007322 Данное изобретение имеет отношение к ... ние включает в себя лечение нейтропении, связанной с применением химиотерапии...

007322
Данное изобретение имеет отношение к предупреждению и/или лечению нейтропении. Изобретение включает в себя лечение нейтропении, связанной с применением химиотерапии и лучевой терапии, а
также лечение нейтропении, возникающей при инфекциях, гематологических заболеваниях и недостаточности питания. Данное изобретение также относится к снижению лекарственной токсичности и повышению эффективности лекарственных средств. В частности, данное изобретение относится к применению жирных кислот со средней длиной цепи, таких как каприновая кислота, каприловая кислота, или
их солей, или триглицеридов, или их моно- или диглицеридов, или других аналогов как фактора, способствующего выживанию и активации нейтрофилов, или фактора пролиферации стволовых клеток костного мозга.
При химиотерапии используют цитотоксические агенты, такие как циклофосфамид, доксорубицин,
даунорубицин, винбластин, винкристин, блеомицин, этопозид, топотекан, иринотекан, таксотер, таксол,
5-фторурацил, метотрексан, гемцитабин, цисплатин, карбоплатин или хлорамбуцил, не ограничиваясь
перечисленным, для уничтожения раковых клеток и опухолей. Однако названные агенты являются неспецифическими и, особенно в высоких дозах, оказывают токсическое действие на нормальные и быстроделящиеся клетки. Часто названные средства приводят к различным побочным эффектам у пациентов,
которым проводят химиотерапию и лучевую терапию. Миелосупрессия, значительное снижение образования клеток крови в костном мозге, является одним таким побочным эффектом. Указанный побочный
эффект характеризуется лейкопенией, нейтропенией и тромбоцитопенией. Тяжелая хроническая нейтропения (идиопатическая, циклическая и врожденная) также характеризуется избирательным снижением
количества циркулирующих нейтрофилов и повышенной чувствительностью к бактериальным инфекциям.
Сущность лечения рака химиотерапевтическими лекарственными средствами заключается в сочетании механизма цитотоксичности с механизмом избирательности относительно опухолевых клеток с
высокой степенью пролиферации по сравнению с клетками хозяина. Однако редко получают химиотерапевтические средства, которые характеризуются такой избирательностью. Цитотоксичность химиотерапевтических средств ограничивает вводимые дозы, влияет на терапевтические циклы и серьезно ухудшает общее состояние онкологического пациента.
Хотя на другие нормальные ткани также может оказываться неблагоприятное действие, костный
мозг является особенно чувствительным к пролиферация-специфическим воздействиям, таким как химиотерапия или лучевая терапия. Кратковременный и продолжительный токсический эффект на костный
мозг является общим побочным действием противораковой терапии, которое приводит к снижению количества клеток крови и анемии, лейкопении, нейтропении, агранулоцитозу и тромбоцитопении. Одной
причиной таких эффектов является снижение количества кроветворных клеток (например, полипотентных стволовых клеток и других клеток-предшественников), вызванное как летальным действием цитотоксических средств или излучения на названные клетки, так и дифференцировкой стволовых клеток,
спровоцированной механизмом обратной связи, индуцированным истощением компонентов более зрелого костного мозга. Второй причиной является снижение способности стволовых клеток к самовосстановлению, что также имеет отношение как к прямым (мутация), так и косвенным (старение популяции стволовых клеток) эффектам. (Tubiana, M., et al., Radiotherapy and Oncology 29: 1-17, 1993). Таким образом,
противораковые терапии часто приводят к уменьшению полиморфно-ядерных нейтрофилов (PMN) или
нейтропении. PMN представляют собой первую линию защиты против внедрившихся патогенных микроорганизмов и играют центральную роль во время острого воспаления, при этом их главной функцией
является фагоцитоз и уничтожение инфекционных агентов. Для выполнения упомянутой роли в ответ на
хемотактические факторы PMN покидают циркуляцию и проникают в пораженную область, чтобы осуществить свои биологические функции. У индивидуумов, имеющих нормальное количество клеток крови, нейтрофилы составляют приблизительно 60% всех лейкоцитов (SI Units Conversion Guide, 66-67
(1992), New England Journal of Medicine Books). Однако один из трех пациентов, получавших химиотерапию при раке, может страдать от нейтропении. Среднее нормальное количество нейтрофилов у здорового взрослого человека составляет порядка 4400 клеток/мкл с колебаниями в пределах 1800-7700 клеток/мкл. Количество от 1000 до 500 клеток/мкл рассматривают как умеренную нейтропению, а количество 500 клеток/мкл или менее считают тяжелой нейтропенией. Пациенты с миелосупрессивными состояниями склонны к инфекции и часто страдают нарушениями свертывания крови, требующими госпитализации. Недостаток нейтрофилов и тромбоцитов является основной причиной заболеваемости и смертности после лечения рака и приводит к высокой стоимости противораковой терапии. При этих вышеупомянутых условиях применение любого агента, способного ингибировать апоптоз нейтрофилов или стимулировать активацию и мобилизацию нейтрофилов, может иметь терапевтическое значение. Мероприятия
по восстановлению иммунной системы пациента после химиотерапии включают применение гемотопозтических факторов роста, чтобы стимулировать сохранившиеся стволовые клетки для пролиферации и
дифференцировки в зрелые клетки, защищающие от инфекции.
