Особенности эпидемиологии и лабораторной диагностики легионеллезной инфекции. Тартаковский И.С. ФНИЦ эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф.Гамалеи Минздрава России Основные этиологические агенты и инфекционные заболевания, выявленные после 1977 г. Год Агент Болезнь 1977 Ebola virus Лихорадка Эбола 1977 Legionella pneumophila Болезнь легионеров 1977 Hantaar virus Гемморагическая лихорадка с почечным синдромом 1977 Campilobacter sp. Кишечная инфекция 1982 Escherichia coli O157 Геморрагический колит 1982 Borrelia burgdorferi Болезнь Лайма 1983 Helicobacter pylori Язвенная болезнь 1983 Human immunodeficiency virus ВИЧ-инфекция 1989 Hepatitis C virus Гепатит С 1991 Ehrlichia chaffensis Эрлихиоз человека 1991 Guanarito virus Венесуэльская геморрагическая лихорадка 1993 Hantavirus Ксантовирусный легочный синдром 1993 Bartonella henselae Болезнь кошачьих царапин 1994 Human herpes virus-8 Саркома Капоши 1995 Erlichia phagocytophilia Эрлихиоз человека с гранулоцитозом 1995 Equine morbillivirus Тяжелое респираторное заболевание 1996 Australian lyssavirus Бешенство человека 1997 H5N1 influenza virus Новый штамм вируса гриппа человека 1999 Nipah virus Энцефалит, респираторное заболевание 2003 SARS associated coronavirus Тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) 2004 Bird flu Птичий грипп Период 1979 – 1990 гг. – возбудитель рассматривался как особо опасный микроорганизм. Основными направлениями исследования являлись: - дифференциальная диагностика с другими особо опасными инфекциями , для которых характерна легочная патология (туляремия, лихорадка Ку и др.); - выделение и характеристика факторов патогенности возбудителя; - разработка экспериментальных моделей инфекций и вакцинных препаратов. Период 1990 – 2000 гг. – - легионелла - широко распространенный водный микроорганизм, при определенных обстоятельствах способный вызывать эпидемические вспышки и спорадические случаи тяжелых пневмоний с высоким процентом летальных исходов. -стандартизация методов лабораторной диагностики привела к повышению качества и быстроты диагностики, увеличению числа выявляемых эпидемических вспышек и спорадических заболеваний: -легионеллёз – инфекция контролируемая ВОЗ и Европейской рабочей группой по легионеллёзу. Легионеллы и окружающая среда Научно-методические и организационные задачи 2004-2007гг 1. Перевод легионелл из II-ой группы патогенности в III –ю группу. 2. Разработка и внедрение методики выявления Legionella pneumophila в объектах окружающей среды (мониторинг возбудителя). 3. Внедрение методов диагностики легионеллеза, соответствующих международным стандартам (мониторинг заболеваемости). 4. Создание в России эффективной системы диагностики, лечения и профилактики легионеллеза в соответствии с рекомендациями ВОЗ . Verhnaya Pyshma town - 5 km from Ekaterinburg – capital of Ural region. Size of population Verhnaya Pyshma - 70 000. Ekaterinburg - 2 mln. Ural region - 10 mln. Verhnaya Pyshma -industrial center – metallurgical (cupriferous) plant- UGMK 30 Распределение больных с инфекциями дыхательных путей по датам заболевания, обращения и госпитализации (абс.числа) Поступление информации в Управление Роспотребнадзора о росте заболеваемости пневмонией 25 20 15 10 5 0 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 -5 Дата заболевания Дата обращения Дата госпитализации 26 - го июля 2007г. - Eкатеринбург Были исключены: -Глобальные вирусные респираторные инфекции – САРС, птичий грипп и др. -Возбудители особоопасных инфекций, поражающие легкие – Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Coxiella burnetti и др. -Опасность биотерроризма 27 - го июля 2007г. - Eкатеринбург Streptococcus pneumonia или «экзотический» микроорганизм Legionella pneumophila ? 24 пациента - IgM антитела к L. pneumophila sg1, EIA test Vircell, Spain. Предполагаемый диагноз – легионеллез ? 28-го июля– Moсква 8 образцов мочи больных из реанимации пациенты больницы г.Верхняя Пышма НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи 2 образца патматериала легких из больницы г.Верхняя Пышма Институт эпидемиологии, Moсква ПЦР Иммунохроматографический тест для выявления антигена легионелл в моче ( - Binax и SAS иммунохроматографические тест-системы) 2 положительных образца 7 положительных образцов в обоих тест-системах. Окончательное подтверждение легионеллезной этиологии вспышки. Результаты диагностических тестов. Вспышка– 4-го августа 2007. Патматериал, легкие , выделена культура L.pneumophila sg.1 Иммунохроматографический тест и ИФА тест для выявления антигена легионелл в моче ( Binax, Biotest, SAS ) ПЦР патматериала, легкие ПЦР мокроты IgM антитела (EIAtest, Vircell, Испания) НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 1 г. Москва 64 2 2 ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва 31 г. Екатеринбург Распределение больных с инфекциями дыхательных путей и легионеллезом по датам заболевания (абс.чис.) 30 25 20 Ремонтные работы на СУГРЭС 15 10 5 0 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Инфекции дых.путей Легионеллез Уроки эпидемической вспышки легионеллеза в Верхней Пышме: 1. 2. 3. Легионеллез – актуальная проблема для Российской Федерации Программа стандартизации системы контроля и профилактики легионеллеза в России активно внедряется. Какова взаимосвязь между официально рекомендованной температурой горячей воды 60 С -75 С и колонизацией системы горячего водоснабжения легионеллами ? Задачи последних лет (2011-2014гг.): 1. Показать, что легионелла практически столь же распространенный водный микроорганизм как синегнойная палочка. 2. Сделать диагностику легионеллеза доступной для любой бактериологической лаборатории ЛПУ. Основные факторы, способствующие достижения эпидемически опасных концентраций легионелл в водных экосистемах: Температура воды в диапазоне от 25° С до 46° С; Размножение в водных простейших (амебы); Образование биопленок на внутренней поверхности труб, шлангов, соединительных узлов систем водоснабжения и охлаждения воздуха. 3 ОСНОВНЫЕ ТИПА ПОТЕНЦИАЛЬНО ОПАСНЫХ ВОДНЫХ СИСТЕМ: - ВОДНАЯ СИСТЕМА ОХЛАЖДЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ ПРЕДПРИЯТИЙ И ОБЩЕСТВЕННЫХ ЗДАНИЙ - СИСТЕМА ГОРЯЧЕГО ВОДОСНАБЖЕНИЯ (при температуре воды менее 60 С) - БАССЕЙНЫ И ВАННЫ С ЦИРКУЛИРУЮЩЕЙ ПОД ДАВЛЕНИЕМ ВОДОЙ (ТИПА ДЖАКУЗИ) Водная система охлаждения воздуха рециркуляторного типа. Срез Warmwass трубы erversorgu горячего водосна ng бжения in einem S ol l > 55 Krankenha us Образец трубы госпиталя “DEAD LEG” – резервуар легионелл в системе горячего водоснабжения. Dead Leg Изучение контаминации легионеллами потенциально опасных водных объектов и разработка комплекса профилактических мероприятий.(2011-2013гг.) 1.Анализ контаминации легионеллами градирен промышленных предприятий (Московская область). 2. Анализ контаминации легионеллами сети горячего водоснабжения общественных зданий в том числе ЛПУ ( Москва). Градирня, г. Москва. Градирня промышленного предприятия Уровень контаминации Legionella pneumophila градирен промышленных предприятий. Объект Количество Концентрация L.pneumophila градирен (КОЕ/л) присутствие присутствие биопленок, Ps.aeruginosa минимальная максимальная содержащих L.pneumophila 6,0 х102 2,4 х103 + + 1. 4 2. 2 1,2 х102 8,4 х102 _ _ 3. 2 1,2 х102 1,5 х102 _ + 4. 6 8,4 х102 3,6 х103 + + 5. 2 1,2 х104 9,6 х104 + + Распределение серотипов среди штаммов L.pneumophila, выделенных из градирен. 13% Sg 1 7% 40% Sg 6 Sg 3 14% Sg 2 другие 26% грибы грибы Биопленка бактерии а б в Смешанная бактериально-грибковая биопленка градирни. Ув. 15 000 SE1 Ув. 5000x Бактерии на поверхности диатомовых водорослей Adhesion of bacteria on the surface of diatomic algaes. Температура горячей воды в системе централизованного горячего водоснабжения в СССР и России: 60 -75 С СанПин 2.1.4.2496-09 , изменения к СанПин 2.14.1074-01 Реальная температура (наши собственные исследования – 2008-2010гг.) : В централизованной системе горячего водоснабжения : 60 -75 С ? Во всех современных системах горячего водоснабжения: (котельные и нагреватели современных торговых и бизнесцентров, гостиниц, больниц , построенных за последние 10-15 лет): 55 С -56 С Уровень контаминации Legionella pneumophila систем горячего водоснабжения ЛПУ. Объект Концентрация L.pneumophila (КОЕ/л) Температура горячей воды (C O) Количество Присутствие участков в воде Ps.aeruginosa системы водоснабжения минималь- максималь максималь минималь объекта, контаминирова ная ная ная ная нных L.pneumophila 1. 1,2 х102 8,4 х103 56 42 2 + 2. 8,5 х102 3,6 х105 60 36 1 - 3. 2 х103 8,4 х104 60 45 1 + 4. 6 х102 1,2 х105 54 42 3 + 5. 8 х10 2 х102 60 44 1 - 6. 4 х10 1,2 х102 56 45 1 - 7. 1,2 х102 6 х102 58 44 1 + Распределение серотипов среди штаммов L.pneumophila, выделенных из системы горячего водоснабжения. Sg 6 20% 38% Sg 5 Sg 3 12% Sg 1 13% другие 17% Наиболее распространенные микроорганизмы в системе водоснабжения ЛПУ г.Москвы в ассоциации с легионеллами. •Ps.aeruginosa •Pseudomonas spp. •Acinetobacter lwoffii •Acinetobacter spp. •Brevibacterium vesicularis •Micrococcus luteus Бактериологическое исследование воды на наличие легионелл в 14-этажном здании нейрохирургического госпиталя. Показатели Количество легионелл (КОЕ\литр) ПЦР - РВ 1.микробиологической лаборатории, 14 этаж 2,8 х 103 – 6,4х105 1,1х105 – 5,1х105 2.нейрореанимация, интенсивная терапия, 10 этаж 9,9 х 103 - 5 х 105 6х105 – 4,2х107 9 х 103 6х104 не обнаружено 2,2х102 Материал для исследования 3.отделение детской нейрохирургии, 5 этаж 4. бойлерная, горячая вода Адгезия и формирование микроколоний (1сут.): кокки ↑, палочки ↑↑ на фильтре Pall в системе водоснабжения ЛПУ. Биопленка на фильтре Pall (14 сутки), образованы номады на поверхности, система водоснабжения ЛПУ. Биопленка на фильтре Pall в системе водоснабжения ЛПУ (21 суток) Многопрофильная клиника г.Москвы А. (обследовано 5 корпусов) Ожоговое отделение Новое отделение трансплантологии (без пациентов) ангиография Отделение трансплантологии Отделение психосоматики Плановый оперблок (реанимация-анестезия) Максимальные концентрации Legionella pneumophila в системе водоснабжения многопрофильной клиники А. Ожоговое отделение Отделение трансплантации печени Новое отделение Отделение психосоматики Отделение ангиографии Плановый оперблок 1,2х105 3,6х104 1,2х102 1,1х104 2,4х102 1,6х104 Многопрофильная клиника г. Москвы Б (обследовано 6 корпусов). Отделение нейрохирургии Оперблок Оперблок, травматологияя Оперблок (ремонт) Отделение гематологии Отделение урологии Отделение пульмонологии Инфекционное отделение Максимальные концентрации Legionella pneumophila в системе водоснабжения многопрофильной клиники Б г.Москвы Отделение нейрохирургии, оперблок 1,2х102 Оперблок, травматология; оперблок (ремонт) 3,6х104 Урогинекологическое отделение 6х103 Пульмонологическое отделение 0 Отделение гематологии 0 Инфекционное отделение 4,9х104 Легионеллезная инфекция ( по характеру приобретения): Внебольничная пневмония Внутрибольничная пневмония Рекомендуемая терапия болезни легионеров (P.H.Edelstein, 2002) тяжелая пневмония, требующая госпитализации или на фоне нарушения иммунитета Антибиотик 1 выбора Доза Антибиотик 2 выбора Доза Азитромицин 500 мг ежедневно 5-7 дней Ципрофлоксацин 750 мг каждые 12 часов 14 дней Левофлоксацин 500 мг ежедневно 10-14 дней Эритромицин 750-1000 мг каждые 6 часов 21 день + Рифампицин 600 мг каждые 12 часов 5 дней Эпидемические вспышки легионеллеза последних лет Год Страна 1999 1999 2000 2001 2002 2002 2003 Голландия Бельгия Австралия Норвегия Испания Англия Морской круиз”Ocean Monarch” Франция Норвегия Канада Россия, Верхняя Пышма Хорватия, чемпионат по гандболу Германия, Ульм Испания, Мадрид Испания, Валенсия 2003-04 2005 2005 2007 2009 2010 2010 2012 Количествово заболевших (умерших) 242(25) 93 (5) 98 (8) 28 (9) 470 (9) 179 (7 ) 9 (2) 86 (17) 55(10) 112(23) более 90(4) 30 65(5) 49(9) 41 (9) Нозокомиальные эпидемические вспышки легионеллёза, связанные с контаминацией легионеллами систем водоснабжения ЛПУ. год город, страна число случаев (% летальных исходов) 1977-80 Лос-Анжелес, США 220 (42%) 1977-78 Ноттингем, Великобритания 122 (22%) 1979-81 Питтсбург, 135 (26%) 1977-79 Нарволк, США 34 (38%) 1982-83 Париж, Франция 47 (18%) 1985 Стаффорд, Великобритания 101 (28%) Отделения больниц, в которых имели место эпидемические вспышки и групповые случаи легионеллёза в в 21 веке. № п/п отделение больницы 1. трансплантации сердца 2. трансплантации почки 3. интенсивная терапия 4. интенсивная терапия 5. нейрохирургия 7. сердечно-сосудистая патология трансплантации 8. трансплантации 9. интенсивная терапия 6. Подтверждённый водный источник инфекции водопроводный кран и душ душ и аппарат для приготовления льда водопроводный кран и душ аппарат для приготовления льда питьевая вода водопроводный кран и душ водопроводный кран и душ водопроводный кран и душ водопроводный кран и душ страна, регион США, (Аризона) Бельгия США, (Коннектикут) США, (Нью-Йорк) Германия Италия Испания США, (Нью-Йорк) Израиль CAP-spectrum of causative pathogens Lit. Höffkenet al. Chemotherapie-Journal 2008; 14 mild moderate severe S. pneumoniae 38 (30-49) 27 (15-48) 28 (20-31) M. pneumoniae 8 (ng –13) 5 (2-9) 2 (0 –3) H. influenzae 13 (4-22) 6 (0 –7) 7 (0 –10) C. pneumoniae 21 (0-32) 11 (0-17) 4 (0-7) S. aureus 2 (0-2) 3 (0-4) 9 (0-22) Enterobacteriaceae 0 4 (1-8) 9 (2-18) P. aeruginosa 1 3 (0-4) 4 (0-5) L. pneumophila 0 4 (0-8) 12 (0-23) Polymicrobial infection up to 27%, unknown aup to 50% Figure 11.1 Method of diagnosis of travel-associated Legionnaires' disease in Europe and year of onset of disease . Быстрые иммунохроматографические тесты для выявления антигена легионелл в моче Kyokuto SAS/Eiken Trinity Binax New German quidelines S3 Community-acquired pneumonia German Society for Pneumology , 2011 Serology and antigen testing •No recommendation –M. pneumoniae serology –C. pneumoniae serology –For all amplification assays –Pneumococcal antigen test (to be revisited) –Procalcitonin i.S. (to be revisited) •Recommendation for antigen testing –Legionella antigen-test in urine (2c) В США число ежегодно регистрируемых случаев легионеллеза с 2000 по 2010 г. выросло на 217 %. 2000 г. 1100 случаев 2009 г. 3522 случаев Зарегистрированные в 2010 г. случаи острого гепатита В и легионеллеза. Острый гепатит В Легионеллез США 3374 3346 Российская Федерация ≈ 2500 38 ??? Стандарт специализированной медицинской помощи при пневмонии тяжелой степени тяжести с осложнениями (приложение к приказу Минздрава России от 29.01.2013г. № 741 н) A26.09.010 Бактериологическое исследование мокроты на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы A26.09.012 Бактериологическое исследование плевральной жидкости на аэробные и факультативноанаэробные микроорганизмы A26.28.010 Определение антигена возбудителя легионеллеза (Legionella pneumophila) в моче A26.30.004 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и другим лекарственным препаратам Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний. Методические указания МУК 4.2.3115 - 13 Издание официальное Нужен был конкретный пример возможности эффективной диагностики легионеллеза в конкретном ЛПУ: трансплантология ? онкология? гематология ? Диагностику легионеллеза осуществляли у 82 пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии Гематологического научного центра с января 2011 по декабрь 2014 года. Больные с пневмонией(100%), в состоянии агранулоцитоза (40%), лимфома, лейкоз, миелома (70%). Для диагностики использовали бактериологическое исследование бронхоальвеолярного лаважа и определение антигена легионелл в моче пациентов иммунохроматографическим методом. БАЛ, содержащий альвеолярные макрофаги Моча Обработка кислотным буфером (0,4М HCl 0,4M KCl рН 2,2) 1:1 (0,2 мл+0,2 мл) в течение 4 мин Посев на буферный угольнодрожжевой агар (BMPAα)(0,2мл) Рост культуры Legionella spp. на 3 - 5 сутки Идентификация с помощью латексного теста и моноклональных антител Иммунохроматографический тест на антиген L.pn. sg1 Получение результата в течение 30 мин. Рис. На рентгенограмме грудной клетки больного К. 13.02.2012 нижние отделы правого легочного поля затемнены, сверху затемнение отграничено малой междолевой щелью. Легочный рисунок усилен, деформирован. На этом фоне определяются очаговые тени, частично сливающиеся между собой. Корни легких не дифференцируются. Синусы не визуализируются. Тень сердца расширена влево. Картина двусторонней очагово-сливной плевропневмонии. Рис. Компьютерная томография органов грудной клетки больного К. 13.02.2012. Нижние доли обоих легких консолидированы субтотально, консолидация распространяется на S4 и S5 с обеих сторон (справа - в значительно большей степени). В остальных отделах обоих легких, преимущественно вблизи зон консолидации, отмечаются распространённые инфильтративно-мелкоочаговые изменения. Диагноз легионеллезной инфекции был подтвержден у 9 больных (10,5% случаев) при исследовании БАЛ бактериологическим методом. Впервые прижизненно Legionella pneumophila серогруппы 3 (5). выделены культуры серогруппы 1 (3), The characteristics of the patients Patient № Age Sex Hemathological diagnosis Isolated culture of L.pneumophila from bronchoalveolar fluid Another pathogen, isolated from bronchoalveolar fluid outcome 1 58 M Drug agranulocytos sg 1 A.baumanii recover 2 34 M Immune trombocytophenie sg 3 - death 3 52 F Non-Hodgkins lymphoma sg 3 P.juroveci death 4 32 M Acute leukaemie sg 3 Aspergillus spp. death 5 64 M Multiple myeloma sg 3 - death 6 55 M Multiple myeloma sg 1 - recover 7 83 M Non-Hodgkins lymphoma sg 1 - recover 8 81 M Non-Hodgkins lymphoma sg 3 - recover Результаты микробиологического исследования образцов воды и смывов на наличие легионелл в ФГБУ Гематологический научный центр. Проба воды для исследования Количество легионелл (КОЕ\литр) 1. Отделение гематологии 6 х102 2. Отделение реанимации 3 х102 3. Отделение трансплантологии 6,2 х103 4. Отделение гемодиализа 2,7 х103 5. Новое отделение (высокодозная химиотерапия лимфом) 6. Проба воды из бойлерной 5,5 х104 1,1 х105 от больных : 3 штамма L.pneumophila sg 1 5 штаммов L.pneumophila sg3 В системе водоснабжения ЛПУ циркулируют штаммы L.pneumophila sg 2 и sg 3 EWGLI (European Working Group for Legionella Infections) Штамм GICL 39: Pyshma-199-5, GICL 47: Pyshma-19, GICL 49: Pyshma-22, GICL 51: Pyshma-26, GICL 46: Pyshma-18, GICL 76: Pyshma 34 GICL 37: Pyshma-5 GICL 50: Pyshma-24 ST Серогруппа Источник 7 1 Окружающая среда 320 1 Окружающая среда 1 Окружающая среда 51- Клинический материал, 15- Окружающая среда, 2- Не известен 521 Источник аналогичных штаммов 79 - Клинический материал, 96 - Окружающая среда, 8 - Не известен GICL 63: TOTAL-16 59 1 Окружающая среда 20- Клинический материал (11Внутрибольничные), 14-Окружающая среда, 1- Не известен GICL 33: Pyshma-1 308 1 Клинический материал 17- Клинический материал GICL 68: Tver-123.30 522 2-14 Окружающая среда 12- Клинический материал GICL 41: Pyshma-12, GICL 52: Pyshma-27, GICL 86: Pyshma-45, GICL 88: Pyshma-47, GICL 71: Pyshma-29, GICL 78: Pyshma-36, GICL 82: Pyshma-40 324 1 Окружающая среда 5-Клинический материал, 2-Окружающая среда Результаты типирования изолятов L.pneumophila серогруппы 1 и 3, выделенных из БАЛ пациентов и воды системы горячего водоснабжения Гематологического центра. № Наименование Серогруппа Подгруппа ST 1. Hem 1 1 France/ Allentown 42 2. Hem 4 1 Philadelphia 36 3. Hem 5 1 Benidorm 1489 4. Hem 2 3 - 87 5. Hem 3 3 - 87 6. Hem 6 3 - 87 7. Hem 7 3 - 87 8. Hemenvir 1 3 - 87 Заключение. - В Гематологическом центре Минздрава России легионеллезная этиология подтверждена у 10,5% больных пневмониями. - Впервые в России получена коллекция клинических штаммов легионелл от больных с заболеваниями системы крови . - Применение мультилокусного секвенирования позволило подтвердить идентичность изолятов легионелл (SТ87) , выделенных от больных и циркулирующих в системе горячего водоснабжения Центра.