011715 - 1 - Настоящее изобретение относится к липосомным
реклама
011715 Настоящее изобретение относится к липосомным препаратам, и в частности к липосомам для применения в комбинированной терапии альфа-излучающими эндорадиоактивными изотопами. Лечение гиперпластических или неопластических заболеваний, таких как раковые заболевания, часто требует введения цитотоксических агентов для того, чтобы избирательно устранять клетки и популяции клеток, проявляющие неконтролируемые или нежелательные картины роста. В случае локализованных неоплазм, таких как твердые опухоли, для удаления основной массы нежелательных клеток можно использовать хирургию, но все в большей степени этот способ используют в комбинации с местным, региональным и/или системным цитотоксическим лечением для того, чтобы минимизировать как риск рецидива, так и количество подвергаемой резекции ткани. В случае рассредоточенных неопластических заболеваний, таких как метастатические раковые заболевания, хирургию обычно нельзя использовать в качестве единственного способа лечения, и главным компонентом терапевтической схемы лечения обычно будут региональные или системные цитотоксические агенты. Следовательно, существует значительная насущная необходимость в новых и улучшенных цитотоксических системах, в частности, для лечения неопластического заболевания. В течение многих лет в радиоактивных фармацевтических агентах для лечения рака использовали бета-излучающие радиоактивные изотопы в качестве цитотоксических агентов. В последние годы, однако, также предпринимали попытки по использованию альфа-излучателей в противоопухолевых агентах. Альфа-излучатели имеют несколько свойств, которые отличают их от бета-излучателей и потенциально обеспечивают повышенную эффективность в терапии. Эти свойства включают их более высокие энергии и более короткие пробеги в тканях. Пробег излучения типичных альфа-излучателей в физиологическом окружении обычно составляет менее 100 мкм, что является эквивалентом только нескольких диаметров клеток. Это делает данные источники хорошо подходящими для лечения опухолей, включая микрометастазы, благодаря тому, что малое количество излучаемой энергии будет проходить за пределы клеток-мишеней и, таким образом, повреждение окружающей здоровой ткани может быть минимизировано. Напротив, бета-частица имеет пробег в воде 1 мм или более. Энергия излучения альфа-частиц также является высокой по сравнению с бета-частицами, гаммалучами и рентгеновскими лучами, обычно составляя 5-8 МэВ, или в 5-10 раз больше энергии бета-частицы и в 20 или более раз больше энергии гамма-луча. Таким образом, такое накопление большого количества энергии на очень коротком расстоянии придает альфа-излучению исключительно высокий линейный перенос энергии (LET) по сравнению с гамма- или бета-излучением. Это объясняет исключительную цитотоксичность альфа-излучающих радиоактивных изотопов и также налагает строгие требования на уровень контроля и исследования распределения радиоактивных изотопов, необходимый для того, чтобы избежать неприемлемых побочных эффектов. Другим фактором, который делает определенные альфа-излучающие радиоактивные изотопы как весьма подходящими в качестве цитотоксических агентов, так и высокоперспективными в качестве агентов для точного нацеливания in vivo, являются свойства их дочерних изотопов. В частности, многие альфа-излучающие радиоактивные изотопы образуют часть цепочки распадов из нескольких альфа- и/или бета-превращений между исходным изотопом и стабильным дочерним изотопом. Когда любой дочерний изотоп также представляет собой альфа-излучатель, этот изотоп также должен быть нацеливаемым и контролируемым для того, чтобы он не вызывал нежелательных токсичных эффектов при накоплении в здоровой ткани. К сожалению, как физические, так и химические факторы делают достижение такого контроля очень затруднительным. Когда радиоактивный изотоп распадается, образующийся дочерний изотоп часто является весьма отличным химически от исходного изотопа. Например, радий-224 является альфа-излучателем, но химически представляет собой щелочно-земельный металл, принимающий степень окисления 2+. Непосредственный продукт альфа-распада 224Ra, однако, представляет собой радон-220, который является благородным газом. Поэтому, какие бы эффекты координации или хелатирования ни удерживали стабильно родительский ион радия в контролируемом нацеливаемом агенте ранее, маловероятно, что они будут поддерживать контроль над дочерним изотопом радона, который, таким образом, может дуффундировать и распадаться где-либо в организме. Очевидно, может следовать полная цепь дальнейших событий распада без какого-либо контроля над тем, где в организме происходят эти события. Физический эффект альфа-распада на образующийся дочерний изотоп также может быть довольно существенным. Гелиевое ядро альфа-частицы имеет относительную атомную массу 4 и обычно излучается со скоростью, составляющей около 2% скорости света. Очевидно, это придает значительную энергию образующемуся дочернему ядру, которое, как можно ожидать, путем простого сохранения импульса будет отскакивать со скоростью, превышающей 100 км/с. Очевидно, объединенная разрушительная сила очень высокоскоростной альфа-частицы и отдачи, придаваемой массивному дочернему ядру, может разрывать химические связи, выталкивать ядра из хелатов и вызывать значительные сложности при любой попытке проконтролировать судьбу ядер в цепочке ядерного распада еще дальше. В результате, предложено очень мало способов, посредством которых в терапии можно использовать ядра, распадающиеся путем альфа-распада, из-за сложностей поддержания контроля над последующими распадами. Цепочки распа-1- 011715 дов некоторых альфа-излучающих изотопов, которые могут быть полезными в терапии, показаны ниже. Таблица 1 Таблица 2 Как можно увидеть из приведенных выше таблиц, если используют альфа-излучатель, имеющий относительно длинную цепочку распада, существует потенциал для того, что одиночное ядро даст 4 или 5 высокоэнергетических и высокотоксичных альфа-распадов перед достижением стабильного изотопа. Это потенциально могло бы дать высокоэффективное направленное уничтожение клеток. Проблемой в связи с этим, однако, является то, что, если судьба данных дочерних изотопов не контролируется, тогда для каждого одного родительского ядра, которое распадается в желательном месте действия, 3 или 4 дополнительных альфа-распада могут происходить в нежелательных местах. Следовательно, энергия таких ядер очень велика, но они требуют точного физического и химического контроля над их распределением. Было предложено несколько способов, включающих хелатирование ядер альфа-излучающих металлов, но они обычно являются неадекватными для сохранения контроля над всей цепочкой распадов, начиная с любого радиоактивного изотопа, имеющего одно или более чем одно альфа-излучающее дочернее ядро, так как простое хелатирование не может поддерживать контроль над этими дочерними ядрами по причинам, рассмотренным выше. В прошлом предлагали некоторые способы, помогающие контролировать распределение дочерних ядер после альфа-распада и, таким образом, обеспечивать эффективное нацеливание и применение альфа-излучателей в терапии. Эти способы подразумевают включение альфаизлучателя в поверхности костей, нуждающихся в лечении, где дочерние ядра могут оставаться в ловушке (например, WO 00/40275), и включение альфа-излучателей в липосомы, так что отскакивающие дочерние ядра остаются в ловушке в центральном участке липосомы (например, WO 01/60417). Еще одной дополнительной сложностью, связанной с введением альфа-излучающих радиоактивных ядер, является разрушающий эффект альфа-излучения и отскакивающих дочерних ядер на композицию. Очень высокая энергия события распада может не только выбить радиоактивный изотоп из хелатного комплекса, но и может иметь значительный разрушительный эффект на сам препарат. Таким образом, даже если радиоактивный изотоп имеет период полураспада несколько суток, может быть необходимым получение фармацевтической композиции непосредственно перед введением, так как разрушительная энергия, высвобождаемая при распаде даже малого количества радиоактивного изотопа, может разрушить остальную часть композиции. -2- 011715 Одним из путей, которым в последние годы повышали эффективность лечения неопластических заболеваний, особенно раковых заболеваний, является концепция комбинированной терапии. Идеей, лежащей в основе комбинированной терапии, является то, что два или более чем два лекарственных средства или способа для борьбы с нежелательными популяциями клеток используют одновременно или в относительно быстрой последовательности. Этим способом клетки-мишени, которые возможно были ослаблены первым способом лечения, могут становиться более чувствительными к уничтожению последующим способом. Кроме того, побочные эффекты двух или более чем двух способов лечения, используемых в комбинации, могут быть аддитивными или предпочтительно меньшими, чем аддитивные, тогда как терапевтический эффект является аддитивным или предпочтительно большим, чем аддитивный. Таким образом, можно обеспечить больший терапевтический эффект, используя схему лечения, которая остается переносимой пациентом. Одним из наиболее эффективных способов обеспечения комбинированной терапии является получение лекарственного средства с более чем одним видом активности. Это приводит к одновременному лечению клеток-мишеней более чем одним терапевтическим агентом. Это может приводить к большему, чем аддитивное увеличению эффективности, так как, для того чтобы выжить, клетка должна одновременно противостоять двум видам атаки. Равным образом, субпопуляция клеток-мишеней, которые возможно обладают некоторой устойчивостью к одному способу лечения, с большей вероятностью будет уничтожена другим способом лечения, и, таким образом, развитие устойчивости будет задержано. В настоящее время нет эффективного способа создания терапевтических средств, которые могут контролировать и давать высокую цитотоксичность альфа-излучающего радиоактивного изотопа тяжелого металла и его дочерних изотопов, в комбинации со вторым терапевтическим (особенно цитотоксическим) агентом в той же самой системе доставки лекарственного средства. Это происходит благодаря тому, что объединение двух агентов в одной и той же молекуле основывалось бы на эффекте хелатирования для улавливания альфа-излучателя, что было бы неадекватным, чтобы сохранить контроль над дочерним ядром. Таким образом, существует значительная потребность в лекарственном средстве и системе доставки, которые могут обеспечить комбинированную терапию, включая доставку и контроль над альфа-излучателем, представляющим собой тяжелый металл, в комбинации с одновременной доставкой второго агента в той же самой системе доставки. Трудности, с которыми сталкиваются при получении эффективного комбинированного лекарственного средства, включающего альфа-излучающий радиоактивный изотоп, являются значительно большими, чем трудности, с которыми сталкиваются, например, при получении комбинаций бета-излучателей и других терапевтических средств. Среди эти трудностей есть проблемы сохранения контроля над родительским и дочерними ядрами, описанные выше, огромная и концентрированная разрушительная сила локального альфа-излучения и тот факт, что нельзя вводить долгоживущие изотопы из-за долговременного повреждения, которое такое облучение могло бы причинить субъекту. В случае, например, бета-излучателя, отдача ядра является относительно маленькой, делая возможной координацию бета-излучателя с другим терапевтическим агентом путем простого хелатообразования. Аналогично, энерговклад на единицу объема от бета-излучения примерно на четыре порядка ниже, чем для альфа-излучения, и, таким образом, любая химическая структура в тесной близости с альфа-излучением должна быть способной выдерживать значительно более сильное повреждение, оставаясь функциональной, чем это было бы в случае бета-излучателей. Аспект получения является дополнительной значительной трудностью. В частности, эффективный и надежный контроль над альфа-излучателями, в идеале, должен быть обеспечен нацеливающим агентом, который можно быстро и легко загрузить, предпочтительно в "месте лечения" ("point of care"), или за очень короткий промежуток времени перед этим. За короткий промежуток времени, имеющийся перед распадом подходящего альфа-излучателя, нельзя предпринимать сложные процедуры синтеза. Комбинации альфа-излучателей и других терапевтических агентов, таким образом, ранее рассматривали как, практически, невозможные для получения, так как они должны иметь простой синтез, надежный контроль над радиоактивными ядрами и устойчивость препарата к разрушению или потере второго лекарственного средства при длительной высокоэнергетической бомбардировке. Авторы настоящего изобретения теперь неожиданно установили, что могут быть получены липосомы, содержащие как альфа-излучающий радиоизотоп тяжелого металла, так и второй терапевтический агент. Все же более неожиданным является то, что авторы данного изобретения установили, что такие липосомы могут быть сделаны достаточно устойчивыми к высоким энергиям альфа-распада и отдачи ядер и что они остаются устойчивыми к хранению в течение нескольких недель и могут стабильно удерживать альфа-излучатель, второй терапевтический агент и, в некоторых случаях, дочерние ядра после альфа-распада. Это является большой неожиданностью, так как на протяжении этого периода липосома будет много раз проколота высокоэнергетическими частицами. В первом аспекте настоящего изобретения, таким образом, предложены липосомы, представляющие собой цитотоксический агент, где указанные липосомы включают в себя раствор, содержащий по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент. Предпочтительно альфа-излучающий радиоактивный изотоп представляет собой альфа-3- 011715 излучатель, являющийся тяжелым металлом, как здесь определено. Данные липосомы предпочтительно также включают в себя по меньшей мере один хелатирующий или комплексообразующий агент. Данные липосомы также предпочтительно включают в себя по меньшей мере один ионофор. В другом аспекте настоящего изобретения также предложен способ синтеза липосом, включающих в себя раствор, содержащий по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент, причем указанный способ включает приведение в контакт липосом, включающих в себя раствор, содержащий по меньшей мере один терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа, с раствором, содержащим по меньшей мере один ионофор и по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп. Предпочтительно способ по изобретению представляет собой способ получения цитотоксического агента по изобретению. В другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один цитотоксический агент по настоящему изобретению и, возможно и предпочтительно, по меньшей мере один фармацевтически переносимый носитель и/или эксципиент. Еще в одном дополнительном аспекте данного изобретения предложен цитотоксический агент по настоящему изобретению для применения в терапии. Цитотоксические агенты по настоящему изобретению и фармацевтические композиции и препараты, содержащие такие агенты, являются весьма подходящими для применения в лечении заболевания, в частности в лечении гиперпластического или неопластического заболевания. Еще в одном дополнительном аспекте настоящего изобретения, таким образом, предложен способ лечения заболевания, предпочтительно гиперпластического или неопластического заболевания, включающий введение субъекту (человеку или животному, не являющемуся человеком), предпочтительно млекопитающему, цитотоксического агента по настоящему изобретению. Еще в одном дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение цитотоксического агента по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для применения в способе лечения гиперпластического или неопластического заболевания. Данный цитотоксический агент предпочтительно следует вводить в терапевтически, профилактически эффективном количестве и/или в количестве, эффективно ослабляющем боль. Цитотоксические агенты по настоящему изобретению включают липосомы, включающие в себя раствор, содержащий по меньшей мере один радиоактивный изотоп, предпочтительно альфа-излучающий радиоактивный изотоп, и по меньшей мере один другой терапевтический агент. Предпочтительно радиоактивные изотопы по настоящему изобретению будут представлять собой радиоактивные изотопы тяжелых металлов в том смысле, что они будут иметь относительную массу изотопа по меньшей мере 150 атомных единиц массы. Предпочтительно данные радиоактивные изотопы будут иметь массу изотопа по меньшей мере 200, более предпочтительно от 210 до 230. Особо предпочтительные альфаизлучающие радиоактивные изотопы тяжелых металлов включают 211At, 212Bi, 223Ra, 224Ra, 225Ac и 227Th. Термин "альфа-излучающий радиоактивный изотоп", как он использован здесь, охватывает ядра с одним (альфа) способом радиоактивного распада и также ядра со способами множественного распада, где по меньшей мере часть ядер данного изотопа распадается посредством альфа-излучения. Когда ядро имеет более чем один способ излучения, предпочтительно, что по меньшей мере 1% будет распадаться путем альфа-излучения, предпочтительно по меньшей мере 10% и более предпочтительно по меньшей мере 30% будет распадаться путем альфа-излучения. В одном воплощении, по существу, все ядра будут распадаться путем альфа-излучения. Когда "разветвляющийся" альфа-излучатель, имеющий два или более чем два способа распада, дает относительно низкую долю альфа-частиц, он, однако, также может быть "непрямым" альфа-излучателем, как описано здесь ниже, так как продукт распада, не являющегося альфа-распадом, может приводить (прямо или опосредованно) к другому альфа-излучателю. Термин "альфа-излучающий радиоактивный изотоп", как он использован здесь, также применяют для того, чтобы указать, где это позволяет контекст, на "непрямой" альфа-излучающий радиоизотоп. Такие непрямые альфа-излучатели могут быть радиоактивными изотопами, которые сами не подвергаются альфа-распаду в значительной степени, но распадаются другим способом (например, путем бета-излучения) с образованием альфа-излучателя. Предпочтительно этот альфа-излучатель будет прямым дочерним продуктом "непрямого" альфа-излучателя, но и может происходить в результате более чем одного распада, не являющегося альфа-распадом. Предпочтительно альфа-излучатель, образующийся от распада "непрямого" альфа-излучателя, будет иметь короткий период полураспада (например, менее 24 ч, более типично менее 1 ч и предпочтительно менее 10 мин). Примеры непрямых альфа-излучателей включают 212 Pb, 212Bi и 213Bi (последние два сами также являются "разветвляющимися" альфа-излучателями). Период полураспада подходящих альфа-излучателей обычно будет достаточным для того, чтобы сделать возможным их получение, транспорт и ограниченное хранение перед применением в качестве радиотерапевтического средства, но обычно не будет таким долгим, чтобы подвергать долговременному риску здоровье субъекта, если определенное количество данного изотопа сохраняется в организме во время и после лечения. Таким образом, подходящие альфа-излучатели (включая непрямые альфа-излучатели) обычно будут иметь периоды полураспада по меньшей мере 30 мин, предпочтительно по меньшей мере 6 ч и более предпочтительно по меньшей мере 1 сутки. Наиболее предпочтительные альфа-излуча-4- 011715 тели имеют период полураспада по меньшей мере 3 суток. Для того, чтобы избежать долговременного облучения, период полураспада альфа-излучателей обычно должен быть менее года, предпочтительно менее 6 месяцев и наиболее предпочтительно менее 1 месяца. Организм также потенциально будет подвергаться воздействию радиации от любого альфа-излучающего дочернего ядра, образуемого последующим распадом. Таким образом, когда цепочка распадов от введенного альфа-излучателя включает один или более чем один другой альфа-излучатель, предпочтительно, чтобы ни один изотоп, образованный в этой цепочке распадов, вплоть до и включая последний альфа-излучающий изотоп перед образованием стабильного ядра, не имел периода полураспада более 1 года. Более предпочтительно он должен быть не более 6 месяцев и наиболее предпочтительно не более 1 месяца. Цитотоксические агенты по настоящему изобретению обычно содержат по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один терапевтический агент в объединенных количествах для достижения терапевтической, профилактической эффективности и/или эффективности в облегчении боли. Это количество очевидно будет зависеть от конкретного изотопа(ов), выбранного для применения, природы и числа других терапевтических агентов, состояния(ий), которые нужно лечить, предупреждать и/или облегчать, вида, возраста, пола, массы, здоровья и прогноза субъекта, способа введения, эффективности нацеливания, времени пребывания, способа клиренса, типа и серьезности побочных эффектов фармацевтической композиции и от многих других факторов, которые будут очевидными специалистам в данной области. Обычно общая доза излучения будет находиться в интервале от 10 кБк до 10 ГБк на каждое однократное введение, с более предпочтительным интервалом, составляющим от 1 МБк до 1 ГБк на каждое однократное введение. Аналогично, другой терапевтический агент(ы) будет использован в концентрации, при которой ожидается терапевтическая, профилактическая эффективность и/или эффективность в облегчении боли в комбинации с альфа-излучателем. Поскольку другой терапевтический агент(ы) обычно будет известным фармацевтическим агентом, он обычно будет использован в концентрации от 10% его нормальной минимальной терапевтической дозы до 500% его максимальной нормальной терапевтической дозы. Более предпочтительно этот интервал будет составлять от 25% нормальной минимальной дозы до 200% нормальной максимальной дозы. В одном предпочтительном воплощении уровень общего альфа-излучения в цитотоксических агентах по изобретению находится ниже минимальной дозы, требуемой для терапевтической, профилактической эффективности и/или эффективности по облегчению боли при использовании в виде единственной терапии (например 10-99%, предпочтительно от 25 до 75% этой минимальной дозы). Это делает возможным снижение побочных эффектов, вызываемых эндорадиоизотопной терапией, но данная терапия оказывается эффективной, так как цитотоксические агенты по изобретению в комбинации с по меньшей мере одним другим терапевтическим агентом, в целом, являются эффективными. В другом предпочтительном воплощении все или каждый другой терапевтический агент(ы) используют в концентрации ниже минимальной нормальной терапевтической дозы, например 10-99% нормальной минимальной терапевтической дозы, предпочтительно от 25 до 75% их нормальной терапевтической дозы. Опять это служит для снижения опасности побочных эффектов и делает возможным более высокий уровень общей эффективности без подвержения субъекта неприемлемым побочным эффектам. В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент в цитотоксических агентах по данному изобретению являются синергическими в отношении их дозировок. То есть эффект, обеспечиваемый цитотоксическим агентом по настоящему изобретению, больше, чем можно было ожидать, исходя из аддитивных эффектов включенных доз альфа-излучающего радиоактивного изотопа и по меньшей мере одного другого терапевтического агента при раздельном использовании. В альтернативном, но одинаково предпочтительном воплощении альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент в цитотоксических агентах по изобретению являются синергическими в отношении их побочных эффектов. То есть побочные эффекты, вызываемые цитотоксическим агентом по настоящему изобретению, меньше, чем можно было ожидать, когда эквивалентный терапевтический эффект обеспечивается либо альфа-излучающим радиоактивным изотопом, либо по меньшей мере одним другим терапевтическим агентом при раздельном использовании. Значительным преимуществом одного воплощения данного изобретения является то, что цитотоксические агенты неожиданно способны сохранять дочерние ядра, образующиеся при альфа-распаде данного радиоактивного изотопа, в пределах липосомы. Это является особенно важным, когда дочерний изотоп и/или любой другой изотоп, образующийся в цепочке радиоактивного распада между первым радиоактивным изотопом и стабильным изотопом, также является альфа-излучающим радиоактивным изотопом. Таким образом, в одном воплощении липосомы предпочтительно инкапсулируют раствор, содержащий альфа-излучающий радиоактивный изотоп, который генерирует по меньшей мере один другой альфа-излучающий радиоактивный изотоп на протяжении его распада. Предпочтительным является то, что данная липосома способна стабильно удерживать этот дополнительный альфа-излучающий радиоактивный изотоп. Кроме того, предпочтительным является то, что данная липосома способна удерживать любые последующие альфа-излучающие радиоактивные изотопы, которые могут образоваться -5- 011715 посредством другого радиоактивного распада. В альтернативных воплощениях настоящего изобретения, когда материнские ядра представляют собой альфа-излучатели, дочерние ядра могут не удерживаться в значительной степени. Это, однако, является приемлемым при некоторых обстоятельствах, особенно когда распад дочернего ядра является быстрым, и, таким образом, дочерний изотоп не имеет времени для значительного перемещения после образования. Такой быстрый распад, например, может иметь период полураспада менее 1 ч, предпочтительно менее 20 мин и наиболее предпочтительно менее 1 мин. Аналогично, когда период полураспада дочернего изотопа является длительным по отношению к скорости его клиренса из организма, тогда будет распадаться малое количество дочернего изотопа перед его вытеснением и, таким образом, не будет нанесено значительного вреда. Это возможно будет иметь место при периоде полураспада по меньшей мере 1 сутки, предпочтительно по меньшей мере 3 суток и более предпочтительно по меньшей мере 10 суток. Липосому можно рассматривать как способную стабильно удерживать дочерние ядра, образующиеся в результате радиоактивного распада, если по меньшей мере 10% таких дочерних ядер, образующихся в результате радиоактивного распада, удерживаются в растворе, захваченном липосомой. В этом инкапсулированном растворе предпочтительно удерживается по меньшей мере 25% дочерних ядер и более предпочтительно по меньшей мере 30%. Это является значительным преимуществом перед другими формами введения альфа-радиоактивных изотопов, когда практически 100% дочерних ядер будет потеряно из-за отдачи ядра при распаде. Когда цитотоксические агенты по настоящему изобретению приготовлены в виде препарата для несистемного (особенно местного или регионального) применения, липосомы могут быть больше и все еще будут удерживать большую долю распадающихся альфа-радиоактивных изотопов. В этих применениях предпочтительно может удерживаться по меньшей мере 40% и даже по меньшей мере 50% распадающихся альфа-радиоактивных изотопов. Неожиданным и полезным аспектом цитотоксических агентов по настоящему изобретению является то, что они способны удерживать содержимое липосом даже при высокоэнергетической бомбардировке локального альфа-распада. В одном воплощении цитотоксические агенты, таким образом, сохраняют по меньшей мере 50% другого терапевтического агента в течение времени, превышающего период полураспада альфа-излучающего радиоактивного изотопа. Предпочтительно это количество превышает 60% и более предпочтительно составляет по меньшей мере 75%. Липосомы, используемые в настоящем изобретении, могут быть образованы из любого подходящего липида или их смеси и могут быть однослойными, двухслойными или многослойными. Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что липосомы способны сохранять их структуру и удерживать родительские и дочерние радиоактивные изотопы и один или более чем один дополнительный терапевтический агент даже при условиях, в которых они подвергаются повреждению, вызываемому терапевтическим уровнем альфа-излучения и происходящему в результате отдачи ядра. Не будучи связанными теорией, авторы данного изобретения убеждены в том, что эта неожиданная способность является результатом способности липосом "излечиваться", когда они подвергаются воздействию повреждающего фактора. Таким образом, является предпочтительным, что липид или смесь липидов, образующая слоистую структуру липосомы, должна иметь термотропную температуру перехода около или ниже физиологической или комнатной температуры. Таким способом увеличивается текучесть липосомной мембраны и ее способность к "излечению" достигает максимума. Поэтому в одном воплощении данного изобретения липосомы образуют из липида или смеси липидов, имеющей термотропную температуру перехода около 10-50°C, предпочтительно 18-45°С и более предпочтительно 20-40°C. Когда используют смесь липидов, не обязательно, чтобы все компоненты имели температуры перехода в этих интервалах, но предпочтительно то, что по меньшей мере один липидный компонент должен иметь такую температуру перехода, и более предпочтительным является то, что данная смесь, в целом, должна иметь температуру перехода в этом интервале. В предпочтительном воплощении цитотоксические агенты по настоящему изобретению, таким образом, являются устойчивыми к потере их содержимого (особенно к потере альфа-радиоактивного изотопа и/или по меньшей мере одного другого терапевтического агента) на протяжении хранения в течение по меньшей мере 3 суток, предпочтительно по меньшей мере 1 недели и наиболее предпочтительно 3 недель при хранении при комнатной температуре. Эта устойчивость является весьма неожиданной, так как на протяжении этого периода хранения липосомы с цитотоксическими агентами будут многократно прокалываться уровнем излучения альфа-частиц и отскакивающих дочерних ядер, который будет по меньшей мере эквивалентным терапевтической дозе, способной экстенсивно убивать клетки у субъекта. Под термином "стабильно удерживаемый" в данном контексте понимают, что не более 20%, предпочтительно не более 10% и наиболее предпочтительно не более 5% содержимого (особенно альфа-радиоактивного изотопа и/или по меньшей мере одного другого активного агента) будет потеряно из липосомы в окружающий раствор на протяжении периода хранения. Опять, не будучи связанными теорией, полагают, что способность липосомной мембраны к "самоизлечению" после "прокола" альфа-излучением и/или отдачи делает возможной эту неожиданную степень удерживания. Термин "липосома", как он использован здесь, означает везикулярную структуру, содержащую по -6- 011715 меньшей мере один липидный бислой, окружающий и включающий в себя по меньшей мере одну часть растворителя. Может присутствовать более чем один бислой, и, таким образом, липосома может быть однослойной везикулой или многослойной везикулой (MLV). Аналогичным образом, более одной части может быть заключено путем нахождения частей растворителя между слоями MLV и/или путем слияния или соединения двух или более чем двух липосом с заключением двух или более чем двух частей растворителя, разделенных по меньшей мере одним липидным бислоем. Любая часть растворителя, по существу, окруженная одним или более чем одним липидным бислоем, считается заключенной частью. Когда заключено более одной части растворителя, они обычно будут содержать, по существу, аналогичные растворитель и компоненты раствора. Часть раствора, заключенная липосомами по настоящему изобретению, обычно будет представлять собой водный раствор, в котором растворен или суспендирован по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп, как здесь описано, и по меньшей мере один другой терапевтический агент. Часть растворителя может дополнительно содержать другие фармацевтически переносимые компоненты, особенно включающие хелатирующий и/или комплексообразующий агент и/или ионофоры, рН-модификаторы, модификаторы тоничности, нацеливающие агенты и т.п. Липосомы без нацеливающих групп имеют тенденцию пассивно включаться в твердые опухоли изза порозности сосудов, ассоциированной с опухолью. Это делает возможным "пассивное" нацеливание цитотоксических агентов с двойной/множественной активностью по настоящему изобретению, когда заболевание, которое необходимо лечить, включает твердую опухоль. Механизм, ответственный за захват липосом опухолью, вероятно, представляет собой капиллярное просачивание, часто обнаруживаемое в новых сосудах опухолей, делающее возможной диффузию липосом через стенки капилляров и в интерстиций опухолей, но не нормальных тканей. Липосомы по настоящему изобретению могут быть модифицированы для того, чтобы увеличить их способность к нацеливанию на желаемое место действия альфа-излучателя и/или по меньшей мере одного другого терапевтического агента, и/или могут быть модифицированы для того, чтобы контролировать скорость их клиренса и/или путь клиренса. В частности, скорость клиренса липосом in vivo часто можно снизить путем модификации поверхности липосомы молекулой, содержащей полиалкиленгликоль. Такие молекулы обычно будут иметь по меньшей мере одну полиалкиленовую цепь (например, полиэтиленовую, полипропиленовую или их смеси) и по меньшей мере одну мембрано-аффинную группу (например, цепь жирной кислоты или C8-С24-алканильную или -алкенильную группу). Примеры включают липиды с привитым полиэтиленгликолем и/или мембрано-растворимые молекулы, модифицированные полипропиленгликолем. Такая модификация поверхности известна специалисту в данной области. Липосомы с модифицированной поверхностью являются особо предпочтительными, особенно для системного применения, так как они обычно имеют более длительное время нахождения в кровотоке. В результате, они имеют больше возможностей использовать преимущество "просачивающейся" природы (новых) сосудов опухоли и, таким образом, могут обеспечить больший эффект нацеливания на опухоль. Липосомы могут эффективно нацеливаться на желаемое место их действия путем модификации поверхности по меньшей мере одной нацеливающей группировкой. Подходящие нацеливающие группировки включают полипептиды, такие как рецепторы поверхности клетки, фрагменты рецепторов, молекулы клеточной адгезии и их фрагменты, антитела, конструкции антител, фрагменты антител и одноцепочечные антитела, гормоны и аналоги гормонов, таких как эстрогены и тестостероны, и малые молекулы, такие как фолаты или аналоги фолатов. В частности, нацеливающими группировками преимущественно могут быть группировки, которые связываются с поверхностью клетки, или внеклеточные агенты, образуемые клетками-мишенями в необычно высокой концентрации. Такие агенты включают рецепторы гормонов, такие как рецепторы тестостерона и/или рецепторы эстрогена. Путем конъюгирования с липосомами моноклональных антител или других молекул, имеющих сродство к рецепторам, ассоциированным с опухолевыми клетками, они могут активно нацеливаться на одиночную клетку или микрометастатическое заболевание, а также даже более эффективно локализоваться в твердых опухолях. В одном воплощении липосомы являются неповерхностно модифицированными фолатом, конъюгированным с моноклональным антителом или с его FAB-фрагментом. Липосомы, используемые в настоящем изобретении, обычно будут подходящими для системной, региональной и/или местной терапии. Липосомы для местного или регионального (например, внутриполостного) применения обычно будут больше, чем липосомы, предназначенные для системного введения в кровоток. Липосомы, подходящие для введения в кровоток (например, путем внутривенной или внутриартериальной инъекции или инфузии), обычно будут не более 10 мкм в их наибольшем измерении, предпочтительно не более 1 мкм и более предпочтительно не более 200 нм. Поскольку очень маленькие липосомы могут не так эффективно удерживать их содержимое при значительном деструктивном эффекте терапевтического альфа-излучения (и происходящей в результате отдачи ядра), данные липосомы обычно должны быть не менее 10 нм в максимальном измерении, предпочтительно не менее 20 нм и наиболее предпочтительно не менее 40 нм. В одном предпочтительном воплощении липосомы, используемые в цитотоксических агентах по настоящему изобретению, больше 100 нм (например, 105 нм или более) в их максимальном измерении. При лечении, отличном от введения в кровоток, максимальный -7- 011715 размер липосом обычно будет больше и может составлять вплоть до 100 мкм, предпочтительно вплоть до 50 мкм и наиболее предпочтительно вплоть до 30 мкм. Для того, чтобы при этих способах введения обеспечить низкий клиренс, липосомы могут иметь размер по меньшей мере 100 нм в максимальном измерении, предпочтительно по меньшей мере 2 мкм и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5 мкм. В цитотоксических агентах по изобретению образец агента как целое будет включать липосомы, которые содержат как альфа-излучающий радиоактивный изотоп, так и по меньшей мере один другой терапевтический агент. Обычно уровень альфа-радиоактивного изотопа, необходимый для того, чтобы иметь терапевтический эффект, будет очень низким по сравнению с уровнем другого терапевтического агента(ов) из-за исключительно высокой цитотоксичности альфа-излучения. В результате, несмотря на то, что большая доля липосом будет содержать другой терапевтический агент, нет необходимости, чтобы все они содержали альфа-радиоактивный изотоп. Желательно, чтобы по меньшей мере 80% липосом по объему содержали по меньшей мере один терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа. Предпочтительно это количество будет составлять по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно будет составлять по меньшей мере 95% (например, по существу, 100%). Также желательно, чтобы по меньшей мере 10% липосом по объему содержали и радиоактивный изотоп, и другой активный агент. Эта доля предпочтительно составляет по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 45%. В альтернативном, но менее предпочтительном воплощении могут присутствовать два вида липосом: один, содержащий альфа-излучающий радиоактивный изотоп, и другой, содержащий по меньшей мере один другой терапевтический агент. В другом воплощении цитотоксические агенты по изобретению могут представлять собой липосомы, содержащие как по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп, так и по меньшей мере один другой терапевтический агент, как здесь указано, и также содержат малую долю (30% по объему или менее) дополнительных липосом, содержащих только другой терапевтический агент или предпочтительно содержащих только радиоактивный изотоп. Это делает возможной "тонкую настройку" свойств цитотоксического агента для конкретного применения перед введением. Такие дополнительные липосомы предпочтительно смешивают незадолго перед введением. Подходящие липосомы для применения в получении цитотоксических агентов по настоящему изобретению могут быть получены способами, известными в данной области, или могут быть приобретены липосомы с подходящими композициями, размерами и возможно с модифицированной поверхностью. В одном предпочтительном воплощении цитотоксические агенты получают из имеющихся в продаже липосом, предварительно загруженных по меньшей мере одним нерадиоактивным терапевтическим агентом. Особенно предпочтительными являются пегилированные липосомные препараты антрациклинов, таких как доксорубицин, и их можно синтезировать или получить из коммерческого источника. Особо предпочтительными предварительно загруженными липосомами является липосомальный препарат доксорубицина, такой как имеющийся в продаже препарат Caelyx (RTM). "Другой терапевтический агент", на который здесь ссылаются, представляет собой агент, подходящий для применения в терапии в комбинации с альфа-излучающим радиоактивным изотопом, как здесь описано. Такие терапевтические агенты могут присутствовать для того, чтобы снижать нежелательные побочные эффекты альфа-излучающего радиоактивного изотопа, но обычно они будут агентами, которые сами могут убивать или ограничивать рост по меньшей мере части клеток-мишеней. В частности, поскольку и альфа-излучающий радиоактивный изотоп, и другой терапевтический агент распределяются с липосомами, предпочтительно, чтобы оба были цитотоксическими, и особо предпочтительным является то, чтобы они были цитотоксическими посредством разных механизмов. Это дает наибольшую возможность получения преимущества от комбинированной терапии, так как клетки, которые являются устойчивыми к одному механизму, могут быть восприимчивыми к другому, и стресс клетки-мишени, вызванный одним агентом, может оставить ее ослабленной по отношению к другому агенту. Подходящие другие терапевтические агенты включают радиоактивные изотопы, излучающие другие формы радиации, такие как бета-частицы, гамма-лучи, рентгеновские лучи, конверсионные электроны, электроны Оже или их комбинации; химиотерапевтические агенты, такие как аналоги фолата, нуклеозидные аналоги, токсины, ингибиторы ангиогенеза и другие; терапевтические средства на основе нуклеиновых кислот, такие как гены, функциональным образом связанные с промоторами, антисмысловые ДНК и/или РНК и малые ингибиторные ДНК/РНК; вирусы, активные или инактивированные как таковые или в качестве носителей для терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот; иммунотерапевтические средства, включая возможно функционализированные моноклональные антитела, конструкции или их фрагменты; и агенты для усиления эффективности других терапий, такие как бор для применения в терапии методом захвата нейтронов бором. Другие терапевтические средства также включают агенты визуализации и агенты, усиливающие визуализацию, для того, чтобы облегчить визуализацию сайта-мишени и/или распределение цитотоксического агента. Такие агенты визуализации включают изотопы, излучающие гамма- и/или рентгеновские лучи, контрастные агенты для получения изображения методом магнитного резонанса (например, ком-8- 011715 плексы гадолиния), контрастные агенты для ультразвукового исследования и/или агенты, усиливающие контраст при рентгенологическом исследовании (например, соединения, содержащие тяжелые металлы или йод). Предпочтительно, когда другой терапевтический агент представляет собой агент визуализации, этот терапевтический агент также будет иметь цитотоксический эффект (как, например, цитотоксический бета-излучатель с измеримым гамма-излучением) или будет использоваться в качестве третьего или дополнительного терапевтического агента в комбинации с альфа-излучателем и по меньшей мере одним "другим" цитотоксическим терапевтическим агентом. Предпочтительно, чтобы другой терапевтический агент не представлял собой альфа-излучатель. Когда другой терапевтический агент представляет собой радиоактивный изотоп с более чем одним способом распада, предпочтительно, чтобы менее 1%, предпочтительно менее 0,5% распадалось путем альфа-излучения. Особо предпочтительным нерадиоактивным терапевтическим агентом для применения в настоящем изобретении является доксорубицин. Цитотоксические агенты по настоящему изобретению предпочтительно включают раствор, содержащий по меньшей мере один комплексообразующий/хелатирующий агент. Путем обеспечения подходящей концентрации по меньшей мере одного подходящего комплексообразующего/хелатирующего агента липосомы могут удерживать родительские и дочерние радиоизотопы в большей степени и, таким образом, оказывать более эффективный контроль над in vivo распределением цитотоксического эффекта. Раствор внутри липосом также может содержать другие агенты для снижения вероятности отдачи ядра, выталкивающей