При трансплантации костного мозга феномен, известный как «мобилизация», также используют для
отбора большего количества стволовых клеток/клеток-предшественников из периферической крови. В
настоящее время названный способ используют для аутогенной или аллогенной трансплантации костно-1-
007322
го мозга. Факторы роста применяют, чтобы увеличить количество периферических стволовых клетокпредшественников, которые следует собрать до миелоаблативной терапии и инфузии стволовых клетокпредшественников.
Проводимая после лечения трансплантация костного мозга также может быть направлена против
нейтропении. Однако такие схемы лечения требуют 10-15-дневной терапии, которая делает пациентов
уязвимыми в отношении инфекции. Препараты, способные стимулировать стволовые клетки костного
мозга, могут способствовать и ускорять приживание стволовых клеток, таким образом, сокращая нейтропеническое «окно» после трансплантации костного мозга.
Хотя гематопоэтические факторы роста, такие как гранулоцито-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), могут оказывать такое действие, их применение является дорогостоящим, так как их получают с помощью рекомбинантной технологии. Такое пост-терапевтическое, способствующее улучшению лечение становится излишним, если пациенты являются "химиозащищенными" от супрессии иммунного ответа.
Поэтому существует потребность в новых композициях и способах снижения нежелательных побочных эффектов миелосупрессивных состояний, индуцированных химиотерапией и лучевой терапией.
Краткое изложение изобретения
Данное изобретение удовлетворяет потребность в химиотерапевтических средствах, разработкой
нового способа для стимуляции кроветворной системы у млекопитающих, включая человека. Данное
изобретение также относится к новому способу лечения миелосупрессивных состояний, индуцированных химиотерапией и лучевой терапией, и любого другого состояния, при котором стимуляция кроветворной системы может иметь терапевтическое значение, такого как трансплантация костного мозга и
хроническая нейтропения, а также нейтропения, вызванная инфекциями, гематологическими заболеваниями и недостаточностью питания, не ограничиваясь перечисленным. Названный способ содействует
кроветворной системе в противостоянии миелосупрессии, способствуя выживанию и активации нейтрофилов у пациентов, подвергшихся такому лечению.
В соответствии с упомянутым способом, композицию, содержащую одну или более жирных кислот
со средней длиной цепи, таких как каприновую кислоту, каприловую кислоту, или их соли, или триглицериды, или моно- или диглицериды, или другие аналоги в фармацевтически приемлемом носителе, вводят млекопитающему, в частности человеку, в количестве, эффективном для предупреждения или лечения нейтропении, например, для снижения побочных эффектов химиотерапии и лучевой терапии и для
лечения нейтропении, являющейся результатом инфекций, гематологических заболеваний и недостаточности питания.
Таким образом, аспект данного изобретения заключается в обеспечении композициями, в которых
используют каприновую кислоту, каприловую кислоту, лауриновую кислоту, или их соли металлов (натрия, калия, кальция, магния), или их триглицериды, или их моно- или диглицериды, или другие аналоги
для получения химиопротективных фармацевтических композиций в виде отдельного агента, или в виде
комбинации двух или более агентов и с другими химиотерапевтическими средствами, или такими лекарственными средствами, которые индуцируют состояние миелосупрессии, или без них.
Данное изобретение относится к применению каприновой кислоты, каприловой кислоты или их натриевых солей или триглицеридов, или их моно- или диглицеридов или родственных соединений как
фактора, стимулирующего кроветворение.
Кроме того, данное изобретение включает в себя композиции, содержащие каприновую кислоту,
каприловую кислоту, или их натриевые соли, или триглицериды, или их моно- или диглицериды, или
другие аналоги, и применение таких соединений для лечения миелосупрессии и последующей иммуносупрессии.
Изобретение также относится к применению каприновой кислоты, каприловой кислоты, или их натриевых солей, или триглицеридов, или их моно- или диглицеридов, или других аналогов для лечения
пациентов с тяжелой хронической нейтропенией.
Кроме того, данное изобретение относится к применению каприновой кислоты, каприловой кислоты, или их натриевых солей, или триглицеридов, или их моно- или диглицеридов, или других аналогов
как фактора, способствующего выживанию и активации нейтрофилов.
Данное изобретение также имеет отношение к применению каприновой кислоты, каприловой кислоты, или их натриевых солей, или триглицеридов, или их моно- или диглицеридов, или других аналогов при состояниях, при которых мобилизация нейтрофилов может иметь терапевтическое значение, таких как аутогенная или аллогенная трансплантация костного мозга.
Данное изобретение относится к способу, пригодному для обеспечения химиопротекции млекопитающего, включая человека.
Другой аспект данного изобретения заключается в создании способа, пригодного для повышения
эффективности химиотерапии и лучевой терапии у млекопитающего, включая человека.
Также изобретение относится к способам использования более высоких дозировок, чем обычные,
или даже повышения дозы химиотерапевтических композиций, необходимой для достижения лучшего
терапевтического эффекта, при этом избегая возрастания побочных эффектов.
-2-
007322
Данное изобретение относится также к способу для снижения или устранения нейтропении, индуцированной химиотерапией, у млекопитающего, включая человека.
Кроме того, данное изобретение относится к способу лечения нейтропении, возникающей при гематологических заболеваниях, таких как хронические идиопатические нейтропении, циклическая нейтропения, синдром «ленивых» лейкоцитов, синдром лейкоза Чедиака-Хигаси и апластическая анемия.
Данное изобретение относится к способу лечения нейтропении, развивающейся в результате инфекционных заболеваний, таких как вирусные (например, ВИЧ, корь, гепатит, желтая лихорадка, мононуклеоз) и бактериальные (например, брюшной тиф, паратифы, бруцеллез) инфекционные заболевания.
Также данное изобретение относится к способу, который вызывает минимальные побочные эффекты или не вызывает вовсе никаких побочных эффектов у реципиента.
Описанные и другие аспекты, особенности и преимущества данного изобретения станут очевидными после рассмотрения следующего подробного описания представленных аспектов и прилагаемой формулы изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано влияние МСТ на апоптоз PMN.
На фиг. 2 показано влияние МСТ на PMN-фагоцитоз.
На фиг. 3А и 3В показано влияние доксорубицина на апоптоз PMN.
На фиг. 4А представлен времязависимый ответ МСТ на нейтрофилы, обработанные доксорубицином.
На фиг. 4В представлен времязависимый ответ доксорубицина на МСТ-обработанные нейтрофилы.
На фиг. 5 показано влияние МСТ и трикаприна на пролиферацию костного мозга.
На фиг. 6 показано влияние МСТ на количество клеток костного мозга у иммуносупрессивных животных.
На фиг. 7 показано влияние МСТ на количество селезеночных клеток у иммуносупрессивных животных.
На фиг. 8 показано влияние МСТ и GM-CSF на массу тимуса у здоровых мышей.
На фиг. 9 показано влияние МСТ, каприлата натрия и капрата натрия на количество клеток костного мозга у иммуносупрессивных животных.
На фиг. 10 продемонстрировано химиопротективное действие и противоопухолевая эффективность
МСТ в комбинации с доксорубицином в субтерапевтической концентрации на модели меланомы B16F10.
На фиг. 11 продемонстрировано химиопротективное действие и противоопухолевая эффективность
МСТ в комбинации с циклофосфамидом или таксотером в субтерапевтической концентрации на модели
карциномы молочной железы DA-3.
На фиг. 12 показано химиопротективное действие и противоопухолевая эффективность МСТ в комбинации с циклофосфамидом или таксотером в терапевтической концентрации на модели карциномы
молочной железы DA-3.
Подробное описание изобретения
Химиотерапия и лучевая терапия в высоких дозах разрушают кроветворные клетки в костном мозге, приводя к серьезному снижению нейтрофилов и тромбоцитов у пациентов. После такого лечения пациенты проводят несколько недель в отделениях интенсивной терапии, так как нейтропения приводит к
развитию инфекционных заболеваний и лихорадочного состояния.
Тромбоцитопения приводит к увеличению времени свертывания крови и времени кровотечения, что
требует переливания тромбоцитов. Миелосупрессия является дозалимитирующим фактором при лечении
рака, а недостаточность нейтрофилов и тромбоцитов является основной причиной заболеваемости и
смертности вследствие упомянутого лечения рака.
При трансплантации костного мозга можно использовать два подхода. Перед трансплантацией стимуляция костного мозга может увеличить количество периферических стволовых клетокпредшественников. Однако только что трансплантированный костный мозг не содержит достаточного
количества зрелых нейтрофилов или нейтрофильных интермедиатов для восстановления иммунной системы пациента. У пациента возникает состояние повышенной чувствительности к инфекциям, и увеличивается время свертывания. Терапия, включающая стимуляцию и активацию нейтрофилов, ускоряет
регенерацию после трансплантации костного мозга посредством снижения нейтропении и тромбоцитопении.
Данное изобретение имеет отношение к способу, стимулирующему выживание и активацию нейтрофилов у субъекта. Данные способы направлены на восстановление кроветворной системы пациента.
Гематопоэтическими факторами роста, используемыми в настоящее время для такого лечения, являются
гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), фактор стволовых клеток (SCF) и гранулицито-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). G-CSF и GM-CSF могут сокращать
общий период нейтропении и тромбоцитопении, но еще сохраняется значительное "окно", когда у пациента наблюдается нарушение свертывания крови и повышенная чувствительность к инфекциям.
При трансплантации костного мозга также используют «мобилизацию», чтобы собрать больше
стволовых клеток/клеток-предшественников из периферической крови. Кроветворные стволовые клетки
-3-
007322
в костном мозге мобилизуются в кровь после терапии ростовыми факторами. Использованные для такой
терапии ростовые факторы включают в себя интерлейкин-3 (IL-3), G-CSF, GM-CSF, SCF и рекомбинантный белок слияния, содержащий активные фрагменты как IL-3, так и GM-CSF. Затем после терапии ростовыми факторами мобилизованные стволовые клетки собирали и повторно вводили пациенту после
следующего цикла химиотерапии или лучевой терапии в высоких дозах, чтобы восстановить количество
нейтрофилов и тромбоцитов пациента.
Триглицериды со средней длиной цепи (в описании также называют "МСТ") состоят из глицерина,
этерифицированного жирными кислотами с длиной углеродной цепи из 8 (С8, октановая кислота или
каприловая кислота) и 10 (C10, декановая кислота или каприновая кислота). Обычно МСТ содержит
смесь сложных глицериновых эфиров жирных кислот С8 и С10. Однако МСТ также может содержать
небольшие количества (2±1% каждого) сложных глицериновых эфиров С6 (гексановая кислота или капроновая кислота) и С12 (додекановая кислота или лауриновая кислота). Кродамол™ (CRODAMOL™)
является МСТ, коммерчески поставляемым фирмой Croda Ltd., Toronto (Canada). Как видно из примера
1, Кродамол™ представляет собой МСТ, который содержит сложный глицериновый триэфир жирных
кислот С8 и C10, присутствующих в варьирующих пропорциях. Однако Кродамол™ не содержит сложных эфиров жирных кислот С6 или С12. С другой стороны, триглицериды с длинной цепью (в описании
также называют "LCT") состоят из глицерина, этерифицированного жирными кислотами с длиной углеродной цепи более 12. Типичные жирные кислоты, содержащиеся в LCT, включают пальмитиновую
(С16) и стеариновую (С18) кислоты. Подобно МСТ, LCT является основным компонентом пищевых жиров. В действительности, МСТ и LCT характеризуются значительно отличающимися биологическими
свойствами. Некоторые физиологические различия между МСТ и LCT описаны в Harrison's Principles of
Internal Medicine, 8th Edition, 1520-1521 (1977), McGraw Hill Book Company или 15th Edition, 1668-1669
(2001) . Например, МСТ, в отличие от LCT, не требует гидролиза панкреатической липазой, так как они
всасываются эпителиальными клетками кишечника.
МСТ и составляющие их жирные кислоты со средней длиной цепи являются нетоксичными веществами, которые нашли применение в пищевой и фармацевтической промышленности. Например, K.А.
Traul et al., в Food and Chemical Toxicology 38: 79-98 (2000) сообщил, что МСТ используют для возрастающего числа применений в пищевой и кормовой промышленности, так как они имеют ряд преимуществ по сравнению с LCT. МСТ также используют как эмульгаторы в различных фармацевтических
препаратах для человека и в ветеринарии, и в косметологии. Они упоминаются в целом ряде токсикологических исследований, которые подтвердили безопасность МСТ. Например, отмечено, что в клинических испытаниях подтверждена безопасность потребления МСТ в пищу для человека вплоть до 1 г/кг.
Жирные кислоты С8 и C10 обладают подобной безопасностью и пользой. Например, как описано в
Merck Index, 11th Edition, 266 (1989) , каприловая кислота имеет ID50 (перорально, крысы)=10,08 г/кг и, по
существу, является нетоксичной. В действительности, в разделе 184 Свода Федеральных инструкций
(CFR) Федерального Управления по контролю медикаментов (FDA) США каприловой кислоте дано
GRAS-подтверждение (общепризнана безопасной). Подобно, в соответствии с разделом 172 (CFR) свободные жирные кислоты (например, каприновая, каприловая) и их соли металлов рассматриваются как
безопасные добавки для применения в пищу. Как отмечено D. Dimitrijevic et al. в Journal of Pharmacy and
Pharmacology 53: 149-154 (2001), каприновая кислота (натриевая соль) одобрена для применения людям в
Японии и Швеции как усилитель абсорбции для ректальных лекарственных средств. В патенте США
4602040 (1986) описывают применение МСТ в виде фармацевтического наполнителя. Позднее в публикации РСТ WO 01/97799 описали применение жирных кислот со средней длиной цепи, в частности каприловой и каприновой кислот, как противомикробных агентов.
Однако до тех пор, пока в описываемом исследовании не были получены непредвиденные данные,
эффективность жирных кислот со средней длиной цепи, таких как каприновая кислота, каприловая кислота, или их соли металлов, или моно-, ди- или триглицериды (МСТ), как фактора, способствующего
выживанию и активации нейтрофилов, не была установлена. Как изложено в описании, МСТ содержит
триглицериды жирных кислот С8 (каприловой) и C10 (каприновой), которые составляют 98% активности, имеющей отношение к стимуляции кроветворения и созревания нейтрофилов. D. Waitzberg et al., в
Nutrition 13: 128-132 (1997) сообщил, что липидные эмульсии (LCT и МСТ) только умеренно снижают
бактерицидную функцию нейтрофилов и не оказывают никакого влияния на моноциты. Действительно,
только в публикации, в которой представлены неопределенные указания, что МСТ может влиять на нейтропению, описывают клинические испытания, в которых МСТ все время вводили с LCT и сравнивали с
одним LCT. Никаких исследований с одним МСТ не предпринимали и, таким образом, не было установлено влияние МСТ на иммунную функцию. Однако, результаты, описанные S. Demirer et al. в Clinical
Nutrition 19: 253-258 (2000), указывают, что МСТ усиливают нейтропению, если МСТ комбинировали с
LCT и сравнивали с одним LCT. То есть полученные результаты позволяют предположить, что МСТ ингибирует функцию и/или выживание нейтрофилов. До некоторой степени подтверждая сделанное предположение, в публикации РСТ WO 95/30413 утверждают, что ненасыщенные жирные кислоты с длинной
цепью, такие как линолинеиновая кислота, а также насыщенные жирные кислоты с длинной цепью (С16
или длиннее) могут действовать так, чтобы повысить пролиферацию кроветворных стволовых клеток.
-4-
007322
Данное изобретение относится к применению жирных кислот со средней длиной цепи или их солей
металлов или триглицеридов, или их моно- или диглицеридов, или других аналогов, или МСТ как фактора активации или развития кроветворения и фактора, способствующего выживанию и активации нейтрофилов. При использовании в химиотерапии и лучевой терапии композицию, содержащую жирные кислоты со средней длиной цепи, или их соли металлов, или триглицериды, или их моно- или диглицериды,
или другие аналоги, или МСТ, вводят перед, во время и/или после лечения для того, чтобы сократить
нейтропеническое «окно» и повысить повторное пополнение кроветворной системы. Кроме того, оказывается возможным применять комбинацию жирных кислот со средней длиной цепи вместе с их солями
металлов или триглицеридами, или их моно- или диглицеридами или другими аналогами и/или МСТ на
разных этапах лечения химиотерапией и лучевой терапией (например, жирные кислоты до лечения и
МСТ после). Альтернативно, оказывается возможным вводить одновременно: перед, вовремя и/или после лечения химиотерапией и лучевой терапией. При тяжелой нейтропении композицию, содержащую
жирные кислоты со средней длиной цепи, или их соли металлов, или триглицериды, или их моно- или
диглицериды, или другие аналоги, или МСТ, используют как терапевтическое средство. При трансплантации костного мозга жирные кислоты со средней длиной цепи, или их соли металлов, или триглицериды, или их моно- или диглицериды, или другие аналоги, или МСТ используют, чтобы увеличить количество периферических стволовых клеток, пригодных для трансплантации после прекращения лучевой терапии или химиотерапии. Жирные кислоты со средней длиной цепи, или их соли металлов, или триглицериды, или их моно- или диглицериды, или другие аналоги, или МСТ также можно использовать после
трансплантации костного мозга для того, чтобы стимулировать стволовые клетки костного мозга, таким
образом сокращая время восстановления от нейтропении.
Поэтому способ используют для стимуляции кроветворения, чтобы лечить миелосупрессию, являющуюся результатом химиотерапии или лучевой терапии, хроническую или транзиторную нейтропению, нейтропению, индуцированную лекарственными средствами, и нейтропению, развивающуюся в
результате гематологического заболевания, недостаточности питания, инфекции или лучевой терапии.
Транзиторная нейтропения может быть результатом стресса вследствие перегрузки животного или усиленного движения человека или животного. Способ также используют для стимуляции кроветворения,
чтобы способствовать заживлению раны у пациента, и индукции мобилизации нейтрофилов, чтобы способствовать трансплантации костного мозга у пациента.
Используемые в описании термины "а" или "an" могут означать один или более в зависимости от
контекста, в котором их используют.
Используемая в описании фраза, «композиция, содержащая жирные кислоты со средней длиной цепи, такие как каприновая кислота, или каприловая кислота, или их соли металлов, или триглицериды,
или их моно- или диглицериды, или другие аналоги, или МСТ» подразумевает композицию, содержащую названный активный ингредиент и один или более фармацевтически приемлемых носителей.
Используемый в описании термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к веществу,
которое не препятствует физиологическому действию жирных кислот со средней длиной цепи, таких как
каприновая кислота, или каприловая кислота, или их солей металлов, или триглицеридов, или их моноили диглицеридов, или других аналогов, или МСТ, и которое является нетоксичным для млекопитающих, включая человека.
Композиции данного изобретения, содержащие каприновую или каприловую кислоту, или ее соли,
или триглицериды, или ее моно- или диглицериды, или другие аналоги, или МСТ, получают, используя
каприновую или каприловую кислоту, или ее соли, или триглицериды, или ее моно- или диглицериды,
или другие аналоги, или МСТ и фармацевтически приемлемые носители, по способам, известным специалистам в данной области (MERCK INDEX, Merck & Со, Rahway, NJ). He ограничиваясь, названные
композиции включают жидкости, масла, эмульсии, аэрозоли, ингаляционные препараты, капсулы, пилюли, пластыри и суппозитории.
Все способы включают в себя стадию объединения активного ингредиента(ов) с носителем, который представляет собой один или более вспомогательных ингредиентов.
Употребляемый в описании термин «химиотерапия» относится к способу уничтожения пролиферирующих клеток с использованием цитотоксического агента. Фраза «во время химиотерапии» подразумевает период, в течение которого эффект введенного цитотоксического агента продолжается. С другой
стороны, под фразой, «после химиотерапии» имеют в виду включение всех ситуаций, при которых композицию вводят после введения цитотоксического агента независимо от любого предшествующего введения того же агента, а также независимо от персистенции эффекта введенного цитотоксического агента.
Если способ данного изобретения применяют с химиотерапией, композицию, содержащую каприновую или каприловую кислоту, или ее соли, или триглицериды, или ее моно- или диглицериды, или
другие аналоги, или МСТ, можно вводить до, во время или вслед за химиотерапией (то есть, перед, во
время или вслед за введением цитотоксического агента).
Под термином «цитотоксический агент» подразумевают вещество, которое убивает клетки с высокой степенью пролиферации, например опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки, или кроветворные клетки. Примеры цитотоксического агента, который может быть использован при практиче-5-
007322
ском применении изобретения, не ограничиваясь, включают в себя циклофосфамид, доксорубицин, даунорубицин, винбластин, винкристин, блеомицин, этопозид, топотекан, иринотекан, таксотер, таксол, 5фторурацил, метотрексат, гемцитабин, цисплатин, карбоплатин или хлорамбуцил и агониста любого их
вышеперечисленных соединений. Цитотоксический агент также может быть противовирусным агентом,
например, AZT (то есть, 3'-азидо-3'-дезокситимидин) или 3ТС/ламивудин (то есть, 3-тиацитидин).
Используемый в описании термин "лейкопения" относится к аномальному снижению количества
лейкоцитов в крови.
Используемый в описании термин "нейтропения" относится к присутствию аномально низкого количества нейтрофилов в крови.
В одном предпочтительном аспекте фармацевтическую композицию готовят в виде любой подходящей композиции для перорального, сублингвального введения или ингаляционного (назальный спрей),
внутривенного, внутримышечного, подкожного введения для применения при лечении нейтропении,
тромбоцитопении или как фактора выживания и активации нейтрофилов.
Следует иметь в виду, что количество композиции изобретения, необходимое для применения при
лечении, будет изменяться в зависимости от способа введения, природы состояния, которое лечат, возраста и состояния пациента и будет в конечном счете установлено по усмотрению наблюдающего врача.
Обычно требуемая доза может быть в виде однократной дозы или в виде разделенной общей дозы, принимаемой через определенные интервалы времени, например, в виде двух, трех, четырех или более доз в
день.
Так как оказалось возможным, что для применения в терапии жирные кислоты со средней длиной
цепи, или их соли металлов, или триглицериды, или их моно- или диглицериды, или другие аналоги, или
МСТ могут быть введены в виде необработанного химического вещества, является предпочтительным,
чтобы активный ингредиент вводили в виде фармацевтического препарата.
В предпочтительном аспекте изобретения количество вводимого активного ингредиента должно
быть таким, чтобы концентрация в крови (свободного и/или связанного с сывороточным альбулином)
составляла более 1 мкМ. В особенно предпочтительном аспекте концентрация в крови составляет более 1
мМ.
В другом аспекте фармацевтическая композиция находится в форме, пригодной для перорального
(включая сублингвальное) или парентерального (включая внутримышечное, подкожное, ректальное или
внутривенное) введения. Обычно, когда уместно, препараты могут быть в виде отдельных дозированных
форм и могут быть приготовлены по любому из способов, хорошо известных в области фармации. Все
способы включают в себя стадию связывания активного соединения с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или обоими, а затем, при необходимости, стадию формования в
требуемый препарат. Если требуется, можно применять вышеописанные препараты, адаптированные для
пролонгированного высвобождения активного ингредиента.
Жирные кислоты со средней длиной цепи, или их соли или триглицериды, или их моно- или диглицериды, или другие аналоги, или МСТ также могут быть использованы в комбинации с другими терапевтически активными агентами, такими как цитотоксические противораковые агенты, или другие противораковые средства (иммуномодулирующие или иммунорегулирующие лекарственные средства, или терапевтические вакцины, или лекарственные средства против антиогенеза и так далее), иммуносупрессивные лекарственные средства (включая противовоспалительные лекарственные средства), фактор роста,
такой как колониестимулирующий фактор (предпочтительно GM-CSF или G-CSF), цитокин, такой как
интерлейкин-2 или интерлейкин-15 или их комбинации. Индивидуальные компоненты из таких комбинаций можно вводить или последовательно (до или после) или одновременно в отдельных или объединенных фармацевтических препаратах. Для применения рассмотренные выше комбