Диагностическая и прогностическая значимость сывороточных и

ÀÊÓØÅÐÑÒÂÎ. ÃÈÍÅÊÎËÎÃÈß. ÏÅÄÈÀÒÐÈß
УДК616-002.77-053.2-073.916-077.58
С.А.ПЫРКОВА, С.А.ГОРЮНОВ
Самарский государственный медицинский университет
Кафедра факультетской педиатрии
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
СЫВОРОТОЧНЫХ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОКИНОВ У ДЕТЕЙ
И ПОДРОСТКОВ, БОЛЬНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ВАРИАНТАМИ
ЮВЕНИЛЬНОГО ИДИОПАТИЧЕСКОГО АРТРИТА
Научный руководитель – профессор В.А. Кельцев
Для уточнения диагноза ЮИА и определения значимости патогенетических изменений показано исследование показателей гуморального иммунитета, наиболее
информативных при данной патологии, а именно: спектр интерлейкинов: TNFα, IL6,
IL1β, IL4, уровень спонтанных и стимулированных лимфоцитарных и моноцитарных
ИЛ-1β. Значение цитокинов является определяющим в индуктивной фазе иммунного
ответа, когда они обусловливают развитие базовых реакций макрофагальных и антигенспецифических клеток: взаимодействие этих клеток с лимфоцитами, активацию
и пролиферацию последних, в определенной степени — формирование клеток-эффекторов. На поздних этапах иммунного ответа, в период реализации эффекторных
иммунологических функций роль цитокинов становится менее значительной. Уровень
спонтанных и стимулированных лимфоцитарных и моноцитарных ИЛ-1β отражает
активность патологического процесса и может использоваться в прогнозировании
исходов ювенильного идиопатического артрита.
Ключевые слова: ювенильный идиопатический артрит, подростки и дети, иммунный статус, цитокины
For the diagnosis specification of juvenile idiopathic arthritis and the determination of
the importance of pathogenetic changes the research of parameters humor immunity, which
are the most informative, is shown in the given pathology, namely: a spectrum cytokines:
TNF , IL6, IL1 , IL4, a level of spontaneous both stimulation lymphocytes and monocytes IL1 .
Cytokines value is a main factor in an inductive phase of the immune answer when they cause
the development of base reactions of makrophages and antigenspecificaition cells: interaction
of these cells with lymphocytes, activation and proliferation the latter, in the certain degree
the formation of cells effectors. At late stages of the immune answer, during the realization
of effector immunity functions the role cytokines becomes less significant. The level both
stimulations lymphocytes and monocytes IL1 reflects the activity of the pathological process
and can be used in forecasting outcomes of juvenile idiopathic arthritis.
Key words: juvenile idiopathic an arthritis, teenagers and children, the immune status,
cytokines
В настоящее время ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) занимает
ведущее место среди ревматологических
заболеваний у детей и подростков. Высокая
частота встречаемости и тяжелое течение
заболевания, тенденция к ранней инвалидизации, вовлечение в патологический
процесс внутренних органов (сердце, легкие, почки, глаза) делают ЮИА актуальной
медико-социальной проблемой.
В последнее время в литературе значительное внимание уделяется исследованию
цитокиновой регуляции иммунной системы при ЮИА с целью оценки степени
иммунологических нарушений. В настоящее время, контроль над течением этого
тяжелого инвалидизирующего процесса
достигается только благодаря патогенетической терапии, поэтому данные иссле-
дования представляются значимыми для
понимания патогенетических механизмов
развития ЮИА1.
Доказано, что в основе развития ЮИА
лежит активация как клеточного, так и
гуморального звена иммунитета. Преобладание того или другого звена иммунитета
определяется степенью дифференцировки
Т-лимфоцитов – хелперов 1-го или 2-го
типа и спектром цитокинов, которые они
1
Алексеева Е.И., Шахбазян И.Е. Принципы патогенетической терапии тяжелых системных вариантов
ювенильного ревматоидного артрита. // Серия. Аутоиммунные болезни. – Москва. 2002-223с.; Баранов А.А.,
Алексеева Е.И., Шувалова М.П., Сырцова Л.Е. Проблемы
ревматических болезней у детей в Российской Федерации. Росс. Педиатр. Журнал. 2003 - № 5, С.4 – 10.; Кельцев
В.А. Ювенильный идиопатический артрит . – Самара,
2005. -214 с.
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 5-6, 2011
25
ÀÊÓØÅÐÑÒÂÎ. ÃÈÍÅÊÎËÎÃÈß. ÏÅÄÈÀÒÐÈß
вырабатывают в ответ на антигенную стимуляцию1.
Показано, что полиартикулярный вариант течения заболевания коррелирует с
повышением уровня ФНО-α. При олигоартикулярном варианте ЮИА определяется
повышенный уровень ИЛ-4.
В связи с вышеизложенным, целью работы было дать оценку диагностической
прогностической значимости содержания
сывороточных и внутриклеточных ИЛ1β у
больных в зависимости от давности заболевания ЮИА детей.
Материалы и методы исследования
В основу работы положены результаты
обследования 118 детей, из них 88 больных
ювенильным идиопатическим артритом и
30 условно здоровых детей контрольной
группы. Для постановки и верификации
диагноза использовались классификационные критерии ювенильного идиопатического артрита (Durban,1997, Эдмонтон,
2001). Исследования проводились на базе
детского кардиоревматологического и кардиохирургического отделения Самарского
Областного Клинического Кардиологического Диспансера на фоне комплексной
терапии и в динамике сроком от одного
года до трех лет.
Цитокины (IL-1β, IL-4, IL-6, ФНО-α) в
сыворотке крови определяли методом
иммуноферментного анализа с помощью
коммерческих тест-наборов для in-vitro
диагностики (ТОО «Протеиновый контур»,
г. Санкт-Петербург) по прилагаемым инструкциям, результаты выражали в пг/мл. Для
оценки внутриклеточного синтеза цитокинов мононуклеары периферической крови
получали путем выделения на градиенте
плотности фиколлверографина (1,077 г/
смЗ). Спонтанную продукцию ИЛ-1β Т-лимфоцитами оценивали по истечении 4 часов
инкубации в присутствии брефельдина А
при 37°С, в атмосфере 5% СО2. В качестве
активатора для симуляции внутриклеточного синтеза использовали РМА(«Sigma»,
50 ng/ml) плюс иономицин («Sigma», l
μg/ml). Иммунофенотипирование проводили с использованием ФИТЦ-меченых
aнти-CD3-моноклональных антител (ООО
«Сорбент», г. Москва) реконъюгированных
анти-ИЛ-4-, и ИЛ-1β -антител («Caltag»). Статистическая обработка полученных данных
проводилась на персональном компьютере
с помощью пакета прикладных программ
«Microsoft Office» и «Statistica 6.0». Исполь-
зовали методы математической статистики:
расчет средних величин, среднеквадратичных отклонений. Достоверность различий
средних значений между двумя выборками
определяли по t-критерию Стьюдента и
теста Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
Для исследования функционального
состояния иммунной систем были обследованы дети в возрасте от 7 до 17 лет. Все дети
были разделены на две подгруппы по полу
и возрасту. В первую подгруппу вошли дети
от 7 до 11 лет (22 мальчика и 24 девочки),
во вторую – от 12 до 17 лет (16 мальчиков и
26 девочек). Распределение больных ЮИА
в зависимости от пола и возраста представлено в таблице 1.
1
Для контроля цитокиновых показателей
использовались данные, полученные в результате обследования 30 практически здоровых детей того же возрастного состава (с
Кельцев В.А. Клиническая артрология. - Самара, 2010
– 612 с.; Кузьмина Н.Н., Воронцов И.М., Никишина И.Н.,
Салугина С.О. Эволюция взглядов на терминологию и
классификацию ювенильных хронических артритов
// Научно-практическая ревматология – 2008.- №1.
– С. 41-45.
26
Таблица 1
Возрастно-половой состав больных
ювенильным идиопатическим артритом
Пол
Всего
Возраст,
(годы)
7-11 лет
12-17 лет
девочки
50
24
26
мальчики
38
22
16
итого
88 (100%) 46
42
Из таблицы 1 видно, что в число обследованных детей вошли 50 (56,8%) девочек и
38 (43,2%) мальчиков. Вследствие недостаточного количества больных младше 7 лет
на момент исследования, данная группа не
была сформирована
Все дети, больные ювенильным идиопатическим артритом, были распределены на
три подгруппы в зависимости от длительности заболевания (таблица 2).
Таблица 2
Распределение больных, страдающих
ЮИА, в зависимости от длительности
заболевания
Количество
больных
абс.
%
Длительность
заболевания
Всего
до 1 года
от 1 до
3 лет
более 3
лет
20
30
38
88
22,7
34,1
43,2
100,0
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë
ÀÊÓØÅÐÑÒÂÎ. ÃÈÍÅÊÎËÎÃÈß. ÏÅÄÈÀÒÐÈß
информированного согласия родителей).
Следует отметить, что статистически значимых различий в показателях в зависимости
от возраста не отмечалось. В таблице 3
представлены средние значения ФНО-α,
ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6 у здоровых детей.
Распределение средних значений показателей ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-4 и ИЛ-6 в зависимости от варианта клинического течения и
возраста детей, больных ЮИА представлено
в таблице 3.
при полиартрите – 13,3±0,4 пкг/мл, при
олигоартрите распространяющемся уровень ФНО-α был повышен до 12,1±0,5 пкг/
мл, при олигоартрите персистирующем
содержание ФНО-α было минимальным и
находилось в пределах 10,1±0,9 пкг/мл. Уровень ИЛ-4 и ИЛ-6 в сыворотке крови детей,
больных ЮИА, при олигоартикулярных и
полиартикулярном вариантах был ниже
нормы (рис. 1).
Таблица 3
Содержания цитокинов в сыворотке крови в зависимости от варианта
клинического течения ЮИА и возраста больных (пкг/мл)
Диагноз
Здоровые
Олигоартрит
персистирующий
Олигоартрит
распространяющийся
Полиартрит
Возраст
ИЛ-1β
ИЛ-4
ИЛ-6
ФНО-α
7-17
84,85±3,75
45,45±3,05
47±3,02
8,2±1,11
7-11 лет
n=38
60,7±5,4
43,6±4,1
20,9±4,8*
14,4±0,9*
12-17 лет
n=16
40,0±3,8*
27,3±3,2*
34,7±5,1
15,1±1,2*
7-11 лет
n=2
185±5,1**
24,9±3,1*
24,2±3,7*
18,0±1,1*
12-17 лет
n=8
217,5±6,7**
31,1±3,8
15,5±3,4**
26,26±2,6*
7-11 лет
n=6
77,8±4,5
24,8±3,6*
16,6±3,5**
12,8±1,1*
12-17 лет
n=18
147,2±3,9**
29,2±3,9
17,1±4,2**
13,2±2,4*
Примечание: *- статистически значимые различия с группой здоровых детей, соответствующего
возраста при p<0,05, ** - при p<0,01
Из таблицы 3 видно, что при всех клинических вариантах ЮИА во всех возрастных группах наблюдалось достоверное
повышение ФНО-α. ИЛ-1β был достоверно
повышен у детей, больных олигоартритом
распространяющимся. Содержание ИЛ-4 и
ИЛ-6 в сыворотке крови у детей, больных
полиартритом, олигоартритом персистирующим и распространяющимся, было в
пределах нормы.
Также мы исследовали зависимость
содержания ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-4 и ИЛ-6 в
сыворотке крови от длительности заболевания (рис. 1,2,3,).
При длительности заболевания менее
одного года, нами отмечено высокое содержание ИЛ-1β в сыворотке крови у детей с
персистирующим олигоартритом – 125±1,2
пкг/мл. При полиартрите и олигоартрите
распространяющемся уровень ИЛ-1β был
ниже нормы и составил соответственно
51,5±0,8 пкг/мл и 61,0±0,5 пкг/мл соответственно. Максимальное содержание ФНО-α
в сыворотке обследуемых детей отмечалось
При длительности заболевания от одного года до трех лет наблюдалось повышение
содержания ИЛ-1β в сыворотке крови у детей с олигоартритом персистирующим, и
соответствовало значению 86,4±0,4 пкг/мл.
При полиартрите и олигоартрите распространяющемся уровень ИЛ-1β определялся
ниже нормы – 24,4±0,2 пкг/мл и 45,0±0,7
пкг/мл соответственно. Максимальное содержание ФНО-α в сыворотке крови наблюдалось при полиартритическом варианте
ЮИА – 17,8±0,8 пкг/мл. Уровень ФНО-α
также был повышен при олигоартрите
персистирующем – 15,1±0,5 пкг/мл и олигоартрите распространяющемся – 13,6±0,6
пкг/мл. Значение ИЛ-4 и ИЛ-6 в сыворотке
крови при всех клинических вариантах
ЮИА оставалось ниже нормы (рис.2).
При длительности заболевания более
трех лет нами отмечено, что уровень ИЛ-1β
был достоверно выше нормы при полиартрите и олигоартрите распространяющемся и равнялся 101,1±0,7 пкг/мл и 94,0±0,5
пкг/мл соответственно, при олигоартрите
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 5-6, 2011
27
ÀÊÓØÅÐÑÒÂÎ. ÃÈÍÅÊÎËÎÃÈß. ÏÅÄÈÀÒÐÈß
Пкг/мл
Рис. 1. Уровень цитокинового статуса при
ЮИА при длительности заболевания менее одного года
Пкг/мл
Рис. 2. Уровень цитокинового статуса при
ЮИА при длительности заболевания от
одного года до трех лет
Рис. 3. Уровень цитокинового статуса
при ЮИА при длительности заболевания
более трех лет
персистирующем значение цитокина было
снижено до средних значений – 43,2±0,6
пкг/мл. Максимальное повышение ФНО-α
наблюдалось при полиартрите - 18,4±0,2
пкг/мл, при олигоартрите распространяющемся и олигоартрите персистирующем
содержание ФНО-α в сыворотке крови
также было повышено и составило 15,3±0,4
пкг/мл и 18,0±0,8 пкг/мл. Уровень ИЛ-4 и
ИЛ-6 при олигоартритических и полиартритическом вариантах ЮИА был снижен
(рис. 3).
28
Таким образом, при олигоартрите персистирующем отмечена ярко выраженная
закономерность снижения уровня ИЛ-1β
при увеличении длительности заболевания.
Так, содержание в сыворотке крови ИЛ1β при длительности заболевания менее
одного года составило 125±1,2 пкг/мл, от
одного года до трех лет – 86,4±0,4 пкг/мл,
а более трех лет – 43,2±0,6 пкг/мл, что
может свидетельствовать о максимальной
активности воспалительного процесса в
первый год заболевании. При длительности
заболевания около трех лет происходит
окончательное формирование иммунологических механизмов поддержания
хронического воспалительного процесса.
У детей с полиартритом и олигоартритом
распространяющемся нами выявлено повышение уровня ИЛ-1β в сыворотке крови,
напрямую связанное с продолжительностью заболевания.
Определенный интерес представляли
субпопуляции СД3-лимфоцитов и моноцитов, содержащих цитоплазматические
цитокины ИЛ-1β у больных ЮИА в зависимости от активности и длительности заболевания и, в частности, активированные
цитокины, то есть интерлейкины внутриклеточные выходящих в кровеносное русло
при стимуляции специальными реагентами. По количество их в сыворотке в ответ на
стимуляцию можно судить о возможности
иммунной системы отвечать на антигенный стимул, а уровень их в крови является
важным показателем в прогнозировании
течения заболевания и адекватности проводимой терапии. В исследование включено
30 детей, больных различными вариантами
ЮИА.
При анализе уровня ИЛ-1β спонтанно
секретируемых лимфоцитами и моноцитами отмечался их высокий уровень в острый
период заболевания. В ответ на стимуляцию
выброс цитокина был высоким и зависел от
активности процесса, что может служить
показателем адекватной реакцией на воспалительный процесс (таблица 4). При стимуляции лимфоцитов и моноцитов у больных
ЮИА с длительностью заболевания до трех
лет и более отмечалось снижение уровня
спонтанной и стимулированной секреции
ИЛ-1β, что можно расценивать как нарушение адекватной реакции на воспалительный
процесс и рассматривать как неблагоприятный прогностический фактор течения
заболевания (таблица 5, 6).
Таким образом, изучая цитокиновый
спектр при ЮИА, можно выделить характерные особенности изменения этого
иммунологического звена, которые могут
выступать в виде ранних диагностических
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë
ÀÊÓØÅÐÑÒÂÎ. ÃÈÍÅÊÎËÎÃÈß. ÏÅÄÈÀÒÐÈß
Таблица 4
Уровень спонтанных и стимулированных лимфоцитарных и моноцитарных ИЛ-1β
у больных ЮИА при длительности заболевания менее одного года (пкг/мл)
Диагноз
Олигоартрит
персистирующий
Лимфоциты Лимфоциты
Кол-во
ИЛ-1β
ИЛ-1β
больных
спон.
стим.
Моноциты
ИЛ-1β
спон.
Моноциты
ИЛ-1β
стим.
10
1021,9±2,2
1033,9±1,9 ***
1001,4 ±2,4
998,3±2,3 ***
Олигоартрит
распространяющийся 10
1049,5±3,2
1062,6±1,9 ***
1076,4±1,4
1036,9±2,6 ***
Полиартрит
1060,4±3,8
1085,6±2,5 ***
1030,1±1,2
1022,9±0,6 ***
10
Примечание: *- статистически значимые различия между группами до стимуляции и после стимуляции при p<0,05, ** - при p<0,01, *** - при p<0,001
Таблица 5
Уровень спонтанных и стимулированных лимфоцитарных и моноцитарных ИЛ-1β
у больных ЮИА при длительности заболевания от одного года до трех лет (пкг/мл)
Кол-во
Лимфоциты Лимфоциты
б о л ь - ИЛ-1β
ИЛ-1β
ных
спон.
стим.
Диагноз
Олигоартрит
персистирующий
10
Олигоартрит
распространяющийся
10
Полиартрит
10
Моноциты
ИЛ-1β
спон.
Моноциты
ИЛ-1β
стим.
835,6±2,4
525,9±2,1
815,1 ±0,4
631,3±0,2
727,5±2,2
624,6±2,9
713,6±1,5
499,9±0,4
527,4±1,4
414,6±2,2
511,8±1,3
389,9±1,8
Таблица 6
Уровень спонтанных и стимулированных лимфоцитарных и моноцитарных ИЛ-1β
у больных ЮИА при длительности заболевания более трех лет (пкг/мл)
Диагноз
Лимфоциты Лимфоциты Моноциты
Кол-во
ИЛ-1β
ИЛ-1β
ИЛ-1β
больных
спон.
стим.
спон.
Олигоартрит
персистирующий
10
432,6±3,2
336,9±2,8
538,0 ±2,8
328,3±1,5
Олигоартрит
распространяющийся
10
388,5±3,1
399,2±2,6
405,3±0,4
288,8±1,4
Полиартрит
10
354,4±2,2
283,3±2,8
308,4±1,8
255,6±2,6
критериев для своевременного распознавания заболевания. Для ЮИА характерно:
− высокий уровень провоспалительного
цитокина в сыворотке крови ФНО-α может
быть использовано для ранней диагностики
ювенильного идиопатического артрита;
− четко выражена закономерность снижения уровня ИЛ-1β в сыворотке крови при
олигоартрите персистирующем при увеличении длительности заболевания;
− при полиартрите и олигоартрите распространяющемся уровень ИЛ-1β в сыворотке крови стойко повышен при давности
заболевания более трех лет;
Моноциты
ИЛ-1β
стим.
− повышение уровня ФНО-α в сыворотке
крови прямо зависит от степени активности воспалительного процесса, количества
пораженных суставов и длительности заболевания;
− стойкое снижение уровня ИЛ-4 в сыворотке крови может свидетельствовать
о снижении её противовоспалительной
активности.
− уровень спонтанных и стимулированных лимфоцитарных и моноцитарных
ИЛ-1β на ранних этапах ЮИА был высоким
и соответствовал степени и тяжести заболевания. При длительности заболевания более одного года уровень внутриклеточных
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 5-6, 2011
29
ÀÊÓØÅÐÑÒÂÎ. ÃÈÍÅÊÎËÎÃÈß. ÏÅÄÈÀÒÐÈß
интерлейкинов снижался и не отвечал адекватным образом на стимуляцию, что можно
расценивать как хронизацию процесса и
неблагоприятное течение заболевания.
Заключение
1.Значение цитокинов является определяющим в индуктивной фазе иммунного
ответа, когда они обусловливают развитие
базовых реакций макрофагальных и антигенспецифических клеток: взаимодействие
этих клеток с лимфоцитами, активацию и
пролиферацию последних, в определенной
степени — формирование клеток-эффекторов. На поздних этапах иммунного ответа,
в период реализации эффекторных иммунологических функций роль цитокинов
становится менее значительной.
2.Дисбаланс между гиперпродукцией
провоспалительных цитокинов преимущественно макрофагальной природы,
таких как ФНО-α, ИЛ-1,ИЛ-6 и антивоспалительных цитокинов ИЛ-4 , с преобладанием
продукции первых над вторыми индуцирует хронический воспалительный процесс.
30
3.Уровень спонтанных и стимулированных лимфоцитарных и моноцитарных
ИЛ-1 отражает активность патологического процесса и может использоваться в
прогнозировании исходов ювенильного
идиопатического артритов.
Примечания:
1. Алексеева Е.И., Шахбазян И.Е. Принципы
патогенетической терапии тяжелых системных
вариантов ювенильного ревматоидного артрита. // Серия. Аутоиммунные болезни. – Москва.
2002-223с.
2. Баранов А.А., Алексеева Е.И., Шувалова М.П.,
Сырцова Л.Е. Проблемы ревматических болезней
у детей в Российской Федерации. Росс. Педиатр.
Журнал. 2003 - № 5, С.4 – 10.
3. Кельцев В.А. Ювенильный идиопатический
артрит . – Самара, 2005. -214 с.
4. Кельцев В.А. Клиническая артрология. - Самара, 2010 – 612 с.
5. Кузьмина Н.Н., Воронцов И.М., Никишина И.Н., Салугина С.О. Эволюция взглядов на
терминологию и классификацию ювенильных
хронических артритов // Научно-практическая
ревматология – 2008.- №1. – С. 41-45.
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë