019365 B1 019365 B1 (11) 019365

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
019365
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2014.03.31
(21)
(51) Int. Cl. G01N 33/483 (2006.01)
C12N 5/0775 (2010.01)
Номер заявки
201201629
(22)
Дата подачи заявки
2012.10.02
(54)
СПОСОБ АКТИВАЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ПОВЫШЕНИЯ
ИХ УСТОЙЧИВОСТИ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ
(74)
Представитель:
Кудаков А.Д. (RU)
019365
B1
(57)
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, фармакологии, клеточной биологии
и биоинженерии и к другим отраслям биологии и медицины, в которых используются стволовые
и прогениторные клетки разного уровня дифференцировки и зрелые дифференцированные
клетки различных тканей, в частности, для ускоренного создания биоимплантов из донорских
или аутоиммунных стволовых клеток человека и/или животных. Техническим результатом,
на получение которого направлено изобретение, является активация пролиферации стволовых
клеток и повышение устойчивости к неблагоприятным воздействиям стволовых клеток человека
и животных, не связанное с негативным воздействием высокочастотного электромагнитного
поля. Технический результат достигается с помощью обработки культуры клеток слабым
магнитным полем низкой частоты, коллинеарным постоянному магнитному полю Земли. При
осуществлении способа наблюдается: 1) увеличение количества стволовых клеток человека в
культуре после их экспозиции в слабом магнитном поле в течение характерного для данной
культуры клеток полупериода удвоения, например за 24 ч количество клеток возрастает более
чем в 2,5 раза (при полном периоде удвоения взятых интактных клеток, равном 48 ч); 2)
повышение амплитуды собственного магнитного излучения первичной культуры стволовых
клеток, измеряемое магнитометром типа СКВИД, свидетельствует об их возросшей активности; 3)
повышение в 2 раза устойчивости стволовых клеток человека относительно развития апоптоза и
синхронизация клеток преимущественно в фазе G1 клеточного цикла.
B1
(56)
БЕЛОВА Н.А. Первичные мишени
во взаимодействии слабых магнитных полей
с биологическими системами. Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора
биологических наук. Пущино, 2011, с. 4, строки
21-24, 26-30, с. 5, строки 14-16, с. 6, строки 15-19,
с. 10, абзацы 4-7, с. 11, абзацы 3-6, с. 13, абзац 3, с.
15, абзац 1, с. 16, табл. 2, с. 22, рис. 6
ТИРАС X.П. и др. Влияние слабого
комбинированного магнитного поля на скорость
регенерации планарий DUGESIA TIGRINA,
Биофизика, т. 41, вып. 4, 1996, с. 826-831, реферат,
с. 826, абзац 1, с. 827, абзацы 2-3, с. 828, абзацы 3-6,
с. 829, абзацы 1-3, с. 830, абзацы 2-3
ЕРМАКОВ A.M. и др. Модуляция
пролиферативной активности стволовых клеток,
регенерирующих
планарий
с
помощью
магнитных
полей
и
фармакологических
агентов. Тезисы докладов Всероссийской и
международной научной конференции "Стволовые
клетки и перспектива их использования в
здравоохранении". Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН, Москва.
2007, (он-лайн) [найдено 2013-04-26]. Найдено в
Интернет:
019365
(43) 2014.02.28
(96) 2012000208 (RU) 2012.10.02
(71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и патентовладелец:
ОРЛОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА;
МАЕВСКИЙ ЕВГЕНИЙ
ИЛЬИЧ; КЛУБКОВ ВЛАДИМИР
КОНСТАНТИНОВИЧ (RU)
019365
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, фармакологии, клеточной биологии и
биоинженерии и может быть использовано в других отраслях биологии и медицины, в которых используются стволовые и прогениторные клетки разного уровня дифференцировки и зрелые дифференцированные клетки различных тканей, в частности, для ускоренного создания биоимплантов из донорских
или аутоиммунных стволовых клеток человека и/или животных.
Предлагаемый способ предназначен для активации пролиферации стволовых клеток и повышения
устойчивости к неблагоприятным воздействиям тканей человека и животных.
В настоящее время существует большое число технических решений, в которых предлагаются различные способы биофизического воздействия на клетки растений и животных (патент РФ № 2332841,
опубликован 10.09.2008; патент РФ № 2314844, опубликован 20.01.2008; патент РФ № 2174850, опубликован 20.10.2001; патент РФ № 2049501, опубликован 10.12.1995; патент РФ № 2158147, опубликован
27.10.2000). Общие недостатки, объединяющие эти изобретения, заключаются в длительности воздействия (не менее 3 суток), многостадийности методов и воздействии на биоматериал экстремальными нагрузками.
Наиболее близким к предлагаемому нами способу является патент РФ № 2405599 (опубликован
10.12.2010). Способ по патенту РФ № 2405599 включает облучение биообъекта внешним электромагнитным полем с изменяемыми параметрами. Облучение осуществляют в живом организме в зоне анатомического расположения красного костного мозга электромагнитным излучением крайне высокой частоты
в диапазоне 35-80 ГГц, с поверхностной плотностью потока энергии в диапазоне 0,1-10 мВт/см2, модулированным по амплитуде, с изменением частоты модуляции в диапазоне 4-10 Гц. Плотность потока 0,1-10
мВт/см2. Способ обеспечивает активацию образования стволовых клеток красного костного мозга при
одновременной стимуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток красного костного
мозга в организме.
Недостатком изобретения является то, что электромагнитное излучение гигагерцовых частот является опасным воздействием по отношению к биологическим объектам, в частности к несущим законсервированную в нуклеопротеидах стволовых клеток генетическую информацию, жестко сохраняемую в
отличие от клеток другого рода.
Техническим результатом, на получение которого направлено изобретение, является активация
пролиферации стволовых клеток и повышение устойчивости к неблагоприятным воздействиям стволовых клеток человека и животных, не связанное с негативным воздействием высокочастотного электромагнитного поля. Технический результат достигается с помощью обработки культуры клеток слабым
магнитным полем низкой частоты. В предлагаемом способе действующим фактором является слабое
переменное магнитное поле, коллинеарное полю Земли, магнитная индукция В и частота f которого определяется формулой, предложенной В.В.Ледневым (Леднев В.В. "Биологические эффекты крайне слабых переменных магнитных полей: идентификация первичных мешеней". В книге "Моделирование геофизических процессов". 2003, 130-136),
где BDC и BAC - величины магнитной индукции постоянной (от поля Земли) и переменной компонент поля (задаваемой магнитным генератором) соответственно;
ƒ - частота переменной компоненты.
При этом частоты ƒ переменного магнитного поля, известные как резонансные для иона Са2+ в
клетке, выбирались из диапазона f=25-42 Гц.
Использованное низкочастотное магнитное поле не обладает резонансно-разрушительными свойствами, сравнимо по величине напряженности с магнитным полем Земли и коллинеарно ему.
Достижение технического результата в способе подтверждается тем, что в стволовых клетках человека, подвергшихся облучению по предлагаемому нами способу, происходит активация целого ряда
внутриклеточных процессов, а именно, поляризация клеточной мембраны, изменение суммарного дипольного момента клетки, активация (ускорение) процесса удвоения центриолей, а также изменение ориентации митотического веретена и структурно-функциональные перестройки факторов стволовости [Орлова Е.В. "Влияние структурно-функциональных особенностей факторов стволовости на ассиметричное
деление клетки и регуляцию апоптоза". Биомедицинский журнал Medline.ru, 2009, т. 10, с. 113-126.], совокупность действия которых подготавливает стволовые клетки к направленной дифференцировке и ускоренной пролиферации в задаваемом направлении.
На фиг. 1 показано увеличение количества мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека после их облучения в переменном магнитном поле BAC=89,4 мкТл; частота f=37,1 Гц; температура термостатируемой ячейки 37°С в течение 24 ч (половина от стандартного срока периода удвоения) - (А - среда
окислена, имеет светло-коричневый цвет), по сравнению с клетками, культивируемыми без воздействия
низкочастотного магнитного поля (Б - среда кондиционирована, имеет цвет стандартный для α-МЕМ).
На фиг. 2 приведены результаты проточной цитометрии культуры стволовых клеток, обработанной
согласно предлагаемому способу, А - контроль, Б - культура после обработки предложенным способом.
На фиг. 3 представлены результаты электрофореза и продуктов ПЦР.
-1-
019365
Пример реализации способа.
Эксперимент проводился на мезенхимальных стволовых клетках (МСК), выделенных из жира человека (предоставлены компанией "Биолот", СПб). Период удвоения этих клеток исходно составляет порядка 48 ч. Клетки были взяты в 3 пассаже и помещены в культуральные флаконы Т25 со стандартной для
этого типа клеток средой α-МЕМ. Поставлены следующие эксперименты: опыт и контроль, в каждом из
которых использовали порядка 200 тыс. кл./мл.
В эксперименте было измерено постоянное магнитное поле Земли, которое составило BDC=48,6
мкТл; и с помощью намагничивающей системы было установлено переменное магнитное поле BAC=89,4
мкТл; частота f=37,1 Гц, коллинеарное полю Земли согласно приведенной выше формуле
где BAC - амплитуда внешнего магнитного поля, Тл;
f - его частота, Тл;
время облучения 24 ч, температура термостатируемой ячейки 37°С.
В приведенном эксперименте далее клетки были пересажены в экспериментальные ячейки в экстремальных условиях при повышенной плотности, близкой к максимальной для данного типа клеток.
При этом микроскопирование выявляет эффект уменьшения числа дендритных отростков, и клетки выстраиваются в колонны, появление которых является первым визуальным показателем готовности клеток
к дифференцировке в фибробласты (т.е. создавались неблагоприятные условия, которые повышали вероятность утраты культивируемыми клетками свойств стволовых клеток). Через 24 ч экспозиции в слабом
магнитном поле (вне CO2-инкубатора, без стабилизации рН среды) наблюдалось увеличение числа дендритных отростков у клеток до базального уровня стандарта для данной культуры стволовых клеток, т.е.
максимальное ветвление дендритов и распластывание клеток наблюдались даже при наличии окисленной среды (фиг. 1А). При этом в опыте происходило увеличение количества клеток в 2,8 раза, т.е. происходило ускорение роста культуры (фиг. 1), несмотря на некондиционные условия культивирования.
Таким образом, обработка клеток с помощью низкочастотного магнитного поля в выбранном диапазоне с вышеописанными входными значениями не только ускоряет рост культуры стволовых клеток
человека в 2,8 раза, но и минимизирует действие негативного сдвига рН, поддерживая пролиферацию и
дифференцировку. Иными словами, в данной системе реализуется некое условие отбора на собственную
стабильность системы (минимизируется суммарная энтальпия системы (клетки)), и, как следствие, минимизируется спонтанное возмущения в системе, вызванное, например, неоптимальным режимом культивирования. Повышение амплитуды собственного излучения первичной культуры стволовых клеток,
зафиксированное с помощью СКВИД-магнитометра, свидетельствует об их возросшей активности.
Обработанные стволовые клетки в меньшей мере подвергаются апоптозу и совершают более синхронные переходы по фазам клеточного цикла, что иллюстрируется фиг. 2.
Также были проанализированы результаты экспрессии генов после активации пролиферации в переменном магнитном поле в течение характерного для данной культуры клеток полупериода удвоения
стволовых клеток человека. В контрольных и опытных клетках сравнивали уровни мРНК для исследования экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, процессов пролиферации, дифференцировки, клеточной гибели: cyclinD1 (официальный символ: CCND1), cyclinE1 (CCNE1), p21/waf
(CDKN1A), ErbB3 (ERBB3), ki67 (MKI67), MDR1 (ABCB1), p16 (CDKN2A), p27/kip (CDKN1B), YB1
(YBX1), bax (BAX), bak (BAK1), bclXL (BCL2L1), bc12 (BCL2), fos (FOS), myc (MYC), ras (HRAS1), bag
(BAG1).
Выделение тотальной РНК.
Для анализа были представлены суспензии контрольных и опытных клеток (~10-12×106). Клетки
центрифугировали 10 мин при 4000 g, клеточные осадки ресуспендировали в 2 мл лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидинизотиоцианата, 0,02 М цитрата натрия, 0,5% саркозила, 0,1М меркаптоэтанола. Затем добавляли 1/10 часть 1М ацетата натрия рН 4,4. После перемешивания добавляли равный
объем фенола, уравновешенного водой, и 1,5 объема смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1).
Смесь перемешивали на вортексе и инкубировали 15 мин при 2-8°С. Далее пробирки центрифугировали
в бакет-роторе 20 мин при 4000 g с охлаждением. Верхнюю фазу переносили в другую пробирку. К ней
добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ (2:1), перемешивали на вортексе и повторно центрифугировали 20 мин при 4000 g. К верхней фазе добавляли равный объем изопропилового спирта и оставляли на ночь при -20°С. Затем центрифугировали 20 мин при 4000 g, осадок промывали 80% этанолом и
растворяли в 100 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом. К раствору РНК добавляли 1/20 объема 4М LiCl и 2 объема этанола. Выделенную РНК хранили при -20°С. Концентрацию выделенной РНК
измеряли с помощью спектрофотометра Smartspec plus (BioRad).
Проведение реакции обратной транскрипции.
Осадок РНК (10 мкг) под этиловым спиртом промывали 1 мл 80% этанола и растворяли в 12 мкл
воды. В пробирку добавляли 1 мкл 10 mM oligodT и инкубировали при 70°С в течение 5 мин. После охлаждения на льду в течение 5 мин смесь оставляли при комнатной температуре 15 мин. Затем добавляли
4 мкл 5Х буфера для обратной транскрипции, 2 мкл 10 mM dNTP, 1 мкл обратной транскриптазы Revert
-2-
019365
Aid (Fermentas ). Реакцию проводили в течение часа при 42°С. Образцы хранили при -20°С.
Полимеразная цепная реакция:
Амплификацию исследуемых генов проводили в смеси следующего состава:
10XTaq буфер(Fermentas) - 2 мкл
25 mM MgCl2 - 1,6 мкл
10 mM dNTP - 0,4 мкл
10 mM праймер 1 - 0,2 мкл
10 mM праймер 2 - 0,2 мкл
Taq полимераза (5U/мкл) (Fermentas) - 1 мкл
ДНК (продукт обратной транскрипции) 3 мкл вода - 1,6 мкл
в амплификаторе MasterCycler gradient (Eppendorf) в следующих условиях:
Подбор олигонуклеотидных праймеров и условий для проведения ПЦР производился с использованием программы Oligo 4.0. Для проведения ПЦР использовали следующие праймеры:
Для подтверждения равного количества нуклеиновых кислот в исследуемых образцах проводили
-3-
019365
амплификацию гена актина с соответствующими праймерами
Электрофорез и количественная оценка продуктов ПЦР. Продукты ПЦР-реакции разделяли в 6%
полиакриамидном геле (состав: 1,4 мл 30% раствора АА, 1,4 мл 5Х буфера ТВЕ, 4,2 мл дист. воды, 30
мкл 10% аммония персульфата (APS), 20 мкл ТЕМЕД.) в 1ХТВЕ буфере (0,089 М Трис, 0,089 М Борная
кислота, 0,002 м EDTA рН 8,3) 40 мин при 20 мА. После окрашивания раствором бромистого этидия (1
мкг/мл) гели фотографировали и оценивали количественно с помощью программы TotalLab V2.01. в
сравнении со стандартными образцами. Для этого стандартные образцы с известной концентрацией комплементарных ДНК титровали на полиакриламидном геле. После сканирования геля интенсивность полос количественно измеряли с помощью программы. Затем строили калибровочный график, по которому
определяли относительные количества исследуемых ампликонов.
Количественная оценка результатов, приведенных на фиг. 3, (А) - относительно контроля (1) в
опытных клетках (2) было обнаружено изменение количества мРНК следующих генов: ki67 - 4x увеличение; р27 - 2х увеличение; bax - 1,5х увеличение; bclX - 1,5x увеличение; bcl2 - 2х увеличение; fos - 2x
увеличение; bag - 1,7x увеличение.
Таким образом, активация антиапоптотических генов более выражена, чем проапоптотических
(bax), но при этом следует учитывать, что апоптотические белки Вах и Bak могут образовывать стабильные, блокирующие апоптоз конгломераты с антиапоптотическими белками, например BclX и Bcl2.
Кроме того, в опытных клетках был de novo показан синтез мРНК генов MDR и bak (см.фиг. 3Б).
Повышенная экспрессия MDR связана с устойчивостью к лекарствам клеточных культур млекопитающих [Croop JM 1993. P-glycoprotein structure and evolutionary homologies. Cytotechnology 12:1-32].
При этом экспрессия генов cyclinD, cyclinE, p21(WAF), ErbB3, p16, YB1, myc, ras не изменилась
(см.фиг. 3В), что указывает на факт отсутствия способности активированных вышеуказанным образом
стволовых клеток к трансформации в опухолевые (при наличии подобной возможности происходит активация вышеуказанного ряда циклинов).
Таким образом, подтверждается достижение технического результата:
1) увеличение количества стволовых клеток человека в культуре после их экспозиции в слабом
магнитном поле в течение характерного для данной культуры клеток полупериода удвоения, например за
24 ч количество клеток возрастает более чем в 2,5 раза (при полном периоде удвоения взятых интактных
клеток, равном 48 ч);
2) повышение амплитуды собственного магнитного излучения первичной культуры стволовых клеток, измеряемое магнитометром типа СКВИД, свидетельствует об их возросшей активности;
3) стволовые клетки человека, после экспозиции в слабом магнитном поле в течение характерного
для данной культуры клеток полупериода удвоения, в 2 раза более устойчивы относительно развития
апоптоза и синхронизируются преимущественно в фазе G1 клеточного цикла.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ активации пролиферации и повышения устойчивости к неблагоприятным воздействиям
культивируемых стволовых клеток, заключающийся в воздействии на стволовые клетки переменного
магнитного поля, отличающийся тем, что переменное магнитное поле прикладывается коллинеарно магнитному полю Земли, при этом частота переменного магнитного поля задается в пределах от 25 до 42 Гц,
а его амплитуда задается в пределах от 75 до 110 мкТл.
Фиг. 1
-4-
019365
Фиг. 2
Фиг. 3
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-5-