Использование молекулярных методов диагностики в определении патогенов животных и птиц.

Использование молекулярных
методов диагностики в определении
патогенов животных и птиц.
Т. В. Гребенникова д.б.н., зав. лабораторией
молекулярной диагностики ФГУ «НИИ Вирусологии
им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России
Москва, 2010
 Использование молекулярных методик в
диагностике и профилактике РРСС
(практический аспект).
 Использование молекулярных методов
для изучение новых путей передачи
вирусов, передающихся аэрозольным
путем.
(теоретический аспект)
Использование молекулярных
методик в диагностике и
профилактике РРСС.
Респираторный и репродуктивный
синдром свиней
3
История РРСС
Загадочная болезнь свиней (mystery swine disease)
Впервые описана в 1987
 Заболевание впервые обнаружено в 1987 г. в Северной
Каролине
 Европа 1990 (Германия)
 Великобритания 1991 (Хамберсайд)
 Вирусная этиология
 Длительные исследования в США/Канаде, в Голландии
 Персистентная инфекция играет важнейшую роль в
передаче и выживании вируса в популяции животных
 Инкубационный период варьирует от 4-5 до 14-37 дней
(в зависимости от патогенности штаммов, дозы и пути
заражения)

Вирус РРСС повышает восприимчивость
организма к другим патогенам различной природы.
Цирковирус свиней и парвовирус (Loula 1991, Segales and
Domingo 2002).
Вирус гриппа А, респираторный короновирус, и вирус
энцефаломиокардита (Carlson J. 1992).
Парамиксовирус (Brun et al. 1992, Halbur et al. 1993).
Вторичные бактериальные инфекции: Haemophilus parasuis,
Streptococcus suis, Salmonella choleraesuis, Actinobacillus
pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella
multociada (Feng et al. 2001).
Заболевание имеет множество клинических проявлений .
Наиболее выраженными являются респираторный и
репродуктивный синдромы.
 Респираторные
Затрудненный выдох
 Интерстициальная
пневмония
 В основном поросята
Репродуктивные
 Аборт на позднем
сроке
 Смерть
новорожденных
Переходный цианоз
Окрашивание кожи
“синее ухо” - некроз





6
Вирус РРСС (PRRS) принадлежит
к семейству Arteriviridae
рода Arterivirus,
порядка Nidovirales.
Электронная микрофотография
вирусных частиц вируса РРСС.
Масштаб 23 нм (Snijder, E.J.)
Репликация вируса РРСС in vivo и in vitro
Вирус РРСС инфицирует in vivo макрофаги и моноциты, а также
зародышевые тестикулярные клетки.
Вирус РРСС выделен впервые в первичной культуре альвеолярных
макрофагов поросенка (PAMs) в 1991 г. (штамм Lelystad)
Два клеточных субклона MARC-145 и CL2621 (производные от
перевиваемой культуры клеток обезьяньей почки МА-104) используют
для размножения in vivo вируса РРСС.
Вызывает разрушение клеточного монослоя, (цитопатический эффект
проявляется как на культуре альвеолярных макрофагов , так и на
перевиваемых клеточных линиях)
Вирусные частицы отпочковываются в в гладком эндоплазматическом
ретикулуме аппарата Гольджи, аккумулируются там и высвобождаются
при экзоцитозе.
Электронная микрофотография вирусных частиц.
Kультура альвеолярных макрофагов, зараженная
вирусом РРСС. Масштаб 21 нм (Snijder, E.J.)
Альвеолярный макрофаг 6 недельного поросенка
9
Через 24 часа после инфицирования вирусом
РРСС
10
Через 48 часов после инфицирования вирусом
РРСС
11
Легкое
Иммуногистохимическое окрашивание
вируса РРСС в макрофагах легких
12
Геномная организация вируса РРСС
1а
2
1b
Трансляция
геномной РНК
Белок 1а
4
3
6
5
7
Белок 1б
процессинг
Неструктурные
белки
Геномная
репликация
Геномная РНК
Общая лидерная
последовательность
транскрипция
Структурные
белки
Образование вирусных частиц
Трансляция мРНК
Гетерогенность РРСС
 Два разных типа генома
 Тип 1 (Европейский) и Тип 2
(Североамериканский)
 Дивергентная эволюция (Nelsen et al, 1999)
 Структурно различны
 Постоянное различие в ORF7 (N)
1.
123 и 127 аминокислоты
 Различия в репликации
 Основные различия в ORF1a и 5’ NCR
14
Европа
Америка
15
France II-VI, IX
UK N01
France 225
NL Boxter 10
UK NY4
UK HA1
LELYSTAD VIRL
Poland 24.07, 3.07
Denmark 11192
UK BE1
UK LE1
France
Spain VACCINE
France 151, 296
Poland 11.07
Poland 4.07
UK NY3
UKL2
UK H2
France 292
Spain 5710 CL
Spain 28344,2228
Spain 4606
Spain PO35, 5999
Spain 3211
Spain 2156
Spain AV30, 92V058
Spain 705
Spain NL3-1
Spain 8d, 5a
Spain 6a
203 Rus,01
209 Rus, 86
206 Rus, 01
202 Rus,01
212 Bel,01
207 Bel, 01
201 Rus,92
211 Rus,01
208 Bel,01
204 Rus,01
210 Bel,01
205 Rus,01
US IL1
US IA6
China 1a
US 3927, ISU1
US KY1
US MO1
US SG1
US IA1
Canada 807/94, Qu8
Canada IAF EXP
China MD01
US MN1
Thailand F1.1
US U79
US KS1
US ISU55, ISU1
US 1894, ISU2
DK 516/1
NADC8
Denmark 350
DK 516/2
US ISU22
China S1
US Neb1
Canada PA8
US NE1
US VR2332
Филогенетические исследования
вирусных изолятов, выделенных на
территории России и Белоруссии.
444.2
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Филогенетические исследования
вирусных изолятов, выделенных на
территории России и Белоруссии.
Spain 5a
Spain 8d
Spain NL3-1
Spain
6a
203 Rus, 01
211 Rus, 01
201 Rus, 92
207 Bel,01
210 Bel, 01
212 Bel, 01
UK HA1
208 Bel, 01
204 Rus, 01
205 Rus, 01
Spain AV30
Spain
92V058
Spain 705
UK
NO1
UK
BE1
UK L2
LELYSTAD
202 Rus, 01
206 Rus, 01
UK
NY4
209 Rus, 86
25D
K
Spain 2156
Spain
Spain2228
Spain 28344
Spain
5710CL
Spain
5999
Spain PO35
Spain VACCINE
Poland 24.
07 Spain 3211
Poland 3. 07
4606
Poland 11.
07
7.6
6
Poland 4. 07
4
2
0
Передача
 Аэрозоль
 Прямой контакт
1.

Трансплацентарная передача
1.

Обувь, грузовики, иглы для вакцинации и.т.д.
С воздухом
1.

На позднем сроке супоросности = плоды-вирусоносители
Через предметы и транспорт
1.

От носа к носу, слюна – препятствует передаче или нет?
Очень ограниченно – внутри одного хозяйства
Сперма
□
Хорошо доказано и, вероятно, это главный фактор всемирного
распространения вируса
 Чувствителен к обычным дезинфектантам
Репликация вируса и иммунный ответ
Zimmerman, J., www.porkboard.org
19
Диагностика РРСС – выделение вируса
 Трудоемкий метод
 Лучший источник - сыворотка
1.

Длительная виремия
1.
2.
3.

Смыв из лёгких также пригоден
Можно выделить вирус до 35- 50+ дней после заражения
Инфекция длится долго: лучший возраст 6-8 недель
Наличие антител способствует вирусовыделению
Использование альвеолярных макрофагов
свиньи
□
□
Можно использовать клетки MARC145 – для американского
генотипа
□ Антитела мешают инфекции
Европейские штаммы могут быть адаптированы
Вирус РРСС,
культивируемый в:
Клетках MA104
Альвеолярных макрофагах
21
Новые методы диагностики
 Серология

ИФА на основе рекомбинантного антигена
1.
2.
Используется белок нуклеокапсида
Синтезируется в E. coli или в бакуловирусе
 Выявление вируса

ОТ-ПЦР
1.
2.
3.
4.
5.
ORF7, ORF 1b
Может быть универсальным или дифференцирующим
Taq man – флуоресцентные пробы
Real-time – в реальном времени – количественный
Исследуют сперму, кровь. ткани
Разработка теста для определения антител к
вирусу РРСС
Разработан набор реагентов для определения антител к
вирусу РРСС методом непрямого ИФА
Разработка тест-системы на основе ПЦР в
реальном времени для определения вируса РРСС
Множественная ПЦР в реальном времени
Результаты определения РНК вируса РРСС европейского и
американского генотипа методом ПЦР в реальном времени
Диагностическая чувствительность тест-системы1ТЦИД50/ мл.
Разработка тест-системы для количественного
определения вируса РРСС
ст
∆Rn
Базовая линия
LogN
Ст – пороговый цикл
Его величина зависит:
1.
2.
От исходного количества копий матрицы
Эффективности амплификации
Калибровочный график,
позволяющий определять
количество вируса в
пробе.
0 дней
7 дней
9 дней
30 дней
РРСС – новый для свиней вирус:
 Быстрая эволюция продолжается
 На больших фермах могут быть несколько штаммов вируса


Контакт с одним штаммом может не вызвать защиты от других
Вакцины могут быть не эффективны
 Отношение вирус-хозяин меняются


