CL.DIFFICILE ОПАСНОСТЬ, КОТОРАЯ ВСЕГДА РЯДОМ Шуляк Б.Ф., научный отдел компании «ГЕМ» (Москва) Появление «новой» бактерии 1935 г. - Hall I.C., и O'Toole E. обнаружили ее у грудного ребенка в США. Сейчас ее находят у 25-70% новорожденных. К 12-18 мес. число инфицированных детей снижается до 5%, сохраняясь на этом уровне у взрослых. У пожилых людей инцидентность инфекции возрастает. Основные причины «скромного» поведения Cl.d. 1. Отсутствие или низкий уровень экспрессии токсинов у многих штаммов. Этот ребенок хорошо себя ведет, потому, что находится под присмотром. Так же поступает и Cl.d. 2. Контроль размножения Cl.d. другими компонентами микрофлоры кишечника и факторами иммунитета. Мишень для антибиотиков - не только патогенные бактерии Антибиотики – одно из основных средств борьбы с патогенными бактериями, но их частое применение порождает немало проблем. o Одна из них – дисбактериоз, при котором у Cl.d. появляется возможность колонизировать толстую кишку. o Анализ микрофлоры кишечника, проведенный чешскими специалистами (Škraban J. et al. , 2012), показал что основным фактором, сдерживающим колонизацию 027 риботипа Cl.d. является Bifidobacterium longum, вариабельно значимым энтерококки . Cl.d. – продуцент токсинов, повреждение которыми эпителия кишечника ведет к функциональным и патоморфологическим изменениям кишечника. Опасны все антибиотики, но в разной мере Колонизацию кишечника Cl.d могут вызвать практически все антибиотики, но чаще – беталактамы, фторхинолоны, клиндамицин Чем длительнее курс антибиотикотерапии, тем выше риск. Последствия воздействия АМП: - дисбактериоз - изменение свойств Cl.d. Цефалоспорины Фторхинолоны Аминогликозиды Макролиды и линкомицин Другие Пенициллины Клиническое значение Cl.d. За последние 30 лет Cl.d. стал основным возбудителем диареи госпитализированных пациентов (20-30%). Токсический мегаколон. Антибиотико-ассоциированный и псевдомембранозный колит (с высокой летальностью). Некротическая перфорация толстой кишки. Прогностические маркеры Факторы повышенного риска летального исхода Возраст (> 70 лет) Концентрация лейкоцитов >20 x109/л Сывороточный креатинин >133 мкМоль/л Сывороточный альбумин (±) <24,5 г/л С-реактивный протеин >220 мг/л Низкий пик титра IgG-антител к токсину А на 12-й день болезни Эпидемические особенности Фекально-оральный путь заражения Инцидентность инфекции у взрослого населения 4-5% - вне ЛПУ 20–50% - у госпитализированных пациентов (пропорционально сроку пребывания в ЛПУ) Причины Регулярное поступление в стационары носителей токсигенных штаммов Cl.d. Длительное сохранение спор Cl.d. в ЛПУ Ятрогенные (зонды, термометры и пр.) Микрофлора кишечника и антитела предотвращают развитие симптоматики у 60% людей, инфицированных токсигенными штаммами. Отличия гипервирулентных от обычных токсигенных штаммов Cl.d.: - Индукцией симптомов у детей - Способностью быстро распространяться в ЛПУ и за их пределами - Высокими уровнями заболеваемости и смертности (особенно пациентов старше 65 лет) Животные – потенциальный источник инфекции Имеются сообщения об выделении риботипов 010, 014/020, 039, 045, SLO 066. Большинство изолятов нетоксигенны. Инцидентность – 3-25%. В первые 2 нед инфицировано 25-100% поросят. С возрастом инцидентность снижается. В Сев. Америке и Европе превалирует РТ 078. Генетическое сходство с мед. изолятами Инфицировано от 1 до 60% цыплят. С возрастом инцидентность снижается. Широкое разнообразие риботипов, но нет 078 и 027. Инфицировано от 1 до 50% телят. Зависимость инцидентности от возраста и времени года. 027 превалирует (в Канаде-до 70%, в США-94%). Встречаются 012, 014, 017, имеющие мед. значение 027 и 078 обнаруживали в мясе в Сев. Америке –42%, в Европе ≈ 3% (отдельные скрининговые исследования Из выделяемых от животных и продуктов их убоя штаммов Cl.d. Наибольший зооантропонозный потенциал имеют секвенстипы ST-1 и 11 Факторы патогенности Cl.d. Основные факторы патогенности Cl.d. - токсины: Экзотокин А - гликозилтрансфераза, самый крупный из известных бактериальных протеинов (308 кД). Цитотоксин B – гликозилтрансфераза, меньше по размеру (269 кД), но в 1000 раз токсичнее экзотоксина А. Бинарный CDT (аналог йота-токсина Cl.perfringens и Cl.spiroforme, проявл. АДФ-рибозилтрансферазную акт-ть) Нестабильный энтеротоксин Актинспецифическая АДФ-рибозил-трансфераза Образование токсинов А и В регулируют: -TcdR (+) - TcdC (-) -- SigD - недавно открытый в Ин-те Пастера (Франция) регулятор жгутиковых Аг (+). У различающихся по его наличию шт. Cl.d. выявили различия 103 генов, в т.ч. TcdR и TcdC. Подвижность - перитрихиальные жгутики. Защита: полисахаридная капсула, S-слой, субтерминальные споры Адгезивные факторы (в т.ч. токсин CDT) Образование биопленки (шт. R20291) Классификация штаммов Cl.d. по токсигенности Токсины А и В наиболее изучены и играют основную роль в патогенезе синдромов, вызываемых Cl.d.. 1. Непатогенные или слабопатогенные (не образуют токсины А-В-/ А+В- / ↓А+↓В+ А и В, образуют их в небольшом количестве, образуют только токсин А. А+В+/ А-В+ 2. Вирулентные - образуют оба токсина (85-90% шт.) или только токсин В (4-11% шт.; тенденция ↑). А±↑B+ CDT ± 3. Гипервирулентные (например, штаммы риботипов 027, O17 и 078), образующие больше A/B и других токсинов. Классификация Cl. d. по токсигенности Фенотипы (7) А+ B+ CDT(прототип почти всех минорных и части мажорных ВТТ) А+ B+ CDT+ (прототип большинства мажорных ВТТ) A- B+ CDTA- B+ CDT+ A+ B- CDT+ А- В- CDT+ А- B- CDT- Вариантные токсинотипы (31) 0 Минорные I,II.XII, XVIII, XIX, XX Мажорный XXI Мажорные типы III,IV, V,VI, VII, IX, XIV, XV, XXII, XXIII Минорный тип XXIV VIII Некоторые О-подобные штаммы Х, XVI, XVII, некоторые 0- и V-подобные шт. IX-подобные XIa, XIb Штаммы без локуса Pa Штаммы без локусов CDT и Pa Схематично, чем насыщеннее цвет ячеек, тем наибольшее клиническое значение имеют штаммы с таким фенотипом. Но из этого правила немало исключений за счет наличия вариантных токсинотипов - групп штаммов с идентичными изменениями (включениями, делециями и точечными мутациями) участков B1 и A3 локуса Pa, циркулирующие на определенной территории в определенный период времени. Гипервирулентные штаммы 1985 г. – идентификация 1-го гипервирулентного варианта во Франции (на 1 г позднее в Великобритании). Причина появления - широкое применение ципрофлоксацина. 2003 г. - 2 крупные вспышки в Бельгии (смертность-12%). 2005 г. - 50 вспышек в Бельгии, затем во Франции, Германиюи Люксембурге, Швейцарии, Дании, Австрии , Финляндии и Польше. NAP1/BI/027 рестриктазо-эндонуклеазный анализ – BI пульс-гель электрофорез - NAP1 (North American PFGE type 1) ПЦР – риботип 027. Признаки гипервирулентности Интенсивное образование токсинов А (>16 раз) и В (>23 раза) из-за делеций негативных регуляторов 2/3 штаммов синтезируют бинарный токсин CDT = тропизм к большему типу клеток Интенсивное и ускоренное образование спор Высокая подвижность Резистентность к эритромицину (мутация генов ДНК-гиразы) и фторхинолонам. Быстрое распространение = внутрибольничные (67%) + внебольничные (37%) инфекции Инцидентность заболевания подростков до 17 лет возросла (> 2 раза) Способен поражать людей, не принимавших АМП Рост смертности пожилых людей (> 2 раз) и рецидивы Несмотря на все вышеизложенное – возможность бессимптомного носительства Эпидемическая ситуация в Европе Обследованы госпитали 32 стран Европы (Europ. Clostridium Inf. Survey (ECDIS), 2008-2009) = выявлено 65 ПЦРриботипов Cl.d., из которых превалируют 014/020; 001 и 078. (потенциальный источник – свиньи) Риботип 027 вызывает около 5% случаев госпитальных инфекций (ранее до 18%) В Британии чаще встречается риботип 106, в Нидерландах 078 (источник – свиньи, по вирулентности близок 027, часто вызывает внебольничные инф. у детей). Радоваться рано: di Bella S. et al (2012) – 56% госпитальных штаммов, выделенных в Италии = 027). Растет инцидентность инфекции риботипа 078 Эпидемическая ситуация в Сев. Америке 2003 г – первые вспышки 027 в 7 провинциях Канады 2004-2007 гг. - охватил 40 штатов США (рост заболеваемости в 5 раз, летальности – в целом в 3-4 раза (22%), у пожилых пациентов в 8 раз. Риботип 078 широко распространен среди свиней и КРС (в Канаде 83– 94%) и в последние годы его выявляют в этой стране у 13-14% госпитализированных пациентов с Сl.d.-ассоциированными Ситуация в других странах В 2009 г. риботип 027 обнаружили в Корее, Гон-Конге и Австралии. Однако, здесь он не вызвал больших госпитальных вспышек. В 2012 г. зарегистрировали первый случай в Латинской Америке (смерть 1,5-летнего ребенка) от инфекции этого. риботипа. В Иране на долю риботипа 078 приходится 25% госпитальных штаммов Cl.d. В России - ? Схема диагностики Показания для лабораторной диагностики Диарея (≥3 актов дефекации в день) Диарея > 2 дн (после исключения инфекций других энтеропатогенов) Все госпитализированные пациенты с диареей > 72 ч (независимо от общего клинического состояния) внезапное начало диареи; водянистая консистенция и гнилостный запах фекалий спорадически скрытая кровь (но не мелена) боли в нижнем квадранте живота (22 %); лихорадка (28 %); лейкоцитоз (50 %) и гипоальбуминемия на ранних стадиях болезни Примечание. У пациентов с параличом подвздошной кишки и получающих обезболивающие средства после абдоминальных операций диарея и боли могут отсутствовать. Лабораторные методы диагностики Cl.d. – анаэроб, его токсины термолабильны оптимальный срок исследования = ≤ 2 ч после дефекации при отсутствии такой возможности:4…8°С не более 2-3 дн 1. Выделение и идентификация возбудителя на питательных средах 2. Цитотоксический тест (золотой стандарт) 3. Иммунологические методы диагностики (обнаружение глютамат дегидрогеназы, токсинов А и В) 4. Молекулярно-генетическая диагностика Отбор проб для исследований - фекалии (только жидкие; при скрининге – только от людей старше 50 лет, содеражащие большое кол-во лейкоцитов) Исключение пациенты с илеусом, у которых не бывает диареи Дополнительные критерии: - Данные анамнеза и предшествующем лечении АМП - При скрининге - первые 3 дня пребывания в ЛПУ, при диагностике госпитальной инфекции – свыше 3 дню - В случае прогрессирования болезни – повторный отбор фекалий Изоляция возбудителя Серо-желтые, S/R, негемолитические, слегка приподнятые, круглые (d=2-5 мм) с выростами колонии Обработка (30 мин/tкомн) этанолом (1:1) = споры устойчивы Анаэробное культивирование: Обогатительные среды (объекты внешней среды) Неселективные или селективные среды (с аминогликозидами/полимиксином/ циклосерином, например, циклосерин-цефокситин-фруктозный агар) применяют для посева клин. материала и пересева с обогатительных сред. Замена фруктозы маннитом повышает высеваемость Cl.d. Желчь, таурохолят и лизоцим ускоряют вегетацию спор. Агар с витамином К и кровяной агар = желто-зеленая флюоресценция Агар с р-гидроксифенилуксусной к-той = запах крезола Среды с яичным желтком (дифференциация от лецитиназо+ и липазо+ C. bifermentans, C. perfringens и C. sordelli) Хромогенные среды (CHROMagar™C.difficile, BD; СhromID™ C. difficile agar , Био-Мере) Недостатки метода (из-за которых он перестает быть рутинным) Нет различий в росте токсигенных и нетоксигенных штаммов. Вариабельность чувствительности (в зависимости от среды) Необходимость создания анаэробных условий) Медленный рост (48-72 ч., на хромогенных – 24-48 ч). Общая затрата времени на выделение и идентифи токсигенных шт. = 3-7 дн. Большие затраты труда Оценка подвижности Фактор Sigma D позитивно регулирует экспрессию жгутиков и еще более 100 генов, (в т.