Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы» Соглашение 14.607.21.0043 от 22.08.2014г. на период 2014 - 2016 гг. Тема: Получение персонализированных клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Тлимфоцитов, предотвращающих рецидив опухоли. Руководитель проекта: зав. лаборатории молекулярной иммунологии, д.м.н., профессор Сенников С.В. Науки о жизни Участники проекта Получатель субсидии: НИИФКИ • исследование молекулярно-генетических механизмов регуляции процессов активации, пролиферации и дифференцировки клеток иммунной системы в норме и при иммунопатологических состояниях и разработку новых методов иммунокоррекции на основе клеточных биотехнологий и генно-инженерных продуктов; Индустриальный партнёр: ЗАО «Компания Витамакс» • основное направление деятельности – разработка высокотехнологичных методов лечения и фармпрепаратов в следующих областях: онкология / гематология; препараты для лечения особо опасных вирусных инфекций (СПИД, гепатиты и т.д.) и др. Внебюджетное финансирование по проекту – 6,02 млн.руб (2014-2 млн. рублей, 2015г – 1,87 млн. рублей, 2016г – 2,15 млн. рублей). Соисполнитель: ИХБФМ СО РАН • исследование противоопухолевой активности дендритных клеток, трансфицированных ДНК-конструкциями, кодирующие эпитопы опухоль-специфических антигенов, на модельных опухолях животных. Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 2 Цели и задачи проекта Цели проекта: Разработка лабораторного регламента получения клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т-лимфоцитов для предотвращения рецидива опухоли. Задачи проекта: 1. Разработка лабораторного регламента культивирования зрелых дендритных клеток (ДК) у больных раком молочной железы (РМЖ), колоректальным раком (КРР) и немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ). 3. Разработка методики создания ДНК-конструкций, кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований. 4. Разработка методики доставки антигенного материала в дендритные клетки. 5. Разработка лабораторного регламента получения фракции активированных мононуклеарных клеток больных РМЖ, КРР и НМРЛ, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против опухолевых клеток и лабораторного регламента использования факторов-регуляторов активности клеточных препаратов. 6. Разработка лабораторного регламента получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток РМЖ. 7. Создание опытного образца ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы ОАА, в количестве, достаточном для проведения доклинических исследований. 8. Разработка плана и проведение доклинических исследований; 9. Разработка проекта протокола клинического исследования клеточного препарата для медицинского применения. Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 3 Ожидаемые результаты проекта - Экспериментальные образцы ДНК конструкций, кодирующих эпитопы опухольассоциированных антигенов для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований. - Лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток - Лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью против опухолевых клеток. - Методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки. - Проект протокола ограниченного клинического исследования эффективности и безопасности противоопухолевой клеточной иммунотерапии пациентов с онкопатологией. - Проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка технологий клеточной иммунотерапии больных эпителиальными формами рака». Проводимые работы позволят получить результаты являющиеся новыми в направлении работ по разработке и применению ДНК-конструкций и дендритных клеток для иммунотерапии больных эпителиальными формами рака. Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 4 Перспективы практического использования Потребителями научно-технических результатов ПНИ являются ИП (ЗАО «Компания Витамакс»), а также другие медицинские и научные центры, медицинские лечебнопрофилактические учреждения, оказывающие высокоспециализированную медицинскую помощь. Перспективы практического использования результатов проекта: - проведение ограниченных клинических исследований по оценке эффективности разработанных технологий совместно с индустриальным партнером, - продажа неисключительной лицензии на технологию получения и применения клеточного препарата индустриальному партнеру, - создание на базе лечебно-профилактических учреждений и медицинских центров лабораторий по созданию персонифицированных клеточных препаратов для проведения иммунотерапии онкологических больных. Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 5 Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г. - разработка методики создания ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы опухольассоциированных антигенов для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований, - наработка эксперим. образцов ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухольассоциированных антигенов для различных форм злокачественных новообразований - лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток, - методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки, - лабораторный регламент получения антиген-специфических цитотоксических Тлимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против опухолевых клеток, - лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток (рак молочной железы), - анализ активации воспалительного ответа на липоплексы, состоящие из маннозилированных липосом и ДНК-конструкций, in vitro и in vivo. Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 6 Разработка методики создания ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований Этапы создания полиэпитопных конструкций: 1. Выбор антигенов. 2. Выбор эпитопов. Использование современных методов предсказания эпитопов плюс эпитопы с доказанной эффективностью. 3. Оптимизация TAP-процессинга. 4. Соединение эпитопов с учетом (иммуно)протеасомного расщепления. Максимизация вероятности "правильного" расщепления при попадании в протеасому. 5. Добавление сигнальной послед-ти. Убиквитин направляет полипептид в протеасому. 6. Поиск и удаление «паразитных» (нежелательных) эпитопов. 7. Перевод аминокислотной послед-ти в нуклеотидную. Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 7 Наработка эксперим. образцов ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов для различных форм злокачественных новообразований 1. Все экспериментальные образцы ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы ОАА для различных форм злокачественных новообразований, были наработаны в количестве, достаточном для проведения всех необходимых экспериментов и исследований с материалом от больных раком молочной железы, колоректальным раком и немелкоклеточным раком легкого, и очищены от эндотоксинов с подтверждением правильности нуклеотидной последовательности секвенированием. 2. ДНК-конструкции (в количестве 5 мг каждой) кодируют 323 эпитопа от 26 ОАА: pmax-CTL1 содержит эпитопы из HER-2 (31), mammaglobin-A (13), NY-BR-1 (19) и hMena (8). Всего 71 эпитоп; pmax-CTL2 содержит эпитопы из WT1 (12), теломеразы hTERT (23), survivin (6), p53 (23) и MUC1 (13). Всего 77; pmax-CTL3 содержит эпитопы из MAGE-A10 (11), NY-ESO-1 (9) и MUC-1 (9). Всего 29 эпитопов; pmax-CTL4 содержит эпитопы из MAGE-A3 (11), PRAME (12), EpCAM (4) и MUC-1 (9). Всего 36 эпитопов; pmax-CTL5 содержит эпитопы из EpCAM (4), CEA (11), Guanylyl Cyclase C (11) и 5T4 (8). Всего 34 эпитопов; pmax-CTL6 содержит эпитопы из Legumain (7), VEGFR-1 (10), VEGFR-2 (10), FAP (9) и Fos-related antigen-1 (5). Всего 41 эпитопов; pmax-CTL7 содержит эпитопы из Brachyury (9), SOX2 (4), Snail1 (4) и Snail2 (4). Всего 21 эпитопов; pmax-PolyTh содержит эпитопы из HER2 (2), hTERT (1), p53 (3), WT1 (1), NY-ESO-1 (1), VEGFR-2 (1), survivin (4) и MAGE-A3 (1). Всего 14 эпитопов. 3. Чистота ДНК-конструкции составляет 99%. Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 8 Лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток • Выполнено сравнение методов выделения CD14+ моноцитов по соотношению качество/время/эффективность с использованием нескольких методов: проточная сортировка клеток, магнитная сепарация, адгезия к пластику. • Проведены эксперименты по выбору оптимального временного режима культивирования дендритных клеток и условия применения сочетаний цитокинов для получения незрелой и зрелой фракции дендритных клеток (ДК) с оценкой изменения фенотипических и функциональных характеристик клеток. В ходе выполнения работы было показано, что % из CD14+ клеток 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 магнитная проточная адгезия на сортировка сортировка пластике Процент CD14+ клеток в популяции моноцитов здоровых доноров после процедуры выделения. N=6. методы проточной и магнитной сортировки не отличаются по качеству и эффективности получаемой целевой фракции клеток. Достоинства методов: высокий выход целевой фракции клеток. Недостатки: высокая стоимость, временные затраты, сохранение в целевой культуре компонентов сепарации (антител или магнитных частиц) Адгезия на пластике. Недостатки: менее чистая культура целевых клеток Достоинства: низкая стоимость, низкие трудозатраты, отсутствие контаминации окрашивающими реагентами. Таким образом, при сравнении трех методов получения фракции клеток-предшественников дендритных клеток было решено использовать метод адгезии на пластике, как позволяющий получить достаточное количество CD14+ клеток, не вносящего сторонних примесей в целевую культуру и наиболее экономичного по временным и материальным затратам. % клеток CD11c+HLA-DR+ Лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток Для оптимизации протокола получения зрелых дендритных клеток апробированы 12 протоколов включающих различные сроки инкубации для получения незрелых дендритных клеток, различные стимулы для созревания дендритных клеток и различные сроки инкубации с созревающими стимулами. 95.0 90.0 85.0 80.0 75.0 70.0 65.0 60.0 55.0 50.0 Колоректальный рак Рак молочной железы Немелкоклеточный рак легкого 70.0 % клеток CD83+ 60.0 50.0 Для получения зрелых ДК от больных раком молочной железы и больных колоректальным раком был подобран протокол включающий: культивирование с IL-4 (100нг/мл) и GM-CSF (50нг/мл) 4суток, и добавление созревающего стимула TNF (25нг/мл) на 2 суток. 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 Колоректальный рак Рак молочной железы Немелкоклеточный рак легкого Для получения зрелых ДК от больных немелкоклеточным раком легкого культивирование с IL-4 (100нг/мл) и GM-CSF (50нг/мл) 4суток, и добавление созревающего стимула TNF (25 нг/мл) и IL-1β (10нг/мл) на 2 суток. Методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки -проведен сравнительный анализ эффективности различных методов доставки (магнитная трансфекция, нуклеофекция) ДНК-конструкции в дендритные клетки. -обоснован выбор стадии созревания ДК для проведения процедуры переноса генетического материала. Fitc+ 80 клеток 70 А 60 50 40 30 20 1.8 Индекс цитотоксичности 90 % 30 20 % GFP+ клеток 40 1.2 1 0 50 1.4 1.0 10 60 1.6 Б 1. 2. 3. 4. 5. 10 2 МНК МНК+ДК без трансфекции МНК+ДК, трансфицированные незрелых МНК+ДК, трансфицированные незрелых МНК+ДК, трансфицированные зрелых МНК+ДК, трансфицированные зрелых 3 4 5 6 магнитной трансфекцией на стадии методом нуклеофекции на стадии магнитной трансфекцией на стадии методом нуклеофекции на стадии 0 6. Магнитная Нуклеофекция трансфекция Оценка эффективности процедуры трансфекции выполнена методами FlowFISH (А) и по экспрессии тестовых плазмид, кодирующих GFP белок (Б). Показано отсутствие различий в эффективности переноса генетического материала. По причине особенностей метода нуклеофекции (стоимость, и закрытость системы) для дальнейших экспериментов нами выбран метод магнитной трансфекции. Наиболее эффективными для формирования противоопухолевого иммунного ответа являются дендритные клетки с магнитной трансфекцией на стадии зрелых клеток. Лабораторный регламент получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против опухолевых клеток - разработана методика окраски антиген-специфических клеток; -разработана методика магнитной сепарации Her2-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов; -оптимизированы условия культивирования и стимуляции пролиферации антиген-специфических Т-лимфоцитов; - оценена эффективность формирования специфического цитотоксического иммунного ответа по развитию прямого цитотоксического эффекта против опухолевых клеток. Ag-specific lymphocytes 1,7% CD 8+ 97,3% Разработанный протокол стимуляции с использованием ДК, трансфицированных плазмидой, кодирующей эпитопы белка Her2, позволяет получать до 2 % антиген-специфических Тлимфоцитов в культуре МНК. Эффективность метода магнитной сепарации составляет в среднем 97%. 80 Показано достоверное повышение цитотоксичности культуры антигенспецифических клеток против опухолевых клеток, по сравнению с общей культурой активированных ДК мононуклеарных клеток 60 40 % dead MCF-7 Для стимуляции пролиферации культуры антиген-специфических клеток подобраны условия коктейля цитокинов рчИЛ-2 (50нг/мл), рчИЛ-7 (50нг/мл) и рчИЛ-15 (50нг/мл). 20 0 1 2 3 1 - Контроль MCF-7 2 - Активированные МНК 3 - Антиген-специфические клетки Лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток (рак молочной железы) МНК – мононуклеарные клетки, МНК+ДК(0) – МНК, сокультивированные с дендритными клетками (ДК) без нагрузки антигеном, МНК+ДК(К) – МНК, сокультивированные с ДК, трансфицированные контрольной ДНК-конструкцией без опухолевых антигенов, МНК+ДК(Т) – МНК, сокультивированные с ДК, трансфицированные ДНКконструкцией, кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов, (n=14) Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 13 Эффективность получения мононуклеарных клеток в рамках лабораторного регламента получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток (рак молочной железы) Относительное содержание CD4+, CD8+, CD19+ и CD16+CD56+ в культуре мононуклеарных клеток, после культивирования с антиген-активированными дендритными клетками (n=4). - заявленное минимальное содержание по ТЗ Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 14 Влияние факторов ингибирования толерогенных реакций при сокультивировании дендритных клеток с мононуклеарными клетками онкобольных (колоректальный рак) ингибитор COX-2 ингибитор IDO Пролиферативная активность CD4+ и CD8+ лимфоцитов (пациент №1) Соглашение №<номер> - ингибитор IDO (1-methyl-L-tryptophan) ингибитор COX-2 (celecoxib) Цитотоксическая активность МНК при ссаживании с антиген-активированными ДК (пациент №1) Добавление ингибиторов IDO и COX-2 в совместную культуру МНК и антигенактивированных дендритных клеток приводило к снижению пролиферативной и цитотоксической активности МНК ФЦП ИР 2014-2020 15 Влияние ингибиторов IDO и COX-2 на противоопухолевую цитотоксическую активность мононуклеарных клеток при сокультивировании с антигенактивированными дендритными клетками (немелкоклеточный рак легкого) Добавление ингибиторов IDO и COX-2 в совместную культуру МНК и антигенактивированных дендритных клеток приводило к снижению цитотоксической активности МНК. Цитотоксическая активность МНК при ссаживании с антиген-активированными ДК и добавлении в культуру ингибиторов IDO и COX-2, (n=7). МНК - мононуклеарные клетки, МНК+ДК – мононуклеарные клетки, культивированные в присутствии антигенактивированных дендритных клеток, МТ – 1-метил-L-триптофан (ингибитор IDO) Сх – целекоксиб (ингибитор COX-2) Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 16 Влияние IL-12 и IL-18 на противоопухолевую цитотоксическую активность мононуклеарных клеток при сокультивировании с антиген-активированными дендритными клетками (колоректальный рак) Цитотоксическая активность МНК при ссаживании с антиген-активированными ДК и добавлении в культуру цитокинов (IL-12 и IL-18), (n=8). МНК - мононуклеарные клетки, МНК+ДК(0) - мононуклеарные клетки, культивированные в присутствии дендритных клеток, МНК+ДК – мононуклеарные клетки, культивированные в присутствии антигенактивированных дендритных клеток, МНК+ДК+IL12+и/или IL18 – мононуклеарные клетки, культивированные в присутствии антиген-активированных дендритных клеток и цитокинов (IL-12 и/или IL-18). ФЦП ИР Соглашение №<номер> 2014-2020 17 Разработка метода доставки ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухолеспецифических антигенов, в дендритные клетки с использованием маннозилированных катионных липосом 60 50 40 30 20 10 LF 2X3 M1 M2 M3 M4 M5 M6 незрелые ДК EGFP+ клетки, % предшественники ДК 2 60 50 40 30 20 10 LF 2X3 M1 M2 M3 M4 M5 M6 1.6 MFI, RFU MFI, RFU Доставка pEGFP-C2 Маннозилированными катионными липосомами EGFP+ клетки, % Катионные липиды были синтезированы к.х.н. Шмендель Е.В., д.х.н. Масловым М.А., МИТХТ им. М.В. Ломоносова (Москва) 1.5 1 1 0.5 0.5 LF 2X3 M1 M2 M3 M4 M5 M6 LF 2X3 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Определение адресности доставки ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухолеспецифических антигенов, с помощью маннозилированных катионных липосом в дендритных клетки D-манноза МЛ+ConA Специфическое связывание маннозилированных липосом (МЛ) с аналогом маннозного рецептора (ConA) in vitro время, с 1.7 раз 2.2 раза Активация анти-В16 цитотоксических лимфоцитов после системного введения комплексов липосом с РНК-В16 in vivo Эффектор/таргетное отношение Анализ активации воспалительного ответа на липоплексы, состоящие из маннозилированных липосом и ДНК-конструкций, in vitro и in vivo ИЛ-1β, пг/мл ИЛ-6, пг/мл ГМ-КСФ, пг/мл ФНО-α, пг/мл Состояние выполнения запланированных индикаторов № Наименование Индикаторы 1 Объем привлеченных внебюджетных средств Число публикаций по результатам проекта в научных 2 журналах, индексируемых в базе Scopus/Web of Science Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей 3 численности исследователей-участников проекта Число патентных заявок, поданных по результатам 4 проекта Показатели Число диссертаций на соискание ученых степеней, 1 защищенных по результатам проекта 2 Средний возраст исследователей - участников проекта Количество мероприятий по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в 3 которых приняла участие и представила результаты проекта организации-исполнитель проекта Количество используемых при проведении 4 исследований и разработок в рамках проекта уникальных научных установок Количество используемых при проведении 5 исследований и разработок объектов зарубежной инфраструктуры сектора исследований и разработок Количество центров коллективного пользования научным оборудованием, научное оборудование 6 которых использовалось при проведении исследований и разработок в рамках проекта Eдиница измерения Значение за текущий год Запланировано Достигнуто на текущий год на текущий год млн.руб 9,34 9,70378366 единиц 4 4 процентов 37,4 76,9 единиц 1 2 единиц 1 1 лет 44 35,4 единиц 1 3 единиц 0 0 единиц 0 0 единиц 2 2 Подготовлено 7 и опубликованы в 4 журналах, индексируемых Scopus и/или Web of Science: - Scandinavian journal of Immunology (импакт-фактор 1,882), - Journal of Controlled Release (импакт-фактор 7,261), - PLOS ONE (импакт-фактор 3,26), Соглашение №<номер> - Вопросы онкологии (импакт-фактор 0,316), ФЦП ИР 2014-2020 21 Спасибо за внимание! Докладчик: Ответственный исполнитель, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии НИИФКИ Курилин В.В. Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 22