особенности использования рекомбинантных белков в

ОСОБЕННОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ
Владыко А.С., Счесленок Е.П., Фомина Е.Г.
НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава РБ, Минск, vladyko@briem.ac.by
На стадии разработки новых иммунобиологических диагностических препаратов
критическими реагентами, входящими в состав тест-системы, являются антитела (АТ)
и антигены (АГ). Немаловажным является также изучение механизмов взаимодействия
и формирования комплексов АГ-АТ.
Современные поколения иммунобиологических диагностических препаратов
основаны на последних достижениях в области генной инженерии и пептидной
технологии. Для выявления АГ и АТ широко используются моноклональные антитела
(МКА), рекомбинантные и синтетические пептиды.
Относительно использования моноклональных антител в диагностических тестсистемах и механизмов формирования АГ-АТ комплексов при разработке данных тестсистем нами было установлено, что не все моноклональные антитела, полученные к
нативным вирусным белкам, рекомбинантным и синтетическим пептидам обладают
нужной авидностью, аффинитетом и, что самое главное, что требовалось от них, специфичностью. Оказалось, отдельные клоны МКА, полученные к вирусу Ласса,
специфически реагируют в твердофазном иммуноферментном анализе (ТФИФА) и
иммуноблоттинге с вирусами Марбург и ВИЧ-1. На основании этого, а также с учетом
данных литературы был сделан вывод, что отдельные В-эпитопы могут быть
представлены у разных представителей биологических видов, включая вирусы,
бактерии, паразиты и даже гельминты. Более того, по данным литературы оказалось,
что формирование аневризмы аорты у человека связано с появлением в стенке сосудов
белка, аналогичного структурному белку VP-40 у вируса Эбола.
На основании этого было сделано заключение, что не все МКА, а следовательно
синтетические и рекомбинантные пептиды могут быть использованы в
иммунобиологических диагностических тест-системах. Более того, дизайн пептидов, с
учетом экспонирования нужных антигенных детерминант, а также конформационноактивные и конформационно-зависимые В-эпитопы в составе получаемых белков
существенно влияют на специфичность диагностического набора. Последнее
обстоятельство было неоднократно подтверждено при разработке диагностической
иммуноферментной тест-системы, предназначенной для выявления антигена вируса
Ласса. Оказалось, что как отдельные МКА сами по себе, так и в комплексе с C1q
фактором комплемента существенно изменяют специфичность и чувствительность
диагностикумов.
В последнее время в мировой практике в диагностические тест-системы стали
включаться нанотехнологии, предполагающие, наряду с включением в набор
микроколичеств реагентов и образцов проб, сокращение сроков постановки реакции до
нескольких минут за счет резкого увеличения чувствительности метода. Однако как
оказалось здесь открываются сразу две проблемы. Наиболее простая касается
регистрации результата для получения высокой чувствительности. Как правило, в этом
случае предлагается дорогостоящее оборудование. Это в свою очередь, предполагает
переоснащение всей диагностической службы в рамках страны. Поэтому, при решении
вопроса о возможности включения нанотехнологий в диагностическую практику часто
встает проблема их целесообразности из-за дороговизны. Однако если наиболее
36
ответственные
диагностические
исследования
проводить
в
крупных
специализированных центрах, то эта проблема может быть разрешена положительно.
Сложнее обстоит дело при разрешении проблемы самой чувствительности.
Теоретически нанотехнологии с использованием соответствующей системы
регистрации результата позволяют выявлять единичные образцы (молекулы) антигенов
или антител. Однако на практике это возможно только при условии обеспечения
высокой специфичности реакции АГ-АТ. Суть проблемы между чувствительностью и
специфичностью заключается в том, что это два взаимообостряющие друг друга
показателя. В данном случае не решив задачу по специфичности нельзя решать задачу
повышения чувствительности. В противном случае увеличивается количество
ложноположительных реакций, что в свою очередь, может привести к отрицанию
целого направления в диагностике.
В своих исследованиях проблему специфичности реакции антиген-антитело мы
пытаемся решить, с одной стороны, за счет использования моноклональных или
моноспецифических антител, а с другой, получением
низкомолекулярных
рекомбинантных пептидов, включающих
строго определенную антигенную
детерминанту со строго определенными свойствами и характеристиками,
позволяющими избегать ложноположительные или неспецифические реакции.
Отличия использования низкомолекулярных рекомбинантных пептидов от
высокомолекулярных состоят в следующем:
Во-первых, если иметь в виду использование рекомбинантных белков в
иммуноферментном анализе для выявления антител, то число сорбируемых в лунку
молекул у низкомолекулярного пептида будет выше, чем у высокомолекулярного, что в
свою очередь уже повышает чувствительность метода;
Во-вторых, низкомолекулярные рекомбинантные пептиды максимально
исключают из своего состава аминокислотные последовательности, дающие
неспецифические (ложноположительные или ложноотрицательные) реакции;
В-третьих, небольшие участки полинуклеотидов, кодирующих антигенные
детерминанты, можно синтезировать искусственно, что не потребует вирусной или
бактериальной матрицы для получения копии ДНК-фрагмента при создании
экспрессирующего вектора;
В-четвертых, данная технология позволяет целенаправленно оптимизировать
дизайн получаемых рекомбинантных антигенов.
Данные положения неоднократно были подтверждены в наших исследованиях
при разработке диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных
для выявления антител к вирусам ГЛПС, гепатита С и лимфоцитарного
хориоменингита.
Литература
1. Владыко А.С., Быстрова С.И., Лемешко Н.Н., Лкеашевич И.С. // Характеристика
моноклональных антител к нуклеопротеиду вируса Ласса. – Мол.генет.микробиол.вирусол. – 1987.- №5.С.37-40.
2. Владыко А.С., Куницкая Л.Я., Быстрова С.И. и др.//Получение и характеристика
рекомбинантных моноклональных антител к вирусу Ласса. – Вопр.вирусол. – 1990.- №5.- С.396-398
3. Владыко А.С., Куницкая Л.Я., Красько А.Г. и др.//Рекомбинантные моноклональные антитела к
вирусу Ласса: формирование реактивных паратопов.- Вопр.вирусмол.- 1990.- №6.- С.488-492
4. Владыко А.С., Быстрова С.И., Малахова И.В. и др.//Локализация и предварительная
характеристика антигенных сайтов (В-эпитопов) в белке нуклеокапсида вируса Ласса.- Вопр.вирусол.1993.-№1.-С.30-34
5. Владыко А.С., Зайцева В.Н., Трофимов Н.М. и др.//Ложно-положительные реакции пери
лбораторной диагностике опасных вирусных геморрагических лихорадок Ласса, Марбург Эюола и
СПИДА.- Вопр.вирусол.-1997.- №2.-С.66-70.
37