ч. ответственных за токсинообразование), обусловливая корреляцию между токсичностью и токсинообразованием. Тест по определению подвижности может служить дополнительным фенотипическим способом оценки вирулентности штаммов Cl.d. Методика 1. Флаконы (V=30 мл) с 0,05% сердечно-мозговым агаром выдерживают 4 ч в анаэробных условиях. 2. Переносят колонию Cl.d. на S среды. 3. Инкубируют ночь в анаэробных ус-ях. 4. Измеряют расстояние, прошедшее бактериями. Тест проводят с контролями (подвижный и неподвижный шт. Cl.d.) Цитотоксический метод Интактная культура клето Положительный рез-т - округление не менее 10% фибробластов монослоя (при тестировании суспензии фекалий, пропущенной через миллипоровский фильтр (в других модификациях теста эта цифра может достигать 40…60%). Чувствительность данного метода диагностики инфекции достигает 90% (ее порог в отношении токсина B составляет 1 пкг). РН с фильтратом фекалий и моноклональными антителами самый чувствительный и специфичный метод диагностики Недостатки метода: - VERO выявляет токсин В в концентрации 1 пкг/мл Токсич. действие Сl.d. (чувствительность ≤ 90%), линия HT29 – наиболее чувствительная к токсину А. - Не стандартизирован - Возможно получение «ложно +» результатов - Нужны культуры клеток и все, чем пользуются для их выращивания, боксы, специалисты 24…48 ч (без учета времени на подготовку культуры клеток; за рубежом доступны готовые замороженные культуры клеток) - Токсич. действие Сl.sordelii -- Большие затраты труда Молекулярные методы диагностики ДНК-зондирование - обнаружение генома возбудителя в отпечатке колоний ПЦР – высоко чувствительный метод выявления генов токсинов. Изотермическая амплификация – с 2011 г. японская компания выпускает набора реагентов для диагностики инфекции Cl.d. методом LAMP. На анализ экстрагированной нуклеиновой к-ты уходит всего 1 ч. Не позволяет выявлять A-B+ штаммы. Назначение: идентификация Cl.d. на видовом и внутривидовом (риботипном) уровнях, обнаружение генов токсинов. Мишени: - 16s рРНК - гены токсинов Недостатки Гены, регулирующие синтез токсинов Cl.d., весьма изменчивы, что затрудняет подбор к ним праймеров. При рутинном проведении не дает представления о функциональном состоянии генов и их регуляторов Стоимость 1 экспертизы в 2-3 раза выше, чем проводимой другими методами Иммунологические методы РЛА, ИФА и ИХТ Позволяют выявлять токсины А и В, глютамат дегидрогеназу (специфический поверхностный белок, синтезируемый всеми штаммами Cl.d.). ИФА: 15% ложноположительных+ 15% ложноотрицательных результатов. Уровень детекции токсинов = 100-1000 пкг Vidas (Био-Мерье) = ИФА колоний - чувствительность (в сравнении с селективными средами) = 62%, специфичность =6094% (в зависимости от интенсивности токсинообразования) Американское об-во микробиологов в 2010 г рекомендовало больше не применять ИФА ИХТ и РЛА просты в проведении, не требуют аппаратуры, дают быстрый ответ, могут быть использованы в полевых условиях РЛА: низкая чувствительность, перекрестные реакции с C.bifermentans/sordellii and C. glycolicum. ИХТ: аналитическая чувствительность – 4-5 нг/мл, высокие специфичность и чувствительность Проблемы, возникающие при проведении ИХТ 1. 2. 3. 4. 5. 6. Замораживание-размораживание и хранение проб при высокой температуре или >2 ч - причины ложно «-» результатов. Сложно дозировать пробу, вносимую в пробирку с эсктрагирующим раствором. При недостаточном отстаивании фекалии могут забивать поры тест-полоски. Для лабораторий альтернатива – центрифугирование (500-1000 об/мин 5-10 мин.) Вариабельная чувствительность и специфичность разных тест-систем: отрицательный результат требует проверки другими методами. Наличие в фекалиях большого количества крови – причина ложноположительных результатов. Цвет контрольной и тестовой полосы может становиться зеленым вместо розового при исследовании темных или зеленых фекалий (последствие применения фумарата Fe). Каким методы диагностики предпочтительнее? Метод Цитологический, в т.ч. РН Глютамат-дегидрогеназные ИФА ИХТ РЛА Молекулярно-генетические Чувствительность, % 67-86 71-100 31-62 60-75 45-50 77-100 Специфичность, % 84-100 75-98 60-94 92-95 90-92 93-100 Нельзя «слепо» доверять ни одному из применяемых в настоящее время методов диагноcтики инфекции Cl.d. Их показания следует сопоставлять между собой и с данными анамнеза Иммунологические тесты (особенно ИХТ) предоставляют наиболее значимую диагностическую информацию. Предпочтительнее пользоваться тестами, позволяющими одновременно определять несколько параметров (токсины А и В). Оптимальная схема лабораторной диагностики В ИХТ выявляют глютамат-дегидрогеназу (экспрессируется всеми штаммами Cl.d. И в большем чем токсины количестве) Синергизм действия токсинов А и В – целесообразность выявления в ИХТ обоих токсинов. Альтернатива – токсин В (как наиболее значимый). Выпускаемы тестсистемы на токсин А – анахронизм. Ни 1 иммунологический тест не позволяет выявлять всех инфицированных токсигенными шт Cl.d. Пациентов. Заключительный этап – РН в культуре клеток или ПЦР с пробами, давшими отрицательный рез-т в ИХТ. Профилактика Рациональное применение антибиотиков Мытье рук бактерицидным мылом (но не спиртсодержащими средствами) Дезинфекция объектов внешней среды, одежды и пр. хлорсодержащими и др. спороцидами. Тщательное мытье посуды, стерилизация зондов, термометров и пр.). Скрининг бессимтомных носителей (пациентов и персонала) Изолированное содержание инфицированных токсигенными штаммами Cl.d. пациентов стационаров. Смена перчаток, бахил и халатов при посещении персоналом разных палат Мониторинг объектов внешней среды (посев смывов на селективный бульон с тиогликолятом, АТФ-биолюминисценция, флюоресцентная проба с тербием). Лечение 1. 2. 3. Прекращение применения антибиотиков, спровоцировавших диарею или псевдомембранозный колит. Симптоматическое лечение. Восстановление нормальной микрофлоры кишечника (не найдено эффективных пробиотиков; терапия фекалиями здоровых людей) При хроническом и рецидивирующем течение – антибиотикотерия: - Ванкомицин (125 мг 4 раза вдень /метронидазол (500 мг 3 раза в день) 10-14 дневный курс При рецидивах курс ванкомицина = по 125 мг/кг 6-нед. с увел. интервалом (6 ч и 12 ч = по 1 нед, 1 день = 2 нед, 3 дня = 2 нед). Альтернативные средства: бтейкопланин/даптомицин, бацитрацин. Рифаксимин (дерват рифамицин а) 1. Лечебные бактериофаги (в РФ не выпускаются) 2. Бактерицины (Турицин CD, Ирландия) 3. Хирургическое лечение (при перфорации кишечника , колонэктомия при ПМК) БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ! Компания ООО «ГЕМ» приглашает принять участие в микробиологической секции, посвященной питательным средам и рассмотрению проекта Стандартизированной технологии по их внутрилабораторному контролю (3 октября 2013 г. в г. Москва, ВЦ «Олимпийский») На нашем сайте www.hemltd.ru можно оформить бесплатную подписку на журнал «Лаборатория». Присылайте в него свои статьи и заметки для публикации в нем по адресу statya@hemltd.ru