГСК в мкл периферической крови (на рис. 1 данные случаи выделены круглым маркером). 11 Рисунок 1. График зависимости количества ГСК в продукте лейкоцитафереза от концентрации ГСК в периферической крови. Примечания: - наклонная линия тренда показывает зависимость исследуемых значений; - горизонтальная жирная линия разделяет результаты по величине полученной трансплантационной дозы ≥ 6×106 ГСК/кг; - вертикальная пунктирная линия – проекция точки пересечения линии тренда и горизонтальной прямой на результаты мобилизации ГСК. У остальных 8 (40%) пациентов, у которых концентрация ГСК в периферической крови составила ниже 45 ГСК/мкл периферической крови, не удалось получить необходимую трансплантационную дозу. Данная группа пациентов оказалась резистентна к медикаментозной мобилизации. Обычно, если трансплантационная доза в результате однократного лейкоцитафереза не набрана, продолжают введение Г-КСФ и на следующий день повторяют операцию. Между тем не очевидно, что на следующий день концентрация ГСК в периферической крови будет достаточной для проведения эффективного повторного лейкоцитафереза. Вместе с тем, чем раньше в ходе мобилизации будет выполнен лейкоцитаферез, тем больше вероятность собрать более ранние предшественники гемопоэза с наибольшим пролиферативным потенциалом. Поэтому целесообразно получить трансплантационную дозу в 12 результате однократного, своевременно выполненного лейкоцитафереза, коме того сократив длительность курса медикаментозной мобилизации. Была оценена эффективность пролонгированного лейкоцитафереза и увеличения объема обработанной крови на фоне положительной динамики мобилизации ГСК в сосудистое русло в ходе операции. При исследовании концентрации ГСК в периферической крови у пациентов с резистентностью к мобилизации выявлено, что по окончании рекомендованной программы лейкоцитафереза данный показатель сохраняется на уровне достаточном для продолжения операции (18 – 39 ГСК/мкл). Пролонгирование лейкоцитафереза у таких пациентов позволило получить двукратную трансплантационную дозу в 95 % случаев. Таким образом, удалось не только сократить кратность лейкоциитафереза и продолжительность курса Г-КСФ, но и расширить показания для проведения ВДХТ и АутоТГКС. Разработанная тактика лейкоцитафереза схематически показана на рисунке 2. Рисунок 2. Тактика пролонгирования процедуры лейкоцитафереза. 13 В соответствии со второй задачей исследования, было необходимо выявить оптимальные условия транспортировки незамороженного концентрата ГСК. Установлено, что транспортировка лейкоконцентрата при температуре +24°С минимизирует цитолиз лейкоцитов. Транспортировка материала при комнатной температуре через 12 часов приводит к цитолизу лейкоцитов на 9% меньше, а через 24 часа – на 12% меньше, чем при температуре +4 °С (рис. 3). Рисунок 3. Динамика цитолиза температурного режима транспортировки. лейкоцитов в зависимости от Полученные результаты обусловлены апоптозом и некрозом лейкоцитов. Гибель лейкоцитов может являться следствием нарушения работы ионных каналов клеточных мембран, а также снижением ассоциации мембранных рецепторов, блокирующих апоптоз, с лигандами при пониженных температурах. Несмотря на то, что восстановление кроветворения происходит за счет ГСК, цитолиз лейкоцитов в трансплантационном материале не желателен. При разрушении лейкоцитов высвобождается большое количество провоспалительных цитокинов, что обуславливает ряд побочных эффектов при выполнении АутоТГСК (Burger J. et al, 1991; Gomez S. et al, 1991). Поэтому, учитывая полученные результаты, мы рекомендуем выполнять транспортировку ГСК при температуре +24 °С. Также было выявлено, что низкочастотные вибрации, возникающие при транспортировке, не влияют на цитолиз лейкоцитов, количество ГСК и их пролиферативный потенциал. 14 Согласно третьей задаче, оценивалось влияние продолжительности транспортировки при оптимальной температуре на свойства нативных ГСК. Установлено, что продолжительная транспортировка в течение суток не влияет на количество ГСК, но уменьшает их пролиферативный потенциал – КОЕ ГСК снижается в линейной зависимости от времени. Через 6 часов снижение составляет 16±1,2%, через 12 часов – 37±4,1%, через 24 часа – 62±6,1% (рис. 4). Рисунок 4. Изменение колониеобразующей активности ГСК в зависимости от продолжительности транспортировки. Примечание. * - отличия достоверны в сравнении с исходным значением (p<0,05). Линия тренда показывает линейный характер снижения КОЕ в ходе исследования. Сходные результаты были получены в нескольких ранее проведенных исследованиях (Shlebak A.A. et al, 1999). Однако нами впервые был показан линейный характер снижения пролиферативной активности ГСК вследствие большей продолжительности нашего эксперимента. Это позволило с помощью уравнения линейной функции прогнозировать изменение пролиферативного потенциала ГСК с учетом продолжительности планируемой транспортировки с помощью формулы (1). КОЕ ГСК(%)= -k×T+100% (1) где k – угловой коэфициент прямой, который равен тангенсу угла наклона прямой, в нашем случае k = 0,047, Т – время транспортировки в минутах. 15 Учитывая, что пролиферативный потенциал ГСК in vitro отражает способность данных клеток к восстановлению кроветворения, способ прогноза его снижения имеет важное практическое значение. Зная планируемую продолжительность транспортировки, можно рассчитать трансплантационную дозу, необходимую для заготовки с учетом снижения способности ГСК к кроветворению. Усовершенствовав приведенное выше уравнение, можно вывести формулу (2) (2) Полученная адекватная трансплантационная доза (ТД) – количество ГСК необходимое для заготовки с учетом снижения их пролиферативного потенциала в зависимости от времени (Т, минуты) предполагаемой транспортировки. Разработанная формула представляет собой метод, легко применимый на практике. Описанный выше метод, разработанный нами на модели пуповинной крови, прошел апробацию при реальной транспортировке клинического трансплантационного материала из г. Сургут в г. Ханты-Мансийск. Необходимость апробации была обусловлено тем, что продолжительная транспортировка по-разному может влиять на свойства ГСК пуповиной крови и ГСК периферической крови. Результаты сравнительного анализа фактических результатов, полученных при транспортировке 20 образцов трансплантационного материала, полученных от больных ММ, и результатов прогнозирования приведен в таблице 1. Таблица 1. Результаты фактической и прогнозируемой величины снижения пролиферативной способности ГСК в ходе транспортировки (n=20). Продолжительность Прогнозируемая Фактическая транспортировки, сохранность КОЕ сохранность КОЕ, % минуты (k= -0,047), % Х±x 556,7±144,2 63,7±19,8 73,8±6,8 Как видно из таблицы 1, прогнозированная средняя сохранность пролиферативного потенциала ГСК на 10% превышала фактические результаты. Статистический анализ по Стьюденту позволил установить, что различия между фактическими и прогнозируемыми значениями достоверны 16 (p<0,05). Полученный результат свидетельствует о том, что пролиферативный потенциал ГСК, полученных из периферической крови, снижается в ходе транспортировки еще быстрее, чем у ГСК пуповинной крови в эксперименте. Результат получен при транспортировке со средней продолжительностью 557±144 минут, которая была актуальна для клинической работы Югорского НИИ клеточных технологий. Очевидно, что с увеличением продолжительности транспортировки, разница между пролиферативным потенциалом ГСК клинического трансплантационного материала и прогнозом будет расти, что наглядно продемонстрировано на рисунке 5. Можно предположить, что через 24 часа транспортировки пролиферативный потенциал нативных ГСК снизиться всего до 10% от исходного. Рисунок 5. Сравнение результатов полученных на экспериментальном материале пуповинной крови (на графике сплошная линия) с результатами клинической апробации (на графике пунктирная линия). Результаты клинической апробации показывают необходимость коррекции углового коэффициента. График снижения пролиферативного потенциала ГСК в клиническом трансплантационном материале позволяет рассчитать новый угловой коэффициент (k=-0,065) и подставить его в разработанную формулу (3). (3) 17 Тенденция снижения пролиферативного потенциала ГСК при транспортировке нативного трансплантационного материала очевидна. Следовательно, разработанный нами метод прогнозирования снижения пролиферативного потенциала ГСК при транспортировке позволяет обосновать увеличение заготовки трансплантационной дозы с учетом данных потерь. Решая задачи исследования, было необходимо оценить влияние редукции объема трансплантационного материала на свойства ГСК. Выявлено, что редукция объема трансплантационного материала ведет к потере 23±4,8% ГСК и уменьшению их пролиферативного потенциала на 47±21,6% (таблица 2). Таблица 2. Сохранность ГСК и их пролиферативного потенциала при выполнении редукции объема трансплантационного материала по Rubinstein. Показатель Сохранилось после Потеря в ходе фракционирования в % фракционирования % (n=39) (n=39) ГСК 77,2±16,1** 22,8±4,8** КОЕ 53±24,4* 47±21,6* Примечание. * - р<0,001, при сравнении с исходным значением; ** р<0,2, при сравнении с исходным значением Следовательно, при проведении операции лейкоцитафереза необходимо увеличить заготовку трансплантационного материала с учетом возможной потери 47% пролиферативного потенциала ГСК при обработке по Rubinstein. Однако большая величина дисперсии полученных результатов, обусловленная отсутствием автоматизации метода Rubinstein, не позволяет точно прогнозировать изменение свойств ГСК. Кроме того, далеко не всегда возможно значительно увеличить дозу заготовленного трансплантационного материала с учетом данных потерь. Следовательно, учитывая выше перечисленное, редукция объема трансплантационного материала допустима, если заготовленная доза ГСК кратно превышает необходимую. Кроме того, неизбежным результатом редукции объема трансплантата является увеличение концентрации лейкоцитов, что ведет к снижению сохранности ГСК при низкотемпературном хранении (Liseth K. et al, 2005). Поэтому в исследовании проводилась оценка сохранности ГСК в процессе криоконсервации при высокой концентрации лейкоцитов в трансплантационном материале. 18 Было установлено, что сохранность ГСК после введения криопротектора ДМСО прямо зависит от концентрации лейкоцитов в лейкоконцентрате (r = 0,6; p<0,05, N=94). В среднем сохранность ГСК после введения ДМСО составила 71% от исходного значения. Это соответствует ранее полученным данным, но только в аспекте зависимости данных параметров (Liseth K. et al, 2005). В нашем исследовании впервые показано, что снижение сохранности ГСК связанное с высоким лейкоцитозом происходит уже на этапе введения ДМСО в материал, а не в процессе замораживания, как считалось раньше. Таким образом, обработка трансплантационного материала по Rubinstein эффективно редуцирует его объем и удаляет клеточные примеси, но приводит к потере 22,8% ГСК и на 47% снижает их колониеобразующую активность. Также необходимо учитывать, что редукция трансплантационного материала ведет к увеличению концентрации ЯСК в среднем в 2 раза, что также негативно влияет на сохранность ГСК при криоконсервации. Следовательно, принимать решение о выполнении редукции трансплантационного материала необходимо с учетом установленного снижения способности ГСК к восстановлению кроветворения. Если величина трансплантационной дозы, полученной к обработке, не допускает ее снижения, целесообразно отказаться от редукции объема полученного материала. Часто продукт лейкоцитафереза исходно содержит высокие концентрации лейкоцитов. Такие ситуации возможны, если схема мобилизации не предполагала проведение предварительной цитостатической химиотерапии, и лейкоцитаферез выполнялся на фоне высоких концентраций лейкоцитов. Кроме того, это возможно в тех случаях, когда рост концентрации ГСК достигает приемлемых значений на поздних сроках проведения медикаментозной мобилизации. В любом случае необходимо особое внимание к клеточному сгущению при подготовке материала к хранению. Если лейкоцитаферез выполнялся при высокой концентрации лейкоцитов в периферической крови, целесообразно заготовить аутоплазму. При концентрации лейкоцитов в лейкопродукте выше ≥ 150×109/л, необходимо разведение лейкоконцентрата аутоплазмой до указанного значения. Необходимое количество аутоплазмы легко рассчитывается по формуле (4). (4) 19 , где V(аутоплаз.) – объем добавляемой аутоплазмы, мл; V(исход. мат-ла) – объем исходного материала, мл; С(лейкоцитов) – концентрация лейкоцитов в исходном трансплантационном материале, ЯСК×109 /л; 150 – рекомендуемая концентрация лейкоцитов в трансплантационном материале, ЯСК×109 /л. Таким образом, решение задач диссертации позволило обосновать и разработать четкий методический подход к получению, транспортировке и подготовке к хранению ГСК, предназначенных для аутотрансплантации при множественной миеломе. Разработанные методы и практические рекомендации просты для применения и не требуют дополнительного оснащения оборудованием. Напротив, предложенный подход позволяет сократить расходы на медикаментозную мобилизацию и увеличить эффективность получения трансплантационного материала. При выполнении транспортировки и подготовке к хранению лейкоконцентрата, содержащего ГСК, предложены способы оценки риска снижения трансплантационной дозы и мероприятия по снижению этого риска. Кроме того, полученные результаты могут служить основой для дальнейшего усовершенствования и автоматизации трансфузиологических технологий, направленных на обеспечение качественным трансплантационным материалом АутоТГСК. ВЫВОДЫ 1. Получить трансплантационную дозу у пациентов с резистентностью к мобилизации возможно путем пролонгирования лейкоцитафереза, при условии, что концентрация ГСК в периферической крови в ходе процедуры сохраняется на уровне ≥ 10 ГСК/мкл. В результате доля эффективных лейкоцитаферезов увеличена с 60 до 95%. 2. Транспортировка лейкоконцентрата, содержащего гемопоэтические стволовые клетки, при температуре +24°С позволяет уменьшить цитолиз лейкоцитов по сравнению с температурой +4°С. 3. Низкочастотные вибрации, возникающие при транспортировке трансплантата, не оказывают негативного влияния на цитолиз лейкоцитов, количество гемопоэтических стволовых клеток и их пролиферативный потенциал. 20 4. Транспортировка трансплантата в течение суток не влияет на количество гемопоэтических стволовых клеток, но уменьшает их пролиферативный потенциал по линейной зависимости от времени. Через 6 часов пролиферативный потенциал ГСК снизился на 16±1,2%, через 12 часов – на 37±4,1%, через 24 часа – на 62±6,1%. 5. Редукция объема трансплантационного материала ведет к потере 23% ГСК и уменьшению их пролиферативного потенциала на 47%. Увеличение лейкоцитоза в результате редукции объема трансплантата вызывает снижение сохранности ГСК на этапе введения криопротектора диметилсульфоксида. Практические рекомендации 1. У пациентов с резистентностью к медикаментозной мобилизации, у которых по окончанию программы лейкоцитафереза не получена трансплантационная доза, целесообразно выполнение анализа количества ГСК в периферической крови в конце операции. Если данный параметр составляет ≥ 10 ГСК/мкл, рекомендуется продолжить лейкоцитаферез пока трансплантационная доза не будет набрана. Пролонгирование лейкоцитафереза позволит получить трансплантационную дозу, сократив продолжительность назначения препаратов Г-КСФ и исключив повторение лейкоцитафереза на следующий день. 2. Транспортировку до криохранилища незамороженного лейкоконцентрата, содержащего гемопоэтические стволовые клетки, необходимо выполнять при температуре +24°С. 3. Расчет величины трансплантационной дозы, необходимой для заготовки, рекомендуется выполнять с учетом снижения способности ГСК к пролиферации в процессе длительной транспортировки. Расчет адекватной трансплантационной дозы (ТД), необходимой для заготовки, выполняется с учетом планируемой продолжительности транспортировки (Т, минуты): Транспортную логистику трансплантационного материала необходимо планировать таким образом, чтобы минимизировать потери способности ГСК к кроветворению. 4. Выполнение редукции объема трансплантационного материала ведет к уменьшению количества ГСК и значительному снижению их 21 пролиферативного потенциала. Учитывая, что величина изменения данных параметров слабо предсказуема, выполнение редукции объема трансплантационного материала нецелесообразно. 5. При концентрации лейкоцитов в трансплантационном материале выше 150×109/л увеличивается повреждающее действие ДМСО на ГСК. В таких случаях перед введением ДМСО рекомендуется снизить концентрацию лейкоцитов ниже данного значения путем добавления аутоплазмы в лейкоконцентрат. Необходимое количество аутоплазмы рассчитывается по формуле: , где V(аутоплаз.) – объем добавляемой аутоплазмы, мл; V(исход. мат-ла) – объем исходного материала, мл; С(лейкоцитов) – концентрация лейкоцитов в исходном трансплантационном материале, ЯСК×109 /л; 150 – рекомендуемая концентрация ЯСК в трансплантационном материале, ЯСК×109 /л. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Влияние температуры и механических воздействий на цитолитические процессы и пролиферативную активность гемопоэтических стволовых клеток периферической крови при их продолжительной транспортировке / А.А. Степанов, Е. В. Коротаев, В. И. Рабинович и др. // Медлайн.ру: Российский биомедицинский журнал. – 2012. – Т. 13. – [Электронный ресурс]. – URL: http://medline.ru/public/art/tom13/art16.html 2. Преимущества и недостатки обработки материала для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток по Рубинштейну / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, В.И. Рабинович и др. // Эфферентная и физико-химическая медицина. – 2012. – № 3. – С. 21-25. 3. Выделение гемопоэтических стволовых периферической крови для трансплантации при ВИЧ-инфекции / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, В.И. Рабинович и др. // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. – 2012. – Т. 4, №4. – С. 74-79. 22 4. Алгоритм получения гемопоэтических стволовых клеток из периферической 5. 6. 7. 8. 9. 10. крови для аутологичной трансплантации / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, С.С. Бессмельцев и др. // Медлайн.ру: Российский биомедицинский журнал. – 2013. – Т. 14. – [Электронный ресурс]. – URL: http://www.medline.ru/public/art/tom14/art24.html Влияние отмывания криопротектора диметилсульфоксида на свойства гемопоэтических стволовых клеток трансплантационного материала / А.А. Степанов, Е. В. Коротаев, С.С. Бессмельцев и др. // Медлайн.ру: Российский биомедицинский журнал. – 2013. – Т. 14. – [Электронный ресурс]. – URL: http://www.medline.ru/public/art/tom14/art24.html «Закрытая» система распределения трансплантационного материала в криопакеты как способ минимизации риска контаминации при аутотрансплантации гемопоэтических стволовых клеток периферической крови / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, В.И. Рабинович и др. / Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и службе крови: материалы Всероссийской научно-практической конференции // Вестник гематологии. – 2012. – Т. VIII, №1. – С. 56. Организационные аспекты противоинфекционной безопасности трансплантационного материала при аутотрансплантации гемопоэтических стволовых клеток периферической крови / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, В.И. Рабинович и др. / Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и службе крови: материалы Всероссийской научнопрактической конференции // Вестник гематологии. – 2012. – Т. VIII, №1. – С. 82-83. Методика обработки и контроля качества биоматериала при аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, В.И. Рабинович и др. / Материалы I конгресса гематологов России // Гематология и трансфузиология. – 2012. – №3. – С. 116. Оценка влияния температуры, времени и механического воздействия на активность цитолитических процессов и пролиферативную активность гемопоэтических стволовых клеток при транспортировке трансплантационного материала / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, В.И. Рабинович и др. / Материалы I конгресса гематологов России // Гематология и трансфузиология. – 2012. – №3. – С. 138. Преимущества сочетанного применения проточной цитометрии и культивирования для оценки качества гемопоэтических стволовых клеток 23 трансплантационного материала при выполнении трансплантации в онкогематологии / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, В.И. Рабинович и др. / Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: материалы Всероссийской научно-практической конференции // Трансфузиология. – 2012. – Т. 13, №3. – С. 98. 11. Алгоритм получения гемопоэтических стволовых клеток из периферической крови для аутологичной трансплантации / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, В.И. Рабинович и др. / Актуальные вопросы генных и клеточных технологий: тезисы докладов VI Ежегодного международного симпозиума // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2013. – Т. 8, №3. – С. 55. 12. Зависимость тактики лекоцитафереза от особенностей кинетики мобилизации ГСК из костного мозга / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, С.С. Бессмельцев и др. / Материалы II Конгресса гематологов России // Гематология и трансфузиология. – 2014. – Т. 59, №1. – С. 121. 13. Оптимизация процесса введения ДМСО в трансплантационный материал при высоком гематокрите / А.А. Степанов, Е.В. Коротаев, С.С. Бессмельцев и др. / Материалы II Конгресса гематологов России // Гематология и трансфузиология. – 2014. – Т. 59, №1. – С. 121. Подписано в печать 22.01.2015 г. Формат 60×84/16 Тираж 100 экз. Заказ №12. Отпечатано в ООО «Печатный мир г. Ханты-Мансийск» 628012, г. Ханты-Мансийск, ул. Мира, 46.