дочернее ядро из липосомы, или радиоактивного распада, вызывающего просачивание радиоактивного изотопа и/или любого другого терапевтического агента через любые кратковременные отверстия в липидной мембране. Другие подходящие внутренние агенты включают водорастворимые полимеры или другие агенты, модифицирующие вязкость (для замедления диффузии активных агентов из липосомы в случае образования кратковременного отверстия), и ионы с большим поперечным сечением, такие как (радиоактивные или предпочтительно нерадиоактивные) ионы тяжелых металлов для снижения расстояния, которое будет проходить отскочившее дочернее ядро перед столкновением. Комплексообразующим/хелатирующим агентом(ами) в растворе, заключенном липосомами, обычно будет по меньшей мере один полидентатный макроциклический хелатирующий агент, такой как циклические полиэфиры и/или замещенные или незамещенные циклические полиамины, циклические политиоэфиры или циклические соединения, имеющие смесь гетероатомов. Предпочтительные размеры колец хелатирующих агентов, которые могут быть моноциклическими или полициклическими, предпочтительно составляют от примерно 8 до примерно 20 атомов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 18, с 2-10, предпочтительно 3-7 гетероатомами в кольце. Циклический хелатирующий агент(ы) также может быть замещенным по любому атому углерода или подходящему гетероатому (такому, как азот) возможными заместителями. Эти возможные заместители могут включать одну или более чем одну дополнительную комплексообразующую группу, такую как группа карбоновой кислоты, фосфоновой кислоты, амида, амина (первичного, вторичного, третичного или четвертичного), сложного эфира или простого эфира, и/или могут служить для других целей, таких как связывание хелатирующих агентов в или на основной цепи полимера так, чтобы увеличить локальную концентрацию хелатирующих группировок. Некоторые примеры подходящих хелатирующих агентов включают 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-N,N',N",N'"-тетрауксусную кислоту (DOTA); 1,4,7,10-тетраазациклотридекан-1,4,7,10-N,N',N",N'"-тетрауксусную кислоту (TRITA); 1,4,7,10-тетраазациклотетрадекан-1,4,7,10-N,N',N",N'"-тетрауксусную кислоту (TETA); 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-N,N',N",N'"-тетра(метилен)фосфоновую кислоту (DOTMP); 1,4,7,10-тетраазациклотридекан-1,4,7,10-N,N',N",N'"-тетра(метилен)фосфоновую кислоту; 1,4,7,10-тетраазациклотетрадекан-1,4,7,10-N,N',N",N'"-тетра(метилен)фосфоновую кислоту; диэтилентриамин-N,N',N"-пентауксусную кислоту и ее изомерные производные; криптат[2,2,2], криптат[3,2,2], криптат[2,2,1] и их моно- и дибензопроизводные; каликс[4]арены с мостиковой связью, содержащие богатые электронами группы, выбранные из гидроксильной, карбоксильной, сложноэфирной, амидной и аминной; 1,10-диаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10,N,N'-бис-уксусную кислоту и 1,10-диаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10,N,N'-бис-малонат. Данные хелаторы предпочтительно будут выбраны так, чтобы соответствовать обычным валентностям и степеням окисления радиоактивных изотопа(ов) тяжелого металла и, если подходит, любых дочерних радиоактивных изотопов, которые желательно удерживать внутри липосомы. Например, если исходный альфа-излучающий радиоактивный изотоп включает 227Th, тогда он представляет собой переходный металл, наиболее стабильный в степени окисления 4+, но, при альфараспаде, дает 223Ra, который представляет собой щелочно-земельный металл, принимающий степень окисления 2+. Поскольку 223Ra также представляет собой альфа-излучающий радиоактивный изотоп, важно удерживать максимально возможную долю и родительского, и дочернего изотопа. Подходящие липосомы, следовательно, могут содержать хелатирующие агенты, подходящие для удерживания как 4+ -9- 011715 переходных металлов, так и 2+ щелочно-земельных металлов, а также возможно хелатирующие агенты, подходящие для удерживания ионов других изотопов в цепочке распада (причем данные хелаторы, конечно, могут быть теми же самыми, что и хелаторы, рассмотренные ранее для первых двух ионов). Однако очевидно, что, когда период полураспада изотопа является очень коротким, присутствие соответствующего хелатора будет менее важным. В одном воплощении цитотоксические агенты по изобретению, таким образом, представляют собой липосомы, которые инкапсулируют раствор, содержащий по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и хелаторы, подходящие для хелатирования одного или более одного обычного иона каждого радиоактивного изотопа в цепочке распада, начиная с указанного альфа-излучающего радиоактивного изотопа и заканчивая последним альфа-излучающим радиоактивным изотопом перед тем, как достигается образование стабильного изотопа. Однако нет необходимости обеспечивать хелатирование для очень короткоживущих ядер, и, таким образом, эти хелаторы могут присутствовать, за исключением хелатирования любого изотопа, имеющего период полураспада менее 10 с, предпочтительно менее 5 с и наиболее предпочтительно менее 1 с. Хелатирование также можно не обеспечивать, когда радиоактивный изотоп представляет собой нереакционноспособный элемент, такой как инертный газ, хотя в таких случаях для снижения скорости диффузии можно предпочтительно использовать эффекты вязкости, что также может увеличивать концентрации ионов тяжелых металлов. Поскольку ионофоры, как описано здесь, также служат для хелатирования ионов тяжелых металлов, используемых в настоящем изобретении (как описано здесь ниже), "хелаторы", как они здесь описаны, в одном воплощении данного изобретения представляют собой ионофоры. Когда это имеет место, ионофорные и хелатирующие компоненты цитотоксических агентов по настоящему изобретению могут быть одним и тем же соединением и будут присутствовать в достаточных концентрациях для того, чтобы быть эффективными для выполнения обеих функций. В альтернативном воплощении хелатор может присутствовать в дополнение к любому хелатирующему эффекту, обеспечиваемому ионофором. В таком воплощении хелатор, на который здесь ссылаются, не будет ионофорным компонентом. Кроме того, поскольку определенные биоактивные агенты могут служить для комплексообразования альфа-излучающих радиоактивных изотопов и/или дочерних радиоактивных изотопов по настоящему изобретению, комплексообразующий агент также может быть "другим терапевтическим агентом", как здесь описано. Предпочтительным примером хелатирующего терапевтического агента является доксорубицин. Цитотоксические агенты по настоящему изобретению также предпочтительно включают раствор, содержащий по меньшей мере один ионофор. Подходящие ионофоры делают возможным транспорт альфа-излучающего радиоактивного изотопа через (по меньшей мере один) мембранный бислой липосомы и также помогают захватывать (особенно родительский) радиоактивный изотоп в липосоме. Подходящие ионофоры включают любую молекулу, способную транспортировать ион тяжелого металла через мембранный бислой. Некоторые ионофоры (такие, как кальциевый ионофор А 23187) встречаются в природе и могут использоваться в виде, главным образом, очищенного или высокоочищенного экстракта, а другие могут быть получены синтетическим путем. Синтетические ионофоры предпочтительно включают две или три замещенные амидные группы для хелатирования иона металла и несколько (особенно два на амидную группу) гидрофобных заместителя для обеспечения достаточной растворимости в липидах. Подходящие группы представляют собой, например, C1-C18, особенно С3-С10алкильные заместители. Кальциевые и магниевые ионофоры, такие как А 23187; N,N,N',N'-тетрабутил-3,6-диоксаоктанди[тиоамид]; N,N,N',N'-тетрациклогексил-3-оксапентандиамид; N,N-дициклогексил-N',N'-диоктадецилдигликоликдиамид; N,N'-дигептил-N,N'-диметил-1-бутандиамид; N,N"-октаметилен-бис[N'-гептил-N'-метилмалонамид] и другие, хорошо известные в данной области, могут быть особенно подходящими для ионов металлов, имеющих стабильную степень окисления 2+, особенно для Ra2+, такого как 223Ra и/или 224 Ra. Аналогично, известные ионофоры Pb, такие как N,N-диоктадецил-N',N'-дипропил-3,6-диоксаоктандиамид, могут быть особенно подходящими для ионов тяжелых металлов в степени окисления 4+, таких как Th4+ (например, 227Th). Цитотоксические агенты по настоящему изобретению являются весьма подходящими для уничтожения конкретных клеток и, таким образом, являются эффективными для применения в лечении гиперпластических и/или неопластических заболеваний и для изготовления лекарственных средств для такого лечения. Цитотоксические агенты по данному изобретению являются особенно подходящими для применения в устранении больных клеток при доброкачественных, злокачественных и/или метастатических раковых заболеваниях и/или лейкозах. Конкретные примеры заболеваний, подходящих для лечения агентами по настоящему изобретению, включают мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого, злокачественную меланому, рак яичника, рак молочной железы, рак костей, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, саркомы, лимфомы, лейкозы и опухоли простаты. Другие заболевания, особенно подходящие для применения по изобретению, включают нераковые, особенно гиперпластические заболевания и для снижения боли при заболеваниях (особенно заболеваниях кости), включая артрит. Кроме того, цитотоксические агенты по данному изобретению могут быть использованы для нацеливания на ретикулоэндотелиальную систему - 10 - 011715 (РЭС) и, таким образом, могут быть использованы для иммуномодуляции. Предпочтительные заболевания для такого лечения включают аутоиммунные заболевания и заболевания, связанные с отторжением тканей, и, в частности, агенты по данному изобретению могут быть использованы для помощи в предупреждении отторжения трансплантата при трансплантационной хирургии. Таким образом, одно воплощение этих аспектов относится к местному способу лечения заболевания, и особенно опухоли. Такое лечение предпочтительно можно применять посредством внутриопухолевой инъекции или инфузии субъекту (обычно пациенту человеку), нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества цитотоксического агента по данному изобретению. Такой способ обеспечивает локальное облучение опухолевой ткани и/или новых сосудов опухоли и также доставку по меньшей мере одного другого терапевтического агента в комбинации с ним. Альфа-излучающие радиоактивные изотопы являются высокоэффективными в этом воплощении, так как их пробег является коротким и повреждение окружающей здоровой ткани минимизируется. Примерами заболеваний, которые могут получить особую пользу от этого воплощения изобретения, являются заболевания, вызывающие твердые опухоли, такие как немелкоклеточный рак легкого, злокачественная меланома, рак яичника, рак толстой кишки, саркомы и опухоли простаты. Дополнительное воплощение данного изобретения относится к способам лечения локально распространяющихся раковых заболеваний, таких как, например, опухоли печени или заболевания, ограниченные полостью брюшины или полостью черепа. Это лечение особенно предпочтительно можно применять посредством локально-региональных инъекций или инфузий субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества цитотоксического агента или композиции по данному изобретению. Еще одним воплощением данного изобретения является способ лечения локально распространяющихся раковых заболеваний, таких как опухоли печени, посредством введения терапевтически эффективного количества жидкого препарата, содержащего цитотоксический агент по изобретению, субъекту, нуждающемуся в таком лечении, особенно в кровоснабжение пораженной области или органа указанного субъекта, например в кровоснабжение печени в случае опухоли печени. Это может стимулировать транспорт агента/композиции в данную опухоль. Другое воплощение данного изобретения относится к способу лечения системно распространяющегося рака путем внутривенной инъекции или инфузии или другого системного введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества фармацевтического препарата, содержащего цитотоксический агент по данному изобретению. Другое воплощение данного изобретения относится к способу лечения внутриполостных опухолей, при котором терапевтически эффективное количество цитотоксического агента по настоящему изобретению вводят субъекту, нуждающемуся в таком лечении, путем, например, инъекции или инфузии в полость, пораженную опухолью, и удерживают там в течение достаточного периода времени для того, чтобы получить терапевтический эффект на поверхностях данной полости. Такие полости включают полость черепа, полость брюшины и полости, создаваемые перикардиальным выпотом и мезотелиомой, и введение подходит для таких раковых заболеваний, как внутричерепные раковые заболевания, внутрибрюшинные раковые заболевания или раковые заболевания, локализованные в полостях, создаваемых перикардиальным выпотом и мезотелиомой. В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение цитотоксического агента по изобретению в качестве местного, регионального и/или системного последующего лечения после других способов терапии, особенно после облучения внешними лучами и особенно после хирургии. В этом воплощении цитотоксический агент можно вводить для того, чтобы помочь устранить любые остающиеся пораженные болезнью клетки, которые не были уничтожены другими способами или не были удалены хирургией. В частности, когда из полости тела удаляют путем резекции твердую опухоль, место прикрепления данной опухоли и/или поверхность(и) полости можно обработать для того, чтобы снизить риск оставления пораженных болезнью клеток. Это представляет собой воплощение местного лечения, где цитотоксический агент готовят в виде препарата в виде жидкости, геля, крема, мази, грима, спрея или аналогичного препарата для непосредственного нанесения во время хирургической процедуры. Гель, крем, мазь или грим, особенно гель, являются особо предпочтительными в этом воплощении. В качестве альтернативы (или в дополнение) цитотоксические агенты можно вводить в полость после хирургического вмешательства, например, путем внутриполостной инъекции или инфузии для достижения аналогичного эффекта послеоперационной стерилизации. В случае известного, подозреваемого или указываемого иным способом метастатического заболевания агенты по настоящему изобретению можно применять системно в комбинации с хирургической резекцией или другим лечением первичной опухоли. В таких случаях агенты по данному изобретению обычно будут готовить в виде препаратов как инъецируемые и/или инфузионные жидкости, подходящие для введения в кровоток. Как указано выше, в подходящих применениях агенты по настоящему изобретению могут быть изготовлены в виде фармацевтических композиций в форме инъецируемых и/или инфузионных жидкостей (возможно предназначенных для разведения перед введением), в виде кремов, гелей, растворимых или - 11 - 011715 нерастворимых пластырей, паст, гримов, мазей, спреев, пропитанной абсорбируемой или неабсорбируемой марли и других подходящих препаратов, известных обычному специалисту в данной области. Такие композиции желательно будут содержать по меньшей мере один фармацевтически переносимый носитель или эксципиент, такой как вода для инъекции, стерильный физиологический раствор, буферы, загустители, красители, стабилизаторы, рН-модификаторы, модификаторы вязкости, модификаторы тоничности, соли, сахара, физические подложки и другие агенты, хорошо известные квалифицированному специалисту. Данные композиции можно вводить любым подходящим способом, таким как инфузия посредством катетера, инъекция посредством стандартной иглы и шприца или безыгольного шприца, или прямым нанесением местного препарата, как, например, путем распыления, нанесения и т.д. В предпочтительном воплощении данного изобретения цитотоксические агенты, описанные здесь, вводят как часть схемы лечения, включающей по меньшей мере три стадии: а) введение липосом, содержащих по меньшей мере один агент визуализации или агент, усиливающий визуализацию, посредством которого оценивают распределение липосом и потенциальное нацеливание на опухоль; б) предварительная обработка по меньшей мере одной дозой нерадиоактивных липосом, посредством которой снижают накопление в печени/ретикулоэндотелиальной системе (RES); в) по меньшей мере одно введение цитотоксического агента по настоящему изобретению. Обычно стадии а), б) и в) будут проводить в этом порядке, хотя липосомы стадии а) также могут служить в качестве предварительной обработки стадии б), причем в данном случае эти стадии проводят одновременно, и предварительную обработку стадии б) можно проводить перед стадией визуализации а). Между стадией предобработки б) и введения в) предпочтительно обеспечивают промежуток времени от 12 ч до 10 суток, предпочтительно от 24 ч до 7 суток, более предпочтительно от 2 до 6 суток. Липосомы стадий а) и в) предпочтительно будут содержать, по существу, один и тот же липид или липидную смесь, по существу, в одних и тех же соотношениях и будут иметь, по существу, один и тот же средний размер и распределение по размерам, так что распределение липосом на стадии а) точно отражает терапевтическое распределение на стадии в). В особо предпочтительном воплощении липосомы стадии б) будут нести по меньшей мере один терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа. В частности, в этом воплощении предпочтительным является, чтобы липосомы стадии б) также имели характеристики, аналогичные характеристикам липосом стадий а) и в), как обсуждалось выше. Приведенный выше способ может быть улучшен одним или более чем одним повторением всего способа и/или стадий б) и в). В способе, альтернативном приведенному выше, например, когда визуализация путем применения липосом не требуется, стадии б) и в) приведенного выше способа можно использовать без или независимо от стадии а). Стадии б) и в) обеспечивают особо предпочтительный способ введения цитотоксических агентов по настоящему изобретению, так как этим способом может контролироваться захват определенными тканями, не являющимися мишенями, такими как печень. Предпочтительным способом является введение липосом, содержащих "другой" терапевтический агент, но не альфа-излучатель, на стадии б) и затем введение соответствующего цитотоксического агента на стадии в) в период времени после того, как описано выше. В настоящем изобретении предложен способ синтеза липосом, включающих в себя раствор, содержащий по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент. Этот способ включает приведение в контакт липосом, включающих в себя раствор, содержащий по меньшей мере один терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа, с раствором, содержащим по меньшей мере один ионофор и по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп. Предпочтительно данный способ по изобретению представляет собой способ получения цитотоксического агента по изобретению, как здесь описано. Липосомы предпочтительно являются такими, как описано здесь выше, и предпочтительно будут содержать по меньшей мере один хелатирующий агент в дополнение к по меньшей мере одному другому терапевтическому агенту. В альтернативном способе по изобретению другой терапевтический агент можно загружать в липосому после и/или одновременно с загрузкой липосом радиоактивным изотопом. Когда загрузка является одновременной, ее можно осуществлять на протяжении образования/повторного образования липосом или можно осуществлять после того, как липосомы были образованы. Способ по настоящему изобретению может включать приведение в контакт липосом, включающих в себя раствор, содержащий по меньшей мере один терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа, и по меньшей мере один хелатор (который может быть ионофором, как описано выше), с "загрузочным раствором", содержащим по меньшей мере один ионофор и по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп. Альтернативно, общая концентрация хелатора может быть обеспечена транспортом через мембрану липосомы из загрузочного раствора. Контакт липосом с загрузочным раствором предпочтительно проводят при температуре, превыщающей физиологическую температуру. Эта температура, таким образом, предпочтительно составляет около 45-90°C, более предпочтительно около 50-80°С и наиболее предпочтительно около 60-75°C. Кроме - 12 - 011715 того, данный ионофор предпочтительно может быть выбран таким образом, что он будет способен транспортировать радиоактивный изотоп тяжелого металла через мембрану липосомы при повышенной температуре (как описано), но не при физиологической и/или комнатной и/или пониженной температуре хранения. Выбор подходящего ионофора для этого аспекта будет зависеть от липида(ов), используемых в данных липосомах, и его можно осуществить путем обычного тестирования эффективности загрузки в способе по изобретению и стабильности загрузки при физиологической/комнатной/пониженной температуре хранения. Это без труда выполнит обычный специалист в данной области, который понимает, что число и природа гидрофобных групп в ионофоре связаны с легкостью, с которой молекула может пересекать липидную мембрану. Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию образования липосом, содержащих по меньшей мере один указанный терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа, перед контактом с загрузочным раствором. Такие способы хорошо известны в данной области и могут быть использованы для обеспечения любой желаемой комбинации активных агентов, и/или хелаторов, и/или других агентов, как здесь указано. Альтернативно, липосомы, содержащие определенные терапевтические агенты, имеются в продаже с фармацевтической степенью чистоты и могут быть использованы в этом отношении в качестве исходного материала. На протяжении или после образования липосом и/или после их контакта с загрузочным раствором поверхность данных липосом может быть функционализирована и/или модифицирована для обеспечения желательных характеристик удерживания и/или нацеливания, как здесь описано. Предпочтительно, чтобы все стадии образования и функционализации липосом проводились перед их загрузкой альфа-излучающим радиоактивным изотопом. Липосомы можно эфективно получать этим способом в относительно большом масштабе и хранить, если это необходимо, в течение периодов времени, превышающих несколько периодов полураспада альфа-излучающего радиоактивного изотопа. Такие предварительно полученные липосомы (которые образуют предпочтительный элемент набора по данному изобретению, как здесь описано) затем можно загружать радиоактивным изотопом за относительно короткое время перед введением. Этим способом лаборатория может хранить исходный раствор липосомного компонента и источник радиоактивного изотопа, как требуется для простой загрузки способом по данному изобретению. Это дает значительное преимущество в обеспечении обычного применения относительно короткоживущих альфа-радиоизтопов в комбинированной терапии без затруднений и длительных стадий получения каждый раз, когда требуется партия. В этом воплощении способа по данному изобретению ионофор приводят в контакт со свежим образцом подходящего альфа-излучающего радиоактивного изотопа (как здесь описано), посредством чего образуется раствор указанного ионофора и указанного альфа-радиоактивного изотопа. Затем этот раствор приводят в контакт с подходящими липосомами согласно способу по изобретению, как здесь описано. Еще в одном дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен набор для получения цитотоксического агента, представляющего собой липосомы, где указанные липосомы включают в себя раствор, содержащий по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент, причем указанный набор включает липосомы, инкапсулирующие раствор, содержащий по меньшей мере один другой указанный терапевтический агент и предпочтительно по меньшей мере один хелатирующий агент, причем указанные липосомы предпочтительно находятся в форме водной суспензии; по меньшей мере один указанный альфа-излучающий радиоактивный изотоп; ионофор, предпочтительно в форме раствора. Возможно наборы по настоящему изобретению также содержат другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты и/или средства для введения данного цитотоксического агента и/или инструкции для получения цитотоксических агентов по настоящему изобретению. Поскольку цитотоксические агенты по данному изобретению могут быть образованы просто из подходящих липосом, предварительно полученных способом по изобретению, в другом аспекте данного изобретения предложен набор, включающий липосомы, возможно или предпочтительно предварительно загруженные раствором, содержащим по меньшей мере один терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа, и предпочтительно по меньшей мере один хелатирующий агент, причем указанные липосомы предпочтительно находятся в форме водной суспензии; ионофор, предпочтительно в форме раствора; и возможно и предпочтительно инструкции для загрузки указанных липосом, посредством чего получают цитотоксический агент по настоящему изобретению, причем указанные инструкции наиболее предпочтительно указывают, что ионофор следует привести в контакт со свежим образцом альфарадиоактивного изотопа, посредством чего образуется раствор указанного ионофора и указанного альфарадиоактивного изотопа, и, после этого или одновременно, полученный таким образом раствор привести в контакт с указанными липосомами. Данное изобретение далее будет проиллюстрировано посредством следующих неограничивающих примеров. Все документы, на которые здесь ссылаются, как выше, так и в примерах, приведенных ниже, - 13 - 011715 включены сюда посредством ссылки. Примеры Материалы и методы Получение радиоактивного изотопа. Радий-223 получали из 227Ac (t1/2=21 у) и 227Th (t1/2=18,7 суток) согласно ранее представленному способу Хенриксена (Henriksen et al. Radiochim. Acta 89, 661-666 (2001)). Вкратце, 223Ra отделяли от актинидов, 227Ac и 227Th, посредством применения Ас-смолы с последующей катионообменной хроматографией и фильтрацией через стерильный фильтр (Millex GV 0,22 мм, Millipore Carrigtwohill Со, Irland). Пример 1. Загрузка 223Ra в липосомы. 1.1. Липосомальный доксорубицин (Caelyx®, Schering Plough AS, Eiksmarka, Norway), соответствующий 2 мг доксорубицина на мл, подвергали буферному обмену с буфером, содержащим 20 мМ HEPES и 300 мМ сахарозы, доведенным NaOH до рН 7-8, и концентрировали в 3 раза посредством центрифужного концентрирующего картриджа (Millipore UFV2BTK 10, мембрана 30 KNMWL, максимальный объем 15 мл, Millipore, Bedford, IL, USA), вставленного в центрифугу Eppendorf 5810R (Eppendorf, Germany), работающую при 20°C и относительной центробежной силе 1400. Кальциевый ионофор (Саионофор, Calcimycin, Sigma, St Louis, MI, США) растворяли до концентрации 1 мг на мл в хлороформе. Приблизительно 15 мл добавляли в 2-мл сосуд и выпаривали хлороформ в струе аргона с образованием тонкой пленки Са-ионофора на внутренней поверхности сосуда. Раствор 223Ra разбавляли в растворе сахарозы (300 мМ) и HEPES (20 мМ). Данный сосуд предварительно нагревали до 60°C и добавляли 200 мл концентрированного Caelyx. Загрузочную смесь встряхивали в течение 45 мин на термомиксере (Eppendorf, Germany) с последующим добавлением 200 мл 10 мМ раствора EDTA. После 5-10 мин дополнительного встряхивания данную смесь переносили на колонку PD-10 с Sephadex G-25 и элюировали 0,9%-ным раствором NaCl. Фракция, содержащая липосомы, имела видимый красный цвет, ее собирали и добавляли 10%-ную 10' среду Игла, модифицированную по Дульбекко (Sigma, MI, США). Затем данные липосомы подвергали стерилизующей фильтрации в стерильном ламинаре через стерилизующий 0,22 мкм фильтр (Millex GV 0,22 мкм, Millipore Carrigtwohill Co, Irland) в 10 мл сосуд, который затем закрывали пробкой из металла/резины. Для достижения равновесия между 223Ra и дочерними изотопами данный сосуд хранили в течение по меньшей мере 3 ч, перед выполнением количественного измерения радиоактивности, используя дозокалибратор Capintec, который калибровали на ряды 223Ra в равновесии с дочерними изотопами. 1.2. Выход загрузки. Количество 223Ra, загруженного в липосомы с Caelyx®, составило порядка 51-67% для трех отдельных экспериментов. Контрольный эксперимент с использованием 223Ra и липосом при идентичных условиях, за исключением отсутствия ионофора, показал менее 1% 223Ra в липосомной фракции, элюированной из колонки с Sephadex G-25. Пример 2. Исследование на животных. Получали 10 бесшерстных мышей с ксенотрансплантатами OHS остеосаркомы. Каждой мыши подкожно вводили 1 дозу 223Ra 375 кБк/кг, инкапсулированного в липосомы с Caelyx®, как получено в примере 1. Через 1 ч, 1 сутки и 4 суток умерщвляли, соответственно, 3, 3 и 4 животных и измеряли распределение радиоактивного вещества в тканях. Распределение радиоактивного изотопа также сравнивали с контролем, в котором радий вводили в раствор липосом в виде соли, но не был инкапсулирован в них. Результаты. Данные показывают, что клиренс радиоактивности крови согласуется с ожидаемым клиренсом для этого типа липосом. Поглощение печенью, по-видимому, является относительно слабым в течение всего исследованного периода, тогда как имело место значительное поглощение селезенкой. Поглощение скелетом, как отражено активностью в бедренной кости и черепе, увеличивалось со временем, возможно из-за того, что медленный катаболизм липосом вызвает высвобождение 223Ra. Имело место четкое различие между распределением двух форм 223Ra во времени. Это различие было особенно высоким в крови, отчасти из-за медленного клиренса липосом из крови и отчасти из-за быстрого клиренса свободного 223Ra. Для большинства мягких тканей удерживание липосомальной формы было значительно повышенным. Поглощение опухолями липосомальной формы первоначально было умеренным из-за низкой васкуляризации в этой модели опухоли, но возрастало со временем. Удерживание в опухоли было более высоким, чем в большинстве других мягких тканей (табл. 3 и фиг. 1). Заключение. 223 Ra, введенный в виде липосомальной комбинированной терапии с доксорубицином, имел релевантное биораспределение у бесшерстных мышей. - 14 - 011715 Таблица 3 Пример 3. Биораспределение и клиренс с предварительной обработкой. Что касается примеров 3 и 4, использовали нормальных мышей Balb/C обоих полов (в возрасте приблизительно 12 недель с массой 18-25 г), которых загружали липосомами, полученными согласно примеру 1. Протокол данного исследования согласовался с Европейским соглашением о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (ETS 123), изданным Советом Европы и одобренным Норвежской администрацией по исследованию животных. Мышей содержали при стандартных условиях, и они имели неограниченный доступ к пище и воде. Оптимизация предварительной обработки. Перед инъекцией липосомальным 223Ra мышей предварительно обрабатывали липосомами с доксорубицином (Caelyx®) для снижения поглощения продукта ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС). Исследование по оптимизации проводили перед главным экспериментом по клиренсу крови и биораспределению для определения благоприятного интервала времени между предварительной обработкой и главной обработкой. В исследовании по оптимизации мышей делили на 4 группы с одной самкой и одним самцом в каждой группе. Группы 1 и 2 получали предварительную обработку липосомами с доксорубицином (8,1 мг/кг) путем внутривенной инъекции, соответственно, за 4 и 1 сутки перед главной обработкой липосомным 223Ra (500 кБк/кг 223Ra и липосомы с доксорубицином 0,9 мг/кг). Группа 3 получала предварительную обработку и обработку одновременно, а группа 4 не получала предварительную обработку. Через 4 ч после обработки перед эвтаназией получали кровь пункцией сердца под анестезией (галотан). Измеряли радиоактивность в крови, моче, кале и различных тканях в Crystal II Multidetector System (Packard Inst. Co. Inc, Downers Grove, IL) и сравнивали ее с измерениями инъекционных стандартов из тестируемого продукта. Данные исследования по оптимизации представлены на фиг. 2. Улучшенное соотношение кровь к печени липосомального 223Ra достигалось у животных, предварительно обработанных за 4 суток 8,1 мг на кг Caelyx® по отношению к животным, получающим предварительную обработку за 1 сутки, коинъекцию или не получающим предварительную обработку Caelyx®. Основываясь на этих результатах, для - 15 - 011715 главного исследования была принята схема с предварительной обработкой за 4 суток. Пример 4. Дополнительное исследование по биораспределению с предварительной обработкой. После примера 3 выполнили более обширное исследование биораспределения с использованием интервала предварительная обработка/обработка в 4 суток, облегчающего достижение наивысшего соотношения кровь/печень липосомального 223Ra. В главном исследовании мышей разделяли на четыре различные группы. Каждая группа состояла из 6-7 животных обоих полов. 6 мышей в каждой группе получали внутривенную предварительную обработку липосомами с доксорубицином (8,1 мг/кг) за 4 суток перед главной внутривенной обработкой 375 кБк/кг 223Ra и липосомами с доксорубицином 0,9 мг/кг. Одну мышь в каждой группе 2, 3 и 4 оставляли необработанной и использовали для измерения возможного повторного поглощения продукта из кала или подстилки. Отбирали кровь, умерщвляли мышей и выполняли измерения радиоактивности тем же самым способом, что и в примере 3, через 1 ч, 24 ч, 6 суток и 14 суток после инъекции для соответствующих групп мышей. Для исследования различий между заключенным в липосомы и свободным 223Ra группе мышей внутривенно инъецировали растворенный 223RaCl. В каждый момент времени 1 ч, 24 ч и 14 суток после инъекции умерщвляли 5 животных, удаляли образцы тканей и определяли радиоактивность на единицу массы, как описано для исследования липосомального 223Ra. Индексы локализации (LI) рассчитывали для липосомального 223Ra по отношению к свободному 223Ra, используя следующее уравнение: LI=[% ID/г для липосомального 223Ra]/[% ID/г для свободного 223Ra] для ткани. Данные главного исследования по биораспределению представлены в табл. 4 и на фиг. 3 и 4. Клиренс крови для радиоактивности (фиг. 3) согласуется с клиренсом, ожидаемым для этого типа липосом, указывая на то, что данные липосомы не разрушаются бомбардировкой альфа-излучением. Таблица 4 Процент инъецированной дозы на грамм тканиа липосомального 223Ra у мышей Balb/C (главное исследование) в четыре разных момента времени а Среднее±стандартное отклонение, n=5-6 животных. н.о. - не определяли (из-за низкой активности счета по отношению к фоновому счету). б Среди мягких тканей наивысшее поглощение на орган наблюдали в печени (фиг. 4). С другой стороны, поглощение печенью с поправкой на массу, по-видимому, является относительно низким в течение всего исследованного периода, тогда как имело место значительное поглощение селезенкой, когда данные представлены в виде % инъецированной дозы на грамм (табл. 4). Поглощение скелетом, как отражено активностью в бедренной кости и черепе, возрастало со временем, возможно из-за медленного катаболизма липосом, вызывающего высвобождение 223Ra. Несмотря на то, что можно было бы ожидать, что липосомы имеют некоторое поглощение костным мозгом, который присутствует в бедренной кости, поглощение черепом, который не содержит значительные количества костного мозга, показывает, что большая часть поглощения в кости идет от свободного радия. Следует отметить, что отличие поглоще- 16 - 011715 ния бедренной костью по отношению к черепу также наблюдали с катионным радием, и оно необязательно отражает накопление в костном мозге. На фиг. 5 представлены индексы локализации (LI) липосомального радия по отношению к катионному радию в различных тканях в моменты времени 1 ч, 24 ч и 14 суток после инъекции. Наблюдали отчетливые различия между двумя формами 223Ra. LI является особенно высоким для крови, частично изза медленного клиренса липосомального радия из крови и частично благодаря быстрому клиренсу свободного 223Ra. Для большинства мягких тканей LI также являются значительно повышенными. LI проб костей составляли менее 1, указывая на значительный контроль биораспределения липосомальным препаратом, подавляющим природное поведение радия как аналога кальция и остеотропа. Период полураспада (T1/2) липосомального препарата, циркулирующего в крови, составлял более 24 ч, тогда как период полураспада в крови простого катионного 223Ra был значительно меньше 1 ч. Пример 5. Дополнительное исследование по нацеливанию на опухоль. Провели дополнительное исследование по нацеливанию пегилированных липосом с двойной загрузкой на твердые опухоли, используя свойства капиллярного просачивания новых сосудов опухоли. Целью данного исследования было изучение распределения и свойств нацеливания на опухоль излучателя альфа-частиц 223Ra, инкапсулированного в липосомы, содержащие доксорубицин (Caelyx®/Doxil®). Caelyx® давали перед инъекцией липосомальным 223Ra для снижения поглощения ретикуло-эндотелиальной системой, как оптимизировано в примере 3. Распределение и поглощение опухолью оценивали в мышиной ксенотрансплантатной модели остеосаркомы человека и у собаки со спонтанной остеосаркомой. Клиренс крови при комбинированной терапии был относительно низким, у мышей t1/2 составлял ~28 ч (мыши BalbC), и у собаки t1/2 составлял ~ 39 ч. У мышей поглощение печенью, по-видимому, было относительно низким по сравнению с селезенкой, где имело место значительное поглощение. У собаки поглощение как печенью, так и селезенкой было умеренным. В ксенотрансплантатной модели обычно имела место более сильная задержка активности в опухоли по сравнению с мягкой тканью. У собаки поглощение за 24 ч было значительно более высоким как в кальцифицированных, так и в некальцифицированных метастазах опухолей различных органов, чем в нормальной ткани. Комбинированная терапия липосомальным 223Ra имели релевантное биораспределение и клиренс крови для нацеливания на опухоль и, в частности, показала благоприятное отношение опухоль/нормальная ткань у собаки со спонтанной остеосаркомой. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Цитотоксический агент, представляющий собой липосомы, где указанные липосомы включают в себя раствор, содержащий по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент, где указанный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент. 2. Цитотоксический агент по п.1, где указанный альфа-излучающий радиоактивный изотоп представляет собой альфа-излучатель, являющийся тяжелым металлом. 3. Цитотоксический агент по п.1 или 2, где липосомы также включают в себя по меньшей мере один ионофор. 4. Цитотоксический агент по любому из пп.1-3, где липосомы также включают в себя по меньшей мере один хелатирующий или комплексообразующий агент. 5. Цитотоксический агент по любому из пп.1-4, где указанный альфа-излучающий радиоактивный изотоп представляет собой по меньшей мере один из 211At, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra, 224Ra, 225Ac или 227Th. 6. Цитотоксический агент по любому из пп.1-4, где указанный другой терапевтический агент представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из аналогов фолата, нуклеозидных аналогов, токсинов и ингибиторов ангиогенеза. 7. Цитотоксический агент по любому из пп.1-6, где альфа-излучающий радиоактивный изотоп и/или каждый другой терапевтический агент присутствует в дозе, которая ниже минимальной дозы, обычно требуемой для терапевтической, профилактической и/или паллиативной эффективности при использовании в виде единственной терапии. 8. Цитотоксический агент по любому из пп.1-7, где альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой присутствующий терапевтический агент(ы) являются синергическими в отношении их дозировок и/или побочных эффектов. 9. Цитотоксический агент по любому из пп.1-8, где указанные липосомы содержат по меньшей мере один липид, имеющий термотропную температуру перехода 10-50°C. 10. Способ синтеза липосом, включающих в себя раствор, содержащий по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент, где указанный способ включает приведение в контакт липосом, включающих в себя раствор, содержащий по меньшей мере один терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа, с загрузочным раствором, содержащим по меньшей мере один ионофор и по меньшей мере один альфа- 17 - 011715 излучающий радиоактивный изотоп, где указанный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент. 11. Способ по п.10, где указанные липосомы, включающие в себя раствор, содержащий по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп и по меньшей мере один другой терапевтический агент, представляют собой цитотоксический агент по любому из пп.1-9. 12. Способ по п.10 или 11, где указанное приведение в контакт проводят при температуре, превышающей физиологическую температуру. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один цитотоксический агент по любому из пп.1-9 и по меньшей мере один фармацевтически переносимый носитель и/или эксципиент. 14. Применение цитотоксического агента по любому из пп.1-9 в терапии. 15. Способ лечения гиперпластического или неопластического заболевания, включающий введение млекопитающему субъекту цитотоксического агента по любому из пп.1-9. 16. Способ по п.15, где указанное введение осуществляют путем системной или внутриопухолевой инъекции или инфузии. 17. Способ по п.15, где указанное введение осуществляют прямым нанесением по меньшей мере на часть полости тела после резекции по меньшей мере части твердой опухоли. 18. Способ по п.15 или 16, включающий предварительное введение по меньшей мере одной дозы нерадиоактивных липосом, предпочтительно за период от 12 ч до 10 суток перед введением указанного цитотоксического агента. 19. Применение цитотоксического агента по любому из пп.1-6 в изготовлении лекарственного средства для применения в способе лечения гиперпластического или неопластического заболевания. 20. Набор для получения цитотоксического агента по любому из пп.1-9, содержащий липосомы, инкапсулирующие раствор, содержащий указанные по меньшей мере один другой терапевтический агент и предпочтительно по меньшей мере один хелатирующий агент, причем указанные липосомы предпочтительно находятся в форме водной суспензии; возможно, по меньшей мере один альфа-излучающий радиоактивный изотоп; ионофор, предпочтительно в форме раствора; и возможно, по меньшей мере один другой фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент и/или средства для введения данного цитотоксического агента и/или инструкции для получения цитотоксических агентов по настоящему изобретению. 21. Набор по п.20, содержащий липосомы, предпочтительно инкапсулирующие раствор, содержащий по меньшей мере один терапевтический агент, отличный от альфа-излучающего радиоактивного изотопа, и предпочтительно по меньшей мере один хелатирующий агент, причем указанные липосомы предпочтительно находятся в форме водной суспензии; ионофор, предпочтительно в форме раствора; и возможно и предпочтительно инструкции для загрузки указанных липосом, посредством чего получают цитотоксический агент по любому из пп.1-9, причем указанные инструкции наиболее предпочтительно указывают, что данный ионофор следует привести в контакт со свежим образцом альфарадиоактивного изотопа, посредством чего образуется раствор указанного ионофора и указанного альфарадиоактивного изотопа, и одновременно или после этого полученный таким образом раствор привести в контакт с указанными липосомами. Фиг. 1 - 18 - 011715 Фиг. 2 Фиг. 3 Фиг. 4 - 19 - 011715 Фиг. 5 Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2 - 20 -
