модЕлИроВаНИЕ молЕКулярНых мЕхаНИЗмоВ фагоцИТоЗа

2. Бондаренко В. М., Мацулевич Т. В. Дисбактериоз кишечника
как клинико–лабораторный синдром: современное состояние проблемы: Руководство для врачей. – М.: ГЭОТАР–Медиа, 2007.
3. Кулиев И. Б. Значимость эубиотиков в комплексном лечении болезни Гиршпрунга / И. Б. Кулиев, Р. Ш. Полухов, Л. О. Зейниев // Российский вестник детской хирургии, анестезиологии,
реаниматологии. – 2011. – Приложение. – С. 52.
4. Митрохин С. Д. Дисбактериоз: современный взгляд на проблему / Гастроэнтерология. – 2000. – Т. 2. № 5. – С. 7–15.
5. Шендеров Б. А. Функциональное питание и пробиотики: микроэкологические аспекты / Б. А. Шендеров, М. А. Манвелова. –
М.: Медицина, 1997.
6. Шумов Н. Д. Характеристика микрофлоры толстой кишки у детей с болезнью Гиршпрунга / Н. Д. Шумов, В. Э. Зыкин,
В. В. Шапкин, Н. А. Синицына // Клиническая хирургия. –1986. –
№ 6. – С. 26–27.
Поступила 15.02.2013
О. А. Терещенко, В. И. Сергиенко, Э. А. Петросян
Кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии
ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: superego_ksmu@mail.ru
В опытах in vitro изучали редокс-потенциал неорганических и органических сред, подвергнутых воздействию различных
концентраций натрия гипохлорита. В ходе исследования при добавлении натрия гипохлорита происходило увеличение редокс-потенциала изучаемых сред, что свидетельствует о повышении резистентности организма относительно сапрофитных
анаэробов. При исследовании хемилюминесценции нейтрофилов после воздействия на них различных концентраций натрия
гипохлорита было отмечено, что 0,03%-ный раствор вызывает наиболее интенсивную вспышку хемилюминесценции, которая к 18-й мин достигает своих максимальных значений, в то время как при использовании 0,06%-ного раствора происходит
тушение хемилюминесценции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что стимуляция нейтрофилов низкими концентрациями натрия гипохлорита способствует максимальному выбросу активных форм кислорода, инициируя пероксидацию биологических мембран, которая и определяет антимикробный эффект нейтрофильных лейкоцитов.
Ключевые слова: нейтрофильные лейкоциты, натрия гипохлорит, редокс-потенциал, хемилюминесценция, абдоминальная инфекция.
O. A. Teresсhenko, V. I. Sergienko, E. A. Petrosyan
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (139) 2013
Моделирование молекулярных механизмов фагоцитоза
НЕЙТРОФИЛОВ НА ПРИНЦИПАХ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОКИСЛЕНИЯ
В БОРЬБЕ С АБДОМИНАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
SIMULATING the molecular mechanisms OF neutrophils phagocytosis
ON PRINCIPLES OF electrochemical oxidation IN FIGHTING WITH ABDOMINAL INFECTION
Chair of operative surgery and topographical anatomy Kuban state medical university,
Russia, 350063, Krasnodar, Sedin str., 4. E-mail: superego_ksmu@mail.ru
Key words: neutrophils, sodium hypochlorite, redox potential, chemiluminescence, abdominal infection.
Введение
Увеличение числа больных с инфекционно-септическими заболеваниями в абдоминальной хирургии
обусловливают поиски объективных критериев характера течения, эффективности лечения и прогноза заболевания [17]. Важнейшим условием генерализации
абдоминальной инфекции является функциональная
недостаточность защитных систем организма [7]. В этом
отношении значительный интерес представляют нейтрофильные лейкоциты (НЛ), ответственные за одну из сторон иммунной защиты – фагоцитоз. Охарактеризованный
в свое время как «первая линия обороны» врожденный
иммунитет формирует системную воспалительную реакцию [2, 8], при стимуляции которой происходит метаболический взрыв с участием «миелопероксидазно-Н2О2хлоридной системы» и продуцированием супероксидного
УДК 616.381-002-092.9:612.015.1:612.112
In in vitro experiments examined the redox potential of the inorganic and organic media, which were exposed to different
concentrations of sodium hypochlorite. In the study, adding sodium hypochlorite followed by an increase of redox potential of
the studied media, that indicates an increase in resistance of the body relative to the saprophytic anaerobes. In the study of the
chemiluminescence of neutrophils after exposure to different concentrations of sodium hypochlorite, it was noted that the 0,03%
solution causes the most intense flash of chemiluminescence, which at 18 minutes reaches its maximum value, at the time, as using
0,06% solution chemiluminescence is fading. The results indicate that stimulation of neutrophils with low concentrations of sodium
hypochlorite promotes the maximum release of reactive oxygen species, triggering peroxidation of biological membranes, which
determines the primary mechanism of phagocytosis of bacterial cells.
99
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (139) 2013
анион-радикала (O2-), перекиси водорода (H2O2), гидроксильного радикала (ОН-), синглетного кислорода (iO2),
хлорно-ватистой кислоты (НОС1), оксида азота (NO) [12,
13, 21, 24, 25] с последующим индуцированием процессов ПОЛ, которые вносят заметный дисбаланс в про- и
антиоксидантную систему организма [4, 14].
Согласно исследованиям [26] при образовании HOCl
редокс-потенциал (Eh) в зоне воспаления достигает
+1000 мВ, что значительно выше обычного Eh в биологических средах (+820 мВ) [18]. При этом наиболее чувствительными микроорганизмами к изменениям Eh среды
являются анаэробы, которые теряют способность размножаться при +300 мB, а при повышении Eh до +650 мB
происходит полное угнетение работы ферментных систем
микроорганизмов. Падение же Eh ниже +120 мB позволяет
анаэробам проникать в ткани и быстро размножаться, учитывая, что здоровые ткани имеют Eh в диапазоне от +120
до +150 мB [23]. Все это свидетельствует о том, что Eh
среды является одним из факторов, определяющих рост и
биохимическую активность микроорганизмов.
До сих пор в литературе отсутствуют объяснения
механизма, по которому протекает стадия инициирования НОС1/ОС1‑индуцированного ПОЛ [5, 6, 10, 11,
15, 19, 20]. Поэтому изучение биологического действия
НОС1/ОС1, образующегося в нейтрофильных лейкоцитах, интересно в трех аспектах: во-первых, различные
клетки крови оказывают влияние друг на друга путем
выброса в окружающую среду стимулирующих или
ингибирующих соединений; во-вторых, механизм действия НОС1/ОС1 – на другие клетки мало изучен, и, втретьих, электролизный раствор натрия гипохлорита
(НГХ) широко используется в клинической практике как
антимикробное и детоксицирующее средство.
Поэтому не вызывает сомнений актуальность поиска простых электрохимических систем, позволяющих
создавать процессы окисления, близкие по своей эффективности и селективности ферментативным, которые можно использовать самостоятельно, а также в
комплексе с другими лечебными мероприятиями.
Цель исследования – на принципах электрохимического окисления с использованием электролизного раствора
НГХ смоделировать молекулярные механизмы фагоцитоза НЛ для успешной борьбы с абдоминальной инфекцией.
Методика исследований
100
Для выполнения поставленной цели экспериментальные исследования проведены на беспородных
собаках-самцах до (n=48) и после создания модели
24-часового экспериментального желчного перитонита,
осложненного абдоминальным сепсисом (n=44) [3, 16].
Для успешного лечения абдоминальной инфекции
как при местном, так и при общем применении электролизного раствора НГХ проведено сравнительное
изучение его Eh в условиях неорганической среды
(0,9%-ный раствор хлорида натрия) и органических сред
(интактная плазма, плазма крови и перитонеальная
жидкость животных с 24-часовым экспериментальным
желчным перитонитом, осложненным абдоминальным
сепсисом). Исследования выполнены на автоматическом комплексе «Najada» (Чехия) с использованием
платинового электрода и каломельного электрода сравнения. НГХ получали путём электролиза 0,9%-ного раствора натрия хлорида в аппарате «Электрохимический
детоксикатор организма» (ЭДО-4) в автоматическом
режиме. Концентрацию раствора определяли методом
йодометрического титрования на автотитраторе ТТТ-2
(«Radiometer», Дания) с использованием йодселективного электрода.
Для изучения хемилюминесценции (ХЛ) НЛ использовалась венозная кровь интактных и опытных
животных, содержащая гепарин (10 ед/мл) и желатин
(0,1%-ный раствор), которая инкубировалась в течение 60 мин. Супернатант смеси наслаивали на градиент фиколл-верографин с удельной плотностью 1,078 и
центрифугировали в течение 15 мин при 500 g. Осадок
трижды промывали раствором Хенкса при центрифугировании в течение 5 мин при 200 g. Следы эритроцитов удалялись после первой промывки с помощью осмотического шока в дистиллированной воде в течение
10 с. Выделенные НЛ суспендировали в растворе Хенкса (Х), после чего определяли их жизнеспособность раствором трипанового синего [1]. 0,1 мл НЛ в количестве
5х105 кл/мл вносили в кювету и туда же для стимуляции
клеток добавляли 40 мкл сульфата бария (20 мг/мл).
Объем суспензии доводили до 1 мл раствором Хенкса
(рН 7,4). В работе использовали 0,03, 0,04 и 0,06%-ные
растворы НГХ. После этого изучали ХЛ НЛ на введение
различных концентраций НГХ. Измерения проводили
при 37°С. Каждую пробу повторяли не менее 10 раз,
учитывая после этого средний результат. ХЛ НЛ регистрировали на хемилюминометре LKB «Wаllaс-1251»
(Финляндия). Сигнал записывали, а затем обрабатывали на персональном компьютере. Экспериментальные
исследования на животных выполняли, руководствуясь
основными принципами, заложенными в Хельсинкской
декларации Всемирной медицинской ассоциации от
1964 года. Результаты исследований обработаны с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Exel» и
«Statistica 6,0» для Windows «StatSoft.Inc».
Результаты исследования и их обсуждение
Согласно исследованиям [22] высвобождаемая НЛ
«миелопероксидазно-Н2О2-хлоридная система» считается одним из факторов, объясняющих вспышку ХЛ,
что и послужило основанием для изучения ХЛ НЛ интактных животных, подвергнутых воздействию НГХ.
С этой целью предварительно в условиях in vitro
была изучена жизнеспособность НЛ под действием
различных концентраций НГХ. Результаты проведенных опытов показали, что при обработке НЛ в растворе
Хенкса 0,03%-ным раствором НГХ наблюдается гибель
от 6,5% до 8,5% клеток, при обработке 0,04%-ным раствором НГХ наступает гибель от 12,5% до 20% клеток.
Увеличение же концентрации НГХ до 0,06%-ного раствора сопровождается гибелью 39–45% НЛ.
В ходе исследования на фоне стимуляции НЛ сульфатом бария при добавлении различных концентраций НГХ по данным кинетики ХЛ были получены следующие результаты. Так, при добавлении в кювету
0,03%-ного раствора НГХ сразу же после предварительной стимуляции НЛ суспензией сульфата бария отмечался рост интенсивности хемилюминесценции НЛ, который
к 18-й минуте достигал своих максимальных значений:
138±14,9 против 24,8±2,6 мВ в исходном состоянии
(р<0,001) (рисунок). Обнаруженная вспышка ХЛ НЛ, повидимому, является результатом повышения фагоцитарной активности лейкоцитов. Подобная точка зрения находит подтверждение в работе [9], где авторами показано,
что введение 1,0 мкМ НГХ в суспензию лейкоцитов увеличивает фагоцитарную активность лейкоцитов на 27% с
одновременным приростом содержания малонового диальдегида в НЛ на 15%, а при повышении концентрации
Сравнительная оценка влияния НГХ на редокс-потенциал исследуемых сред
Разведение
сред
Исходная
величина Eh
среды, мB
Концентрация
натрия
гипохлорита,
мкг/мл
–
+ 420
300
Плазма
1:10
+ 350
300
Плазма
1:10
+ 350
100
Плазма
Цельная
+ 315
400
1:10
+ 305
300
1:10
+ 305
100
Цельный
+ 270
600
Изучаемые среды
0,9%-ный раствор
хлорида натрия
Перитонеальный
экссудат
Перитонеальный
экссудат
Перитонеальный
экссудат
Максимальная
величина Eh
среды, мВ
Абсолютная
величина Eh
среды, мВ
+ 950
р<0,05
+ 604
р<0,05
+ 410
p>0,05
+ 465
p>0,05
+ 630
р<0,05
+ 400
p>0,05
+ 495
р<0,05
+ 530
+ 154
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (139) 2013
Зависимость амплитуды хемилюминесцентного ответа нейтрофилов
от концентрации натрия гипохлорита. По оси абсцисс – время, мин;
по оси ординат – интенсивность хемилюминесценции (I мВ).
1 – ХЛ (Х+НЛ+0,06%-ный раствор НГХ+BaSO4); 2 – ХЛ (Х+НЛ); 3 – ХЛ (Х+НЛ+BaSO4);
4 – ХЛ (Х+НЛ+0,04%-ный раствор НГХ+BaSO4);
5 – ХЛ (Х+НЛ+0,03%-ный раствор НГХ+BaSO4)
+ 60
+ 150
+ 325
+ 95
+ 225
Примечание: p<0,05 – достоверность отличий от показателей исходной величины Eh среды.
НГХ до 20 мкМ фагоцитарная активность лейкоцитов снижается по сравнению с контролем на 23%. При обработке
же НЛ 0,04%-ным раствором НГХ отмечалось снижение
интенсивности ХЛ до 71,3±8,% мВ, т. е. на 51,5% по сравнению с амплитудой предыдущей кривой. Применение
же 0,06%-ного раствора НГХ сопровождалось тушением
ХЛ НЛ, которое находит свое подтверждение в высоком
проценте гибели НЛ при данной концентрации.
Полученные результаты свидетельствуют о том,
что до реакции фагоцитоза (поглощения лиганда)
нейтрофильные лейкоциты образуют так называемые «внеклеточные ловушки», которые появляются
в результате выброса нейтрофильными лейкоцитами декондисированного хроматина и нуклеиновых
кислот, тесно ассоциированных с антимикробными
белками цитоплазматических гранул миелопероксидазы, которые опосредованно через продукцию
активных форм кислорода инициируют процессы
ПОЛ, манифестирующиеся в реакции хемилюминесценции.
Для подтверждения вышепредставленного механизма в работе был изучен редок-потенциал (Eh) неорганической и органической сред после добавления в
них различных концентраций НГХ.
101
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (139) 2013
102
Так, в ходе исследования при добавлении различных концентраций НГХ в неорганическую и органические среды в них происходило увеличение редокспотенциала. При этом рост абсолютной величины
редокс-потенциала в неорганической среде значительно превышал редокс-потенциал в органических средах
(таблица). Полученные результаты свидетельствуют о
том, что используемые концентрации НГХ способствуют повышению абсолютной величины редокс-потенциала как в разведенной, так и в неразведенной плазме и
перитонеальном экссудате соответственно (таблица).
Обнаруженный рост редокс-потенциала в исследуемых средах после добавления в них электролизного раствора натрия гипохлорита способствует повышению резистентности организма по отношению к
возбудителям абдоминальной инфекции, и в первую
очередь сапрофитным анаэробам, препятствуя их проникновению и размножению.
Таким образом, нейтрализация или замена положительных зарядов в зоне воспаления на отрицательные с применением электролизного раствора натрия
гипохлорита является патогенетически оправданным
способом борьбы с абдоминальной инфекцией, которая обеспечивает прочную защиту организма от проникновения и размножения в тканях микроорганизмов
(в первую очередь анаэробов).
Заключение
Полученные данные по изучению молекулярных механизмов фагоцитоза нейтрофильных лейкоцитов на
принципах электрохимического окисления в борьбе с абдоминальной инфекцией открывают новые возможности
для разработки патогенетически обоснованных методов
коррекции клеточных механизмов естественной резистентности организма при различных гнойно-воспалительных
и септических процессах в хирургической практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адамс Р. Методы исследования культуры клеток для биохимиков: Пер. с англ. – М.: Мир, 1983. – С. 56–57.
2. Барковский Е. В., Кубарко А. И., Кухта В. К., Олецкий Э. И.
Общие принципы регуляции клеточных функций сигнальными молекулами // Здравоохранение. – 1998. – № 10. – С. 28–34.
3. Боташев А. А., Терещенко О. А., Петросян Э. А. Состояние бактериальной экосистемы тонкой кишки у животных с экспериментальным желчным перитонитом // Вестник интенсивной
терапии. – 2012. – № 5. – С. 5–7.
4. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты //
Вестник РАМН. – 1998. – № 7. – С. 43–51.
5. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В., Измайлов Д. Ю.
Хемилюминесценция как метод обнаружения и исследования
свободных радикалов в биологических системах // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144. № 3. –
С. 390–396.
6. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Усп. биол. химии. – 2009. –
Т. 49. – С. 341–388.
7. Ерюхин И. А., Белый В. Я., Вагнер В. К. Воспаление как
общебиологическая реакция: на модели острого перитонита. – Л.:
Наука, 1989. – 262 с.
8. Земсков A. M., Земсков В. М., Коротких И. Н. и др. Иммунные расстройства и их коррекция при гнойно–воспалительных
процессах. – М.: Триада-Х, 2007. – 160 с.
9. Зверева М. Д., Мурина М. А., Трунилина Н. Н., Сергиенко В. И., Рощупкин Д. И. Стимуляция гипохлоритом натрия
фагоцитарной активности лейкоцитов // В кн.: Эндогенные интоксикации: Тез. докл., – СПб, 1994. – С. 138.
10. Измайлов Д. Ю., Владимиров Ю. А. Математическое моделирование кинетики цепного окисления липидов и хемилюминесценции в присутствии Fe2+. 1. Основная модель // Биол. мембраны. – 2002. – № 6. – С. 507–515.
11. Измайлов Д. Ю., Владимиров Ю. А. Математическое моделирование кинетики цепного окисления липидов и хемилюминесценции в присутствии Fe2+. 2. Действие антиоксидантов // Биол.
мембраны. – 2003. – № 4. – С. 349–358.
12. Маянский А. Н. Фагоцитоз: проблемы и перспективы //
Вестник РАМН. – 1999. – № 4. – С. 3–8.
13. Меньшикова Е. Б., Зенков Н. К., Сафина А. Ф. Механизмы
развития окислительного стресса при ишемическом и реперфузинном повреждении миокарда // Усп. современной биологии. –
1997. – Т. 117. Вып. 9. – С. 362–373.
14. Панасенко О. М., Евгина С. А., Дремина Е. С., Шаров В. С.,
Сергиенко В. И., Владимиров Ю. А. Роль Fe2+ в перекисном окислении липидов липосомальных мембран, инициированном гипохлоритом натрия // Биологические мембраны. – 1995. – № 2. – С. 191–199.
15. Панасенко О. М., Чеканов А. В., Арнхольд Ю., Сергиенко В. И., Осипов А. Н., Владимиров Ю. А. Образование свободных радикалов при распаде гидропероксида в присутствии миелопероксидазы или активированных нейтрофилов // Биохимия. –
2005. – № 9. – С. 1209–1217.
16. Петросян Э. А. и др., Способ моделирования желчного перитонита. Патент РФ № 2175784 от 10. 11. 2001. Бюл. 2001, № 31.
17. Савельев B. C., Гельфанд Б. Р. Абдоминальная хирургическая инфекция: клиника, диагностика, антимикробная терапия:
Практическое руководство / Под ред. B. C. Савельева, Б. Р. Гельфанда – М.: изд-во «Литтерра», 2006. – 166 с.
18. Сент-Дьерди А. Биоэлектроника. – М.: Медицина, 1971. –
102 с.
19. Чеканов А. В., Панасенко О. М., Осипов А. Н., Арнхольд Ю.,
Казаринов К. Д., Владимиров Ю. А., Сергиенко В. И. Взаимодействие трет-бутилгидропероксида с гипохлоритом приводит к образованию перекисных радикалов. Исследование методом хемилюминесценции // Биофизика. – 2002. – № 5. – С. 787–794.
20. Чеканов А. В., Осипов А. Н., Владимиров Ю. А., Сергиенко
В. И., Панасенко О. М. Сравнительное исследование взаимодействия бромноватистой и хлорноватистой кислот с трет-бутилгидропероксидом методом спиновых ловушек // Биофизика. – 2007. –
Т. 52. № 1. – С. 5–13.
21. Шаронов Б. П., Чурилова И. В. Окислительная модификация и инактивация супероксиддисмутазы гипохлоритом // Биохимия. – 1992. – № 5. – С. 719–727.
22. Dahlgren C., Stendahl O. Role of myeloperoxidase in luminol–
dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes //
Infect. immun. – 1983. – Vol. 39. № 2. – P. 736–741.
23. Finegold S. M. Susceptibility testing of anaerobic bacteria //
Journal of clinical microbiology. – 1988. – Vol. 26. № 7. –
P. 1253–1256.
24. Panasenko O. M., Arnhold J. Linoleic acid hydroperoxide
favours hypochlorite – and myeloperoxidase–induced lipid peroxidation // Free radic. res. – 1999. – Vol. 30. – P. 479–487.
25. Pero R. W., Sheng Y., Olsson A. Hypochlorous acid.
N-chloramines are naturally produced DNA repair inhibitors text. //
Carcinogenesis. – 1996. – Vol. 17. – P. 13–18.
26. Stelmaszynska T., Zgliczynski J. M. N-(2-oxoacyl)amino
acids and nitriles as final products of dipeptide chiorination mediated
by the myeloperoxidase-H2O2-Cl-system // Eur. biochem. – 1978. –
Vol. 92. – P. 301–308.
Поступила 10.01.2012