Иммуноглобулин Е человека (Human IgE ELISA)

Human IgE ELISA, EUROIMMUN AG
1
_____________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение ФС №2006/1519 от 03/10/2006 г.
Иммуноглобулин Е человека (Human IgE ELISA)
Иммуноферментный тест для количественного определения антител класса IgЕ в сыворотке или плазме
крови человека
Номер по каталогу: ЕV 3840-9601Е
Набор рассчитан на 96 определений
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор Human IgE ELISA предназначен для количественного определения in vitro IgЕ-антител человека в
сыворотке и плазме крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Тест Human IgE ELISA основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Набор
содержит 12 стрипов, разделяемых на отдельные лунки, покрытых поликлональными антителами,
направленными против IgE человека. На первой стадии реакции разведенные образцы пациентов
инкубируют в лунках. Имеющиеся в образце IgE будут связываться с антителами на твердой фазе. Для
определения связанных IgE проводится вторая инкубация с использованием меченных ферментом антител
к IgE человека (ферментный конъюгат), которые обеспечивают взаимодействие субстрата и хромогена с
появлением окраски. Содержание IgE антител в исследуемом образце определяют по калибровочной
кривой (с использованием калибраторов 1-4).
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Компонент
Цвет
Количество
Лунки микропланшета
12 стрипов (8-луночных), разделяемых на отдельные
лунки, в рамке-держателе, готовы к использованию
Калибратор 1
500 МЕ/мл (IgЕ человеческий), готов к использованию
Калибратор 2
100 МЕ/мл (IgЕ человеческий), готов к использованию
Калибратор 3
10 МЕ/мл (IgЕ человеческий), готов к использованию
Калибратор 4
0 МЕ/мл (IgЕ человеческий),готов к использованию
Положительный контроль 1
(высокое содержание IgE), готов к использованию
Положительный контроль 2
(низкое содержание IgE), готов к использованию
Ферментный конъюгат
Мышиные антитела к IgЕ человека, конъюгированные
с пероксидазой хрена; готов к использованию
Буфер для образцов
Готов к использованию
Промывочный буфер
10×концентрат
Раствор хромогена/субстрата
Хромоген – тетраметилбензидин, субстрат – перекись
водорода, готов к использованию
Стоп-реагент
0,5 М серная кислота, готов к использованию
Инструкция по применению
Протокол с заданными величинами
Серия
Для in vitro диагностики
–
12 × 8
Обозначение
STRIPS
1 × 2,0 мл
CAL 1
1 × 2,0 мл
CAL 2
1 × 2,0 мл
CAL 3
1 × 2,0 мл
CAL 4
темно-синий
1 × 2,0 мл
POS CONTROL1
голубой
1 × 2,0 мл
POS CONTROL2
фиолетовый
1 × 12 мл
CONJUGATE
оранжевый
1 × 100 мл
SAMPLEBUFFER
бесцветный
1 × 100 мл WASHBUFFER 10×
бесцветный
1 × 12 мл
SUBSTRATE
бесцветный
1 × 12 мл
STOP SOLUTION
Красный с
убывающей
интенсивностью
–
–
1 буклет
1 протокол
Температура хранения
Невскрытый набор использовать до
Хранение и стабильность набора
Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не замораживать. Невскрытые компоненты
набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока годности набора.
Утилизация отходов
Образцы пациентов, калибраторы, контроли и стрипы после инкубации следует рассматривать, как
инфицированные отходы, и обращаться с ними соответствующим образом. Все реагенты следует
утилизировать в соответствии с действующими официальными инструкциями.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Human IgE ELISA, EUROIMMUN AG
2
_____________________________________________________________________________________________________
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание: Перед использованием все реагенты необходимо прогреть до комнатной температуры (от +18
°С до +25 °С) в течение 30 минут. После первого использования реагенты сохраняют стабильность в
течение указанного срока годности, если они хранятся при температуре от +2 °С до +8 °С и защищены от
микробной контаминации. Прочие сведения о стабильности отдельных реагентов указаны ниже.
Лунки, покрытые антигенами: Готовы к использованию. Вскройте защитную упаковку планшета,
расстегнув имеющуюся на пакете самоуплотняющуюся застежку. Во избежание конденсации влаги внутри
лунок, не вскрывайте пакет до тех пор, пока он не прогреется до комнатной температуры. Отломив
необходимое количество лунок, остальные неиспользованные лунки немедленно вложите вновь в ту же
защитную упаковку и плотно закройте ее на застежку (не вынимайте из упаковки пакетик с
влагопоглотителем).
После первого вскрытия упаковки плотно упакованные вновь лунки с антигенами можно хранить минимум 4
месяца в сухом месте при температуре от +2 °С до +8 °С.
Калибраторы и контроли: Готовы к использованию. Перед применением тщательно перемешать.
Ферментный конъюгат: Готов к использованию. Перед применением тщательно перемешать.
Буфер для образцов: Готов к использованию.
Промывочный буфер: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Если образовались кристаллы, их
необходимо предварительно растворить, нагревая концентрат до 37 °С и интенсивно взбалтывая.
Требуемое количество концентрата следует отобрать из бутыли чистой пипеткой и развести
деионизированной или дистиллированной водой (1 часть концентрированного реагента плюс 9 частей
воды).
Например, для проведения анализа на 1 стрипе: к 5 мл концентрата следует добавить 45 мл воды.
Готовый разведенный промывочный буфер стабилен до 1 месяца, если его хранят при температуре от +2
о
С до +8 оС и правильно используют.
Раствор хромогена/субстрата: Готов к использованию. После отбора необходимого количества реагента,
немедленно закройте флакон, так как раствор чувствителен к свету. При использовании раствор
хромогена/субстрата должен быть бесцветным. Не используйте раствор, если он приобрел голубую
окраску.
Стоп-реагент: Готов к использованию.
Предостережение: Используемые в наборе контрольные сыворотки и калибраторы были проверены на
антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и вирусу гепатита С, а также на наличие HBsAg методами иммуноферментного
анализа и иммунофлуоресценции, и при этом показали отрицательные результаты. Тем не менее, все
используемые материалы следует считать потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая
необходимые меры предосторожности. Некоторые реагенты содержат токсичное вещество азид натрия.
Избегайте его попадания на кожу.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТОВ
Материал образцов
Сыворотка или плазма (с ЭДТА, гепарином или цитратом) крови человека.
Стабильность
Образцы пациентов, предназначенные для исследования, можно хранить до 14 дней при температуре от
+2 оС до +8 оС. Разведенные образцы необходимо использовать в течение одного рабочего дня.
Разведение образцов: Образцы пациентов разводят 1:10 буфером для образцов. Например: разведите
100 мкл сыворотки в 900 мкл буфера для образцов и тщательно перемешайте на вортексе (пипетки для
этого не подходят).
Примечание: Калибраторы и контроли готовы к использованию, их разводить не надо.
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Инкубация с образцом (1 стадия)
Внесите по 100 мкл калибратора, положительного контроля 1 и 2 или разведенных образцов пациентов в
отдельные лунки микропланшета в соответствии со схемой размещения. Инкубируйте планшет при
комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Ручная: Удалите жидкость из лунок и затем промойте 3 раза, используя каждый раз по 300 мкл рабочего
промывочного буфера на лунку.
Автоматическая: проводите в режиме с переполнением (установите в программе для соответствующего
автоматического вошера параметр “Overflow”, с 3-мя циклами промывки и внесением в лунки по 450 мкл
рабочего промывочного буфера.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Human IgE ELISA, EUROIMMUN AG
3
_____________________________________________________________________________________________________
При каждом цикле промывки после заполнения лунок буфером оставляйте планшет на 30-60 секунд, а
затем отбирайте жидкость. По окончании промывки (ручной или автоматической) тщательно удалите
остатки жидкости из лунок, энергично постукивая перевернутым планшетом по впитывающей бумаге.
