Оптический биосенсор BIACORE

реклама
ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН
Оптический биосенсор BIACORE:
анализ межмолекулярных
взаимодействий in vitro
проф. А.С.Иванов
ivanov@ibmh.msk.su
Москва - 2005
1
Оглавление
1.
Устройство оптического биосенсора
на примере BIACORE 3000.
2.
Эффект поверхностного плазмонного
резонанса.
3.
Принцип измерения
межмолекулярных взаимодействий.
4.
Оптические чипы.
5.
Области применения оптического
биосенсора.
2
http://
www..biacore.
http://www
biacore.com
BIACORE 3000
BIACORE S51
BIACORE C
BIACORE T100
BIACORE FLEXCHIP
BIACORE X
BIACORE J
BIACORE A100
3
BIACORE 3000
4
Пять высоких технологий в одном приборе
Robotic Technology
BIACORE 3000
SPR (Surface Plasmon Resonance)
Detection System
Laser Technology
Sensor Chip:
Gold-Dextran Surfaces
Microfluidic System
5
Поверхностный плазмонный резонанс
Surface Plasmon Resonance (SPR)
Эффект полного внутреннего отражения
REFRACTION
T OTAL INTERNAL REFLECTION
θ
θ
Incident angle (
θ) < critical angle for TIR
Incident angle (
θ) > critical angle for TIR
™ Фотоны не пересекают преломляющую поверхность,
но их электрическое поле выходит за нее примерно
на 1/4 длины волны
6
Поверхностный плазмонный резонанс
Если отражающая поверхность покрыта тонким слоем
золота (~
(~1/4 λ), фотоны могут взаимодействовать со
свободными электронами в металле
1
4
λ
Free Electrons
Plasmons
λ
При определенных условиях фотоны могут превращаться в
плазмоны и свет, соответственно, в этом случае не
отражается
7
Поверхностный плазмонный резонанс
Условие эффекта SPR: горизонтальная
составляющая вектора фотона должна быть равна
вектору плазмона – происходит резонанс и
поглощение фотона
Incident light vector ° Surface plasmon vecto
Incident light vector = Surface plasmon vect
Mismatch:No resonance
Full Reflection
•
Match: Resonance
Minimum Reflection
•
• surface
• Gold
Gold surface
• θ1
• θ2
θ1
Angle
θ2
Angle
8
Регистрации межмолекулярного взаимодействия с помощью SPR
™ Электрическое (эванесцентное) поле плазмона выходит в среду за
слой золота.
™ Подвижность плазмона и, следовательно, величина его вектора и
SPR угла, зависит от взаимодействия эванесцентного поля со
средой за зеркалом.
Т.о. с помощью SPR можно «заглянуть в зазеркалье».
™ Величина резонансного угла пропорциональна коэффициенту
преломления в тонком слое среды (до 300 нм) за золотом.
™ По изменению резонансного угла можно регистрировать
массоперенос любых веществ между свободной средой и этим
слоем.
9
Сигнал SPR линейно пропорционален коэффициенту
оптического преломления в зоне измерения и массе
аналита независимо от его химической природы
10
Терминология Biacore
Лиганд – партнер взаимодействия, иммобилизированный на
поверхности чипа
- биологические макромолекулы (белки, НК, …),
- низкомолекулярные соединения,
- молекулярные комплексы,
- мембранные системы,
- вирусы, клетки, …
Аналит – свободный партнер в растворе
(от простых веществ до клеток)
аналит
аналит
лиганд
лиганд
связка
11
Регистрации межмолекулярного
взаимодействия с помощью SPR
™ На поверхности золота в зоне измерения закрепляется
«лиганд»
™ SPR регистрирует массоперенос «аналита» между средой и
зоной измерения (в обе стороны)
™ В реальном времени регистрируются:
- кинетика связывания,
- кинетика распада комплексов
™ Математическая обработка кривых дает
значения констант скоростей ассоциации и
диссоциации, а также величину Kd.
12
Как в биосенсоре BIACORE
BIACORE реализовано измерение?
измерение?
Свет лазера фокусируется на сенсорной поверхности и
связывание «аналита» регистрируется по изменению
резонансного угла (эффект SPR)
Сенсорная поверхность реализована в виде
специального чипа, содержащего:
- часть оптической схемы,
- тонкий слой золота,
- систему иммобилизации «лиганда».
13
Регистрации межмолекулярного
взаимодействия с помощью SPR
14
Оптический чип BIACORE
чип
Большой набор чипов для разных целей
пенал
Чип серии S
15
Варианты иммобилизации «лиганда»
– Прямая химическая иммобилизация (ковалентная)
– Непрямая аффинная иммобилизация (антитела, хелаты,
рецепторы, биотин/авидин, …)
– Мембранные системы (липидный монослой, липидный
бислой, липосомы)
16
Стандартный оптический чип СМ5
- поверхность золота покрыта карбоксилированным декстраном
- химическая (ковалентная) иммобилизация «лиганда» за группы:
-NH2, -SH, -CHO, -COOH
17
Оптический чип SA
стрептавидин
- поверхность покрыта стрептавидином
- иммобилизация любых биотинилированных
биотин
лигандов (ДНК, белки, липиды, …)
Kd ~ 10-14 M
18
Оптический чип NTA
NTA - NitriloT
itriloTriacetic Acid
- Связывание лигандов,
лигандов, содержащих HisHis-tag,
tag,
путем образования хелата с ионами никеля
19
Оптический чип HPA
- плоская гидрофобная поверхность
- формирование липидного монослоя
20
Оптический чип L1
- гидрофобизированный декстран
- формирование липидного бислоя
- иммобилизация липосом
21
BIACORE
Оптический чип В1
В1
- низкая степень карбоксилирования
- низкое неспецифическое связывание молекул с высоким
положительным зарядом (например, культуральные
супернатанты)
супернатанты)
Оптический чип F1
- укороченный декстран
- работа с аналитами большого размера
(клетки,вирусы, …)
Оптический чип С1
С1
- плоская карбокисметилированная поверхность
- работа с крупными компонентами (клетки, вирусы, …)
Оптический чип J1
- поверхность золота
- создание собственных вариантов поверхностей
и химии иммобилизации
22
Микрожидкостная система
BIACORE
• Малый расход реактивов
• Эффективный массоперенос
• Низкая дисперсия
• Высокая воспроизводимость (ошибка - менее 1%)
• Широкий диапазон времени эксперимента,
от 1 с до 12 час
• Возможность сбора образцов и фракционирования
• Измерительные микро-кюветы
• Пневматические микро-клапана
23
Проточные кюветы
BIACORE
• 4 измерительных канала (кюветы)
• объем кюветы 0,02 мкл ( 2х10-8 л = 20 нл ! )
• все каналы - индивидуальны
• возможны различные варианты коммутации
каналов
F1
F1 & 2
F2
F3 & 4
F3
F1 - 3
F4
F1 - 4
24
Микрожидкостная система
25
Сенсограмма
26
Карта скоростей on-off
10 pM
100 pM
1 nM
KD
10 nM
KD = koff/kon
100 nM
107
1 μM
106
kon (M-1s-1)
10 μM
105
100 μM
104
1 mM
103
102
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
koff (s-1)
27
Ингибиторы протеазы ВИЧ (HIV-p)
10 pM
100 pM
1 nM
KD
10 nM
100 nM
B376
27 nM
107
kon (M-1s-1)
106
105
1 μM
U75875 B369
B388
RitAmp
B322
Ind
B355
Saq Nelf
B425
B408
B295
B4
A018
40B409
B365
B268
B429
B412
A015
A03 B439 B435
7
A017
B249
A038
10 μM
100 μM
104
B347
1 mM
103
102
0.0001
B277
0.001
0.01
A016
0.1
1
koff (s-1)
28
Программное обеспечение BIACORE
™ BIAControl
полный контроль работы
биосенсора и
запись сенсограмм
™ BIAEvaluation
Кинетический анализ
сенсограмм
™ BIASimulation
Моделирование
различных вариантов
взаимодействия
29
