влияние ангиотензина ii и гликозилированного белка на

ВЛИЯНИЕ АНГИОТЕНЗИНА II И ГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО БЕЛКА
НА АПОПТОТИЧЕСКУЮ ГОТОВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ
У БОЛЬНЫХ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИЕЙ
Гальчинская В. Ю., Топчий И. И., Кондаков И. К., Семеновых П. С., Щербань Т. Д.
ГУ «Институт терапии им. Л. Т. Малой АМН Украины», г. Харьков
Ингибиторами или индукторами апоптоза могут быть различные факторы. В организме они или усиливают пролиферацию
клеток, или индуцируют их апоптоз, создавая тем самым определенную симптоматику
заболевания [1]. Физиологическими регуляторами апоптоза являются некоторые гормоны, в частности, ангиотензин II, концентрация которого повышается при диабетической нефропатии (ДН) [2, 3]. Кроме того,
в механизмах развития осложнений сахарного диабета (СД) существенную роль играют процессы неферментативного гликозилирования [4, 5]. Несмотря на то, что проводится активное исследование эффектов гли-
козилированных субстратов на различных
типах клеток, до настоящего времени нет
однозначных данных о влиянии гликозилированных белков на апоптотическую активность клеток периферической крови. Одним из наиболее исследованных и информативных лабораторно-диагностических показателей апоптотической активности является содержание CD95+ -клеток в крови [1, 2].
Исходя из этого, целью данной работы было изучение в условиях in vitro экспрессии CD95-антигена на лейкоцитах крови под
влиянием таких патогенетических факторов, как ангиотензин II и гликозилированный белок.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на лейкоцитах периферической крови 55 больных ДН
в возрасте от 40 до 67 лет. Контрольную
группу составили 10 здоровых доноров соответствующего возраста.
Лейкоциты выделяли путем градиентного центрифугирования из периферической
крови больных ДН и здоровых доноров.
В экспериментах использовали суспензию
клеток, которая содержала не менее 90 %
живых клеток. Контролем жизнеспособноПроблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
сти клеток служило витальное окрашивание
лейкоцитов трипановым синим.
Клетки инкубировали в полиэтиленовых пластиковых планшетах с диаметром лунок 20 мм (1х106 клеток на лунку) при температуре 37 ℃. Инкубационная
смесь состояла из среды 199 с добавлением 20 ммоль/л HEPES, сывороточного
альбумина быка (1 мг/мл), 10 % эмбриональной сыворотки теленка и антибиотиков
(200 мкг/мл стрептомицина и 100 Ед/мл
21
Клiнiчна ендокринологiя
пенициллина). Для стимуляции клеточного ответа был использован ангиотензин II
(107 Моль/л) и гликозилированный белок
(50 мкг/мл) (Sigma Aldrich, США). Через
18 часов после добавления ангиотензина II
и гликозилированного белка клетки забирали для определения экспрессии CD95-антигена. Количество CD95+ -клеток оценивали непрямым иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных
антител к антигену CD95 (ООО «Сорбент»,
Москва).
Полученные данные были подвергнуты
статистическому анализу. Проверку распределения дат на соответствие нормальному
закону проводили с использованием метода Шапиро-Уилко. Статистические гипотезы о разнице средних проверяли с помощью
критерия Стьюдента для уровня значимости Р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По данным литературы, CD95-oпocpeдoвaнный апоптоз вовлечен в патогенез СД
как 1, так и 2 типов [5]. С. Giordano и соавт. [7] изучали экспрессию CD95-aнтигена на лимфоцитах периферической крови больных сахарным диабетом. В частности, обнаружено значительное снижение
экспрессии CD95-aнтигена на лимфоцитах
периферической крови у вновь диагностированных больных, долго болеющих лиц и у
лиц с высоким риском заболевания диабетом. Авторы делают вывод о дефектной экспрессии CD95-антигена и предполагают, что
это ослабляет способность аутореактивных
лимфоцитов подвергаться CD95-опосредованному апоптозу и приводит к утрате контроля за Т- и В-клеточными клонами, специфичными для β-клеток.
Исследование апоптоза и его эффекторов в почечных биоптатах пациентов с СД
2 типа и ДН [8] выявило демонстративное
повышение апоптоза и экспрессии его маркеров (в частности CD95-антигена) в зависимости от стадии заболевания. Наиболее
высокие показатели авторы определяли на
поздних стадиях ДН.
Выполненные нами исследования показали, что содержание CD95+ -клеток в крови
больных ДН достоверно выше, чем у здоровых доноров. При этом количество CD95+ клеток повышается в зависимости от стадии
заболевания и достигает значимой величины уже при сравнении больных с начальными доклиническими стадиями заболевания (ДН I-III стадии) и здоровых доноров —
(31,4 ± 4,9 и 22,5 ± 3,6 %, соответственно; Р < 0,05). Эти данные свидетельствуют
22
о том, что усиленная экспрессия CD95-антигена — достаточно ранний феномен. У больных с выраженными клиническими проявлениями поражения почек — протеинурией
и нарушением азотовыделительной функции (ДН IV–V стадии) экспрессия CD95антигена была еще более демонстративной
и достигала 51,9 ± 4,8 % (Р < 0,05).
Повышение апоптотической активности
иммунокомпетентных клеток крови при
ДН, вероятнее всего, ассоциировано с хронической клеточной активацией, вызванной
разными стимулами: гипергликемией, уремией, гиперлипидемией, артериальной гипертензией, избыточной продукцией интерлейкинов, ангиотензина и других патогенных факторов [9–12].
В исследованиях, выполненных нами
in vitro, была изучена способность клеток
к апоптозу под влиянием ангиотензина II
и гликозилированного белка как факторов,
обладающих несомненным патологическим
воздействием. Полученные результаты показали, что и ангиотензин II, и гликозилированный белок существенно повышали
процентное содержание CD95-положительных клеток (Р < 0,05), но стимулирующее
влияние гликозилированного протеина было более выраженным (см. табл.). Кроме
того, эффекты этих агентов были аддитивны (Р < 0,05), что может свидетельствовать
о различных механизмах их влияния на способность клеток к апоптозу.
Безусловно, проведенное в условиях in
vitro исследование проявлений апоптотической активности лейкоцитами крови под
влиянием различных факторов не полно-
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
Клiнiчна ендокринологiя
Т а б л и ц а
Экспрессия CD95-антигена в лейкоцитах крови под влиянием ангиотензина II
и гликозилированного белка
Показатель
Индуктор
n
содержание CD95+ -клеток (X), %
SX
Контроль (без индуктора)
10
29,8
1,8
Ангиотензин II
24
45,21
3,4
Гликозилированный протеин
24
58,41
3,6
Ангиотензин II + гликозилированный
протеин
24
67,61
3,2
П р и м е ч а н и е. n — количество наблюдений, X — среднее арифметическое, SX — статистическая
ошибка; 1 — достоверно по сравнению с контролем (Р < 0,05).
стью воспроизводит физиологические и патофизиологические процессы, но его результаты свидетельствуют, что апоптоз имеет
принципиальное значение в процессах развития ДН, а такие патогенетические факторы, как ангиотензин II и гликозилированный белок способствуют его активации.
Несмотря на интенсивность исследований, посвященных апоптозу, к настоящему времени нет единого мнения о характере и причинах его нарушений в процессе
развития ДН, тем не менее, можно с уверенностью говорить, что высокий уровень
глюкозы, конечные продукты гликозилирования и ангиотензин значительно повышают апоптотическую готовность иммуноком-
петентных клеток. Вполне возможно, что
повышение апоптотической активности клеток имеет принципиальное значение для реализации основных эффектов этих факторов. Повышение апоптотической готовности
клеток, по-видимому, происходит в основном в зрелых активированных лимфоцитах
и развивается в результате дисбаланса активационных сигналов или вследствие связывания различных рецепторов для индукторов апоптоза.
Выявленные нарушения апоптотической
готовности при ДН дают весомые основания к дальнейшему исследованию клеточных и молекулярных механизмов апоптоза
на разных этапах развития заболевания.
ВЫВОДЫ
1. В периферической крови больных
диабетической нефропатией в зависимости
от стадии заболевания повышается содержание CD95-положительных клеток. Наиболее высокая апоптотическая готовность
имеет место на поздних стадиях заболевания.
2. Как ангиотензин II, так и гликозилированный белок стимулируют готовность
лейкоцитов к апоптозу и существенно повышают содержание CD95-положительных
клеток, при этом стимулирующее влияние
гликозилированного протеина более выражено.
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
3. Эффекты ангиотензина II и гликозилированного белка аддитивны, что может
свидетельствовать о различных механизмах
их влияния на способность клеток к апоптозу.
4. Поскольку апоптоз имеет существенное значение в процессах патогенеза диабетической нефропатии, изменения его активности у больных диабетической нефропатией имеют безусловное прогностическое значение и могут служить критерием эффективности терапии.
23
Клiнiчна ендокринологiя
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А. Ю. Иммунологические проблемы апоптозу [Текст] / А. Ю. Барышников, Ю. В. Шишкин. — «Наука» Медицина. — 2002. — С. 310.
2. Stefanec T. Endothelial Apoptosis: Could It Have
a Role in the Pathogenesis and Treatment of Disease? [Text]
/ T. Stefanec / CHEST. — 2000. — Vol. 117. — P. 840–854.
3. Wolf G. From the periphery of the glomerular
capillary wall toward the center of disease [Text] / G. Wolf,
S. Chen, F. N. Ziyadeh // Diabetes. — 2005. — № 54. —
Р. 1626–1634.
4. Taurine promotes apoptosis induced by high ambient
glucose in human tubule renal cells [Text] / D. Verzola,
M. B. Bertolotto, B. Villaggio [et al.] // J. Investig. Med. —
2002. — № 50. — Р. 443–451.
5. High-glucose-induced oxidative stress causes
apoptosis in proximal tubular epithelial cells and is
mediated by multiple caspases [Text] / D. A. Allen,
S. Harwood, M. Varagunam [et al.] // FASEB J. — 2003. —
№ 17. — Р. 908–910.
6. Is podocyte injury relevant in diabetic nephropathy?
Studies in patients with type 2 diabetes [Text] / M. Dalla
Vestra, A. Masiero, A. M. Roiter [et al.] // Diabetes. —
2003. — № 52. — Р. 1031–1035.
7. Defective expression of the apoptosis-inducing
CD95 (Fas/APO-1) molecule on Т and B-cells in
1DDM [Text] / С. Giordano, R. De Maria, G. Stassi [et al.]
// Diabetologia. — 1995. — Vol. 38, № 12. — P. 1449–1454.
8. Apoptosis in the kidneys of patients with type II
diabetic nephropathy [Text] / D. Verzola1, M. T. Gandolfo1,
F. Ferrario [et al.] // Kidney International. — 2007. —
№ 72. — Р. 1262–1272.
9. Naı̈ve and central memory T-cell lymphopenia in
end-stage renal disease [Text] / J. W. Yoon, S. Gollapudi,
M. V. Pahl, N. D. Vaziri // Kidney Int. — 2006. — Vol. 70,
№ 2. — Р. 371–376.
10. Oxidant and carbonyl stress-related apoptosis in
end-stage kidney disease: impact of membrane flux [Text]
/ V. Bordoni, M. Piroddi, F. Galli [et al.] // Blood Purif. —
2006. — Vol. 24, № 1. — Р. 149–56.
11. Apoptotic markers on lymphocytes and
monocytes are unchanged during single hemodialysis
sessions using either regenerated cellulose or polysulfone
membranes [Text] / C. C. Wu, T. N. Liao, K. C. Lu [et al.]
// Clin. Nephrol. — 2005. — Vol. 64, № 3. — Р. 198–204.
12. Apoptosis, proliferation and inflammatory
infiltration in ANCA-positive glomerulonephritis [Text]
/ R. Kettritz, S. Wilke, S. von Vietinghoff [et al.] // Clin.
Nephrol. — 2006. — Vol. 65, № 5. — Р. 309–316.
ВПЛИВ АНГИОТЕНЗИНУ II ТА ГЛIКОЗИЛЬОВАНОГО ПРОТЕЇНА НА
АПОПТОТИЧНУ ЗДАТНIСТЬ ЛЕЙКОЦИТIВ КРОВI У ХВОРИХ НА
ДIАБЕТИЧНУ НЕФРОПАТIЮ
Гальчiнська В. Ю., Топчiй I. I., Кондаков I. К., Семенових П. С., Щербань Т. Д.
ДУ «Iнститут терапiї iм. Л. Т. Малої АМН України», м. Харкiв
Проведено порiвняльне вивчення експресiї проапоптотичного рецептора CD95 на лейкоцитах периферичної кровi хворих на дiабетичну нефропатiю i здорових донорiв пiд впливом ангiотензину II та глiкозильованого бiлка. Виявлено збiльшення вмiсту CD95-позитивних клiтин
при дiабетичнiй нефропатiї. Ангiотензин II та глiкозильований бiлок суттєво пiдвищували вмiст
CD95-позитивних клiтин. Їх ефекти були адитивнi, що свiдчить про рiзнi механiзми їх впливу
на здатнiсть клiтин до апоптозу.
К л ю ч о в i с л о в а: дiабетична нефропатiя, апоптоз, експресiя CD95-антигену, ангiотензин II, глiкозований бiлок.
ВЛИЯНИЕ АНГИОТЕНЗИНА II И ГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО БЕЛКА НА
АПОПТОТИЧЕСКУЮ ГОТОВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ
ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИЕЙ
Гальчинская В. Ю., Топчий И. И., Кондаков И. К., Семеновых П. С., Щербань Т. Д.
ГУ «Институт терапии им. Л. Т. Малой АМН Украины», г. Харьков
Проведено сравнительное изучение экспрессии проапоптотического рецептора CD95 на лейкоцитах периферической крови больных диабетической нефропатией и здоровых доноров под
влиянием ангиотензина II и гликозилированного белка. Выявлено увеличение содержания CD95положительных клеток при диабетической нефропатии на различных стадиях заболевания. Ангиотензин II и гликозилированный белок существенно повышали содержание CD95-положительных клеток. Их эффекты были аддитивными, что свидетельствует о различных механизмах их
влияния на способность клеток к апоптозу.
К л ю ч е в ы е с л о в а: диабетическая нефропатия, апоптоз, экспрессия CD95-антигена,
ангиотензин II, гликозилированный белок.
24
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
Клiнiчна ендокринологiя
EFFECTS OF ANGIOTENSIN II AND GLYCATED PROTEIN ON LEUCOCYTE
APOPTOSIS IN DIABETIC NEPHROPATHY PATIENTS
V. Yu. Galchinskaya, I. I. Topchiy, I. K. Kondakov, P. S. Semenovykh, T. D. Scherban
SI «L. T. Malaya Institute of Therapy at AMS of Ukraine», Kharkiv
A comparative examination of apoptotic CD95 receptor expression in blood cells of patients with
diabetic nephropathy and healthy donors has been conducted. Diabetic nephropathy development
is accompanied by an increased content of CD95-positive cells. Angiotensin II and glycated protein
increased significantly the amount of CD95-positive cells. This effects were found to be additive that
may testify to different mechanisms of their influence on the cell apoptotic ability.
K e y w o r d s: diabetic nephropathy, apoptosis, CD95-antigen expression, angiotensin II, glycated protein.
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
25