Вирусоносительство может удлиняться
Увеличение вирулентности может привести к другим болезням?
 Текущая ситуация не статична, она изменяется
27
Система обратной генетики для внесения
целенаправленных генетических изменений в
РНК-геном вирусов
Инфекционный вирус
Инфекционный РНК геном
Библиотека полноразмерных копий
кДНК генома
Инфекционный РНК геном
Инфекционный вирус
Библиотека полноразмерных копий генома
аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС
T7 промотор
ПЦР-продукты
5425 п. о.
1258 п. о.
10745 п. о.
pACYC177 с геномом РРСС
кДНК геном
799 п. о.
После отбора было
получено 32
плазмиды
Рекомбинантные копии РНК вируса РРСС
Получение рекомбинантного вируса РРСС с
использованием РНК, синтезированной in vitro
T7
T7 РНК полимераза
+ цепь RNA
5’
Трансфекция или
электропорация
клеток
Рекомбинантный
вирус
Накопление рекомбинантного вируса в процессе
пассирования на перевиваемой клеточной линии
MARC-145
Плазмида 257
Плазмида 93
пассаж 1
пассаж 2
пассаж 3
пассаж 4
пассаж 5
 Использование молекулярных
методов для изучение новых
путей передачи вирусов,
передающихся аэрозольным
путем.
 Ранее,
было обнаружено,
что существует мощный путь
переноса
вещества
с
аэрозолями, генерируемыми
водной поверхностью.
 Он был показан для тяжелых
металлов,
биотоксинов,
органических веществ.
(ФГУ Государственный
Океанографический институт им.
Н. Н. Зубова (ГОИН)).
Экспериментальное изучение переноса
вирусов на границе вода-воздух.
 Использовали два модельных вируса
(вирус гриппа А и РРСС(Arteriviridae))
 Отбирали пробы объемной воды и
конденсата с крышки сосуда через 1 час, 3
часа, 8 часов и 24 часа после начала
опыта.
 Исследовали методом ПЦР и ПЦР в
реальном времени
Обнаружена спонтанная генерация аэрозолей
с водной поверхности:
перенос в воздушную среду РНК-вирусов
Стабилизация вируса РРСС при
взаимодействии с водными гидробионтами.
 Пробы культуральной жидкости и
Культура
Daphnia
magna
вРРСС
дафний отбирали через 1 час, 3 часа,
1 сутки, 2 суток, 3 суток.
 Показано, что вирус сохраняется в
дафниях до 3 суток, т.е. зоопланктон
может выступать как временное депо
для вирусов.
Итоги изучения вирусов in vitro
 Обнаружена спонтанная генерация РНК-
вирусов c аэрозолями с водной
поверхности
 Показано, что дафнии, входящие в состав
зоопланктона, могут выступать как
временное депо для вирусов.
Экспедиционные исследования переноса
вирусов на границе вода-воздух в местах
скопления кочевых и перелетных птиц.
 Заповедник Семь Островов (Кольский п-ов) (2007-2008)
 Полуостров Ямал (2007-2008)
Заповедник Семь Островов
(~5000 птиц на одну бухту)
Чайка маевка (Rissa) ~ 60%, Тонкоклювая кайра (Uria aalge) ~ 30%
Толстоклювая кайра (Uria lomvia) ~ 10%).
Полуостров Ямал
Серый гусь (Anser anser) .
Kara
sea
Yamal
Результаты
Отбор ПМС капиллярным
пробоотборником и
сеткой Гаррета
Отбор аэрозолей
Исследовано 600 проб поверхностного
микрослоя
(ПМС),
зоопланктона,
объемной воды, донных отложений и
аэрозолей.
В отобранных пробах ПМС (200-1000
мкм), зоопланктона и в пробах аэрозоля
заповедника Семь Островов и на Ямале
обнаружен вирус гриппа
А (7%
положительных проб)
В пробах объемной воды и донных
отложений вирус не обнаружен.
В 2008 г. в заповеднике Семь Островов
обнаружен вирус гриппа А подтипа Н7.
Итоги изучения вирусов in vivo
 Наличие вируса гриппа А в поверхностном
микрослое доказывает существование
механизмов концентрирования вируса на
межфазных границах
 Наличие вируса гриппа А в морских аэрозолях
показывает существование переноса вируса с
аэрозолями, генерируемыми водной
поверхностью
 Наличие вируса гриппа А в зоопланктоне
указывает существование механизмов
временного депонирования вируса.
 Обнаружено,
что
существует
путь
переноса вирусов с
аэрозолями,
генерируемыми
водной
поверхностью.
Кинетическое моделирование
воздух
V - вирус
Z – зоопланктон
B – птицы
k - константы
ПМС
Объемная вода
m k-VB
Vw = _______________________________________
a 0kd exp(dEa/RT) - 0ka exp(aEa/RT)
Зависимость концентрации вируса гриппа А
в ПМС от температуры согласно численному
решению представленной модели
Потепление Западной
Арктики
Спутниковые и реальные фотографии
Западной Арктики (Земля Франция Иосифа)
2004-2008
Полученные
данные
позволят
получить
дополнительные сведения о механизмах передачи
вирусов, передающихся с аэрозолями и том, какие
изменения могут произойти в экологии вирусов в
условиях глобального изменения климата (Global
Climate Change) на примере потепления Западной
Арктики.
Спасибо за внимание