Программное обеспечение для обработки сенсограмм
The University of Utah
CLAMP
30
Области научного применения оптического биосенсора
™ Анализ межмолекулярных взаимодействий
ƒ Белок – белок
ƒ Белок – низкомолекулярный лиганд
ƒ Рецептор – лиганд
ƒ Белок – ДНК (РНК)
ƒ ДНК (РНК) – ДНК (РНК)
™ Анализ взаимодействий в надмолекулярных системах
ƒ
Искусственные липидные системы (монослои, бислои,
мицеллы, липосомы)
ƒ Биомембраны
ƒ Внутриклеточные частицы
ƒ Вирусы, бактерии, клетки, липопротеины, …
™ Идентификация партнеров взаимодействия (fishing)
31
FIG. 5. Docking prediction for sulfated monosaccharides with human
endostatin, which was represented with its Connolly surface colorcoded according to the electrostatic potential (from blue for negative
to red for positive areas). Low energy binding modes were represented
for the three monosaccharides, 1 (A), 2 (B), and 3 (C). D, ribbon
representation of endostatin structure showing the basic amino acids
forming basic clusters at the surface of the protein.
32
32
Скрининг потенциальных лигандов для
конструирования лекарств
Проверка 96 соединений на способность ингибировать связывание ILIL-4 человека
с иммобилизированным рецептором (поиск антагонистов цитокинов)
цитокинов)
33
Изучение фармакокинетики препарата
Контроль фармакокинетики антител для терапевтических целей
(Разработка и валидация фармакокинетического теста)
34
Молекулярное узнавание
Гормон роста - анализ вклада индивидуальных аминокислот во взаимодействие
с рецептором (аланиновый
(аланиновый скрининг)
Цель – создание миметика гормона роста для терапевтических целей
35
Сигнальные системы
Анализ ионной селективности СаСа-зависимой сигнальной системы
36
Взаимодействие гормон-рецептор
Анализ связывания рецептора эстрогена со специфической ДНК
Цель – исследование действия аналогов эстрогена
37
BIACORE и протеомика (SPR / MS)
Fishing
Recovery
Рецептор
Трипсин
Лизат
MS
Идентификация
партнера
38
BIACORE и протеомика
39
Calmodulin-binding domain (captured) - Fishing of Calmodulin in bovine brain extract
40
APPLICATION NOTE 27
SPR-MS as a tool for quality control of recombinant proteins
Model system - Cytochrome P450 2E1
In this study, recombinant His-tagged cytochrome P450 isozyme 2E1 (CYP2E1) was
selectively captured onto the sensor surface from membrane extract of E. coli. The
functional integrity of the enzyme was then tested by studying its interaction with its
specific binding partner, 4-phenylimidazole. After microrecovery and proteolytic
digestion, protein structure was confirmed by matrix-assisted laser desorption/
ionization (MALDI)-MS.
41
Прикладное использование оптического биосенсора
™ Анализ продуктов питания
ƒ Витамины
ƒ Следы гормонов, антибиотиков, анаболиков, …
™ Анализ качества препаратов
™ Разработка диагностических тест-систем
™ Разработка вакцин
™ Диагностика
42
Прикладное использование оптического биосенсора
™ Qflex Kits
ƒ Qflex® Kit Biotin
ƒ Qflex® Kit Chloramphenicol
ƒ Qflex® Kit Clenbuterol
ƒ Qflex® Kit Folic Acid
ƒ Qflex® Kit Pantothenic Acid
ƒ Qflex® Kit Ractopamine
ƒ Qflex® Kit Streptomycin
ƒ Qflex® Kit Sulfadiazine
ƒ Qflex® Kit Sulfamethazine
ƒ Qflex® Kit Sulfonamides
ƒ Qflex® Kit Vitamin B12
ƒ Qflex® Kit Vitamin B2
ƒ Qflex® Kit ß-agonists
43
Спасибо за внимание
44
Скачать