Примечание: Остаточная жидкость (больше 10 мкл), обычно остающаяся в лунках после промывки, может
помешать действию субстрата и снизить оптическую плотность (ОП) раствора в лунках. Недостаточно
полная промывка (например, менее 3 раз, или при маленьком объеме добавляемого промывочного буфера,
или при коротком времени выдерживания буфера в лунках) может приводить к получению завышенных
значений ОП в лунках.
Инкубация с конъюгатом (2 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IgG
человека). Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С).
Промывка
Отберите жидкость из лунок. Промойте, как описано ранее.
Инкубация с субстратом (3 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл раствора хромогена/субстрата. Инкубируйте планшет в течение 15
минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) в защищенном от прямого солнечного света месте.
Остановка реакции
Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента (в той же последовательности и с такой же скоростью,
как вносился раствор хромогена/субстрата).
Измерение
Фотометрическое измерение интенсивности окрашивания раствора в лунках проводят при основной
длине волны 450 нм и при референтной длине волны между 620 нм и 650 нм в течение 30 минут после
добавления стоп-реагента. Перед измерением слегка покачайте планшет, чтобы добиться гомогенного
распределения раствора.
СХЕМА РАЗМЕЩЕНИЯ НА ПЛАНШЕТЕ ОБРАЗЦОВ И КОНТРОЛЕЙ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
C1
P3
P 11 P 19
B
C2
P4
P 12 P 20
C
C3
P5
P 13 P 21
D
С4
P6
P 14 P 22
E
pos 1 P 7
P 15 P 23
F
pos 2 P 8
P 16 P 24
G
P1
P9
P 17
H
P2
P 10 P 18
В соответствующие лунки вносят и инкубируют калибраторы (от С1 до С4), положительные контроли 1 и 2
(pos 1 и pos 2.), а также образцы пациентов (Р 1 – Р 24). Достоверность ИФА анализа можно увеличить,
размещая и измеряя каждую анализируемую пробу в двух параллельных лунках (дубликатах).
Лунки можно отламывать от стрипов по одной. Это позволяет привести в соответствие используемое
количество лунок и количество исследуемых образцов и, таким образом, минимизировать расход
реагентов.
Положительные контроли выполняют роли внутренних контролей проверки правильности процедуры
исследования. Их следует использовать при каждой постановке анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Количественный анализ
На графике линейной зависимости откладывают величины ОП, измеренные для 4 калибровочных
сывороток (ось Y) против концентрации антител в этих сыворотках, выраженной в международных
единицах МЕ/мл (ось X). По полученным точкам проводят стандартную кривую для определения
концентрации антител в образцах пациентов. Для расчета кривой с помощью компьютера используйте
кусочно-линейный способ (“point-to-point”). Если результаты рассчитываются автоматическим способом мы
рекомендуем использовать кубический сплайн интерполяцию, которая обеспечивает наибольшее
приближение к истинной калибровочной кривой. Если используются другие программы, построение
кубического сплайна может приводить к проблемам. В таких случаях можно использовать акима
интерполяцию. В случае использования построения «от точки к точке» с линейной экстраполяцией,
необходимо учитывать, что при содержании IgE выше 100 МЕ/мл, может возникать небольшой сдвиг
измеренных значений.
Ниже приведен пример типичной калибровочной кривой. Не используйте ее, пожалуйста, для определения
концентрации антител в образцах пациентов.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Human IgE ELISA, EUROIMMUN AG
4
_____________________________________________________________________________________________________
2
ОП
1.5
1
0.5
0
0
100
200
300
400
500
600
IgE (МЕ/мл)
Если ОП образца пациента лежит выше величины ОП для калибратора 1 (с концентрацией 500 МЕ/мл),
результат следует выражать как “>500 МЕ/мл”. Такой образец рекомендуется развести 1:40 и
протестировать повторно, а результат, полученный по калибровочной кривой (в МЕ/мл), умножить на
коэффициент разведения 4.
Синтез IgE антител у плода начинается на 11-й неделе развития. Затем их концентрация постоянно
повышается, достигая максимальных значений в возрасте 6 – 14 годов, а затем вновь снижается.
Содержание IgE антител сильно варьируют у разных людей, как страдающих аллергическими
заболеваниями, так и у здоровых, и зависит от многих факторов (возраста, пола, наличия атопических
заболеваний, расы, курит ли человек). Поэтому представленные ниже нормальные значения, взятые из
литературных данных (Thomas, 1992), следует рассматривать как ориентировочные. Каждой лаборатории в
каждой стране рекомендуется определить свой нормальный диапазон значений в зависимости от каждого
конкретного человека и его возраста.
Возраст
Новорожденные
1-6 месяцев
7-12 месяцев
1-5 лет
6-9 лет
10-15 лет
>16 лет
Верхняя граница референтного
интервала, МЕ/мл
1,2
7,2
12,7
60
155
199
100
ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТА
Калибровка: Калибровку проводят в международных единицах (МЕ), используя международную
стандартную сыворотку NIBSC 75/502 (Национальный институт биологических стандартов и контролей,
Хартфордшир, Англия). Эта сыворотка по определению содержит 5000 МЕ/мл.
Для каждой группы тестов, выполненных на наборах определенной серии, величины ОП калибраторов и
международных единиц, определенные для положительных контролей, должны лежать в пределах,
установленных для наборов этой серии. Протокол с установленными значениями входит в состав набора.
Если обнаружены отклонения контрольных значений от значений, указанных в спецификации, результаты
теста могут быть ошибочными и тест следует повторить.
Активность фермента, входящего в состав набора, зависит от температуры, поэтому, если не используется
термостат, значения ОП могут варьировать. Чем выше температура воздуха в помещении (от +18оС до
+25оС) во время инкубации с субстратом, тем выше значение ОП. Сходные изменения происходят и со
временем инкубации. Однако, таким же воздействиям подвергается и сыворотка калибратора, поэтому при
расчете результатов возможные колебания в основном компенсируются.
Линейность
Линейность теста исследовали, используя серию разведений сыворотки пациента с высокой концентрацией
IgE антител. Определение концентрации общего IgE линейно в области 34-449 МЕ/мл.
Аналитическая чувствительность
Аналитическая чувствительность определяется как наименьшая определяемая концентрация общего IgE и
составляет 1,2 МЕ/мл.
Воспроизводимость
Воспроизводимость теста исследовали, определяя коэффициент вариации (CV) результатов анализа трех
сывороток. Значения CV внутри одного опыта определяли из 20 параллельных измерений каждой
сыворотки. Значения CV в внутри одной постановки определяли, проводя 20 определений, а между
постановками по 4 измерениям в течение 6 различных дней.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Human IgE ELISA, EUROIMMUN AG
5
_____________________________________________________________________________________________________
Вариабельность внутри одной постановки,
n = 20
Среднее
CV
Сыворотка
(МЕ/мл)
(%)
1
117
4,3
2
333
4,8
3
658
3,1
Вариабельность в разных постановках, n =
4×6
Среднее
CV
Сыворотка
(МЕ/мл)
(%)
1
114
3,7
2
317
4,8
3
681
5,2
Перекрестная реактивность
Конфигурация ИФА («сэндвич» метод) и специфичность используемых антител гарантирует высокую
специфичность данного набора.
Вещества, мешающие определению
Проведению анализа не мешали образцы с признаками гемолиза, липемические и иктеричные образцы с
концентрациями гемоглобина вплоть до 10 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и билирубина – до 0,4 мг/мл.
Специфичность и чувствительность:
Содержание общего IgE определяли в 35 образцах сыворотки, используя набор EUROIMMUN Human IgE
ELISA и нефелометрию в качестве референтного метода. Специфичность составила 100 %, а
чувствительность – 94,7%.
Референтный интервал
Значение 100 МЕ/мл считается верхней границей рефересного интервала содержания IgE у людей не
страдающих атопией (Thomas, 1992). Панель сывороток от 200 доноров крови исследовали с помощью
набора EUROIMMUN Human IgE ELISA. Полученные значения показали почти нормальное распределение
и согласуются с литературными данными (Klink et al.,1990).
Возможность, что некоторые люди, чья кровь использовалась в этой панели, страдают аллергическими
заболеваниями, не исключали, поэтому пропорция сыворотки с содержанием IgE выше 100 МЕ/мл
соответственно выше (график приведен в оригинале инструкции).
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
1) Диагностика аллергии и атопии
Помимо кожных и провокационных тестов и определения уровня специфических IgE диагностика аллергии
также включат определение уровня общего IgE. Однако аллергическая сенсибилизация не всегда
обязательно сопровождается повышением уровня общего IgE (у взрослых > 100 МЕ/мл), с другой стороны
пониженные уровни IgE (у взрослых < 25 МЕ/мл) не исключает наличие атопических заболеваний. В
течение длительной гипосенсибилизирующей терапии или после элиминации аллергена, титр IgE
постепенно снижается.
Определение уровня общего IgE применяют для дифференциальной диагностики аллергической и
инфекционно-аллергической астмы, аллергического и вазомоторного ринита и атопического и себорейного
дерматита у новорожденных. Крайне высокие титры IgE антител (несколько тысяч МЕ/мл) обнаруживают у
пациентов с атопическим дерматитом.
К другим заболеваниям, сопровождающимся аллергическим фоном (и высоким уровнем IgE) относят
рецидивирующую и хроническую крапивницу, рецидивирующий отек Квинке, пищевую непереносимость и
экзантемы неясного генеза. Определение уровня IgE также можно проводить при дифференциальной
диагностике эозинофильной инфильтрации легочной ткани, аллергического аспергиллеза, экзогенного
аллергического альвеолита («легкое фермера», «легкое любителя птиц») и синдрома Чардж-Стросса
(Churg-Strauss)
2) Определение уровня IgE при других заболеваниях
К неаллергическим заболеваниям, которые сопровождаются сильно повышенными уровнями IgE, относят
помимо всего прочего многие формы гельминтозов, например, токсокароз, аскаридоз, шистосоматоз,
лейшманиоз и трихинеллез. Однако при тениозе или оксиурозе никакого повышения уровня IgE, как
правило, не наблюдается. Содержание IgE в большинстве случаев возвращается к нормальным
показателям после успешного лечения.
Повышенный уровень IgE также наблюдается при следующих заболеваниях:
- Экзематозном и неэкзематозном дерматите,
- IgE-миеломе,
- Острой системной красной волчанке,
- При реакции отторжения трансплантата,
- Дефиците Т-клеток (синдроме Вискота-Олдрича)
- При ожогах второй и третьей степени,
- Опухолях в области уха, носа и глотки,
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Human IgE ELISA, EUROIMMUN AG
6
_____________________________________________________________________________________________________
-
Заболеваниях печени, особенно в ассоциации со злоупотреблением алкоголя,
На поздних стадиях СПИДа при сильном снижении CD4- положительных Т-клеток.
Дефицит IgE обнаружен при:
- Х-хромосомой гипогаммаглобулинемии,
- Тяжелом комбинированном иммунодефиците,
- Атаксии-телеангиэктазии
- Нелегочных заболеваниях,
- В редких случаях также у здоровых индивидуумов.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Human IgE_EV3840-9601E_rus.doc
4/10/2009 1:57:00 PM
Оригинал EV_3840_A_UK_C04.doc
Version: 23.02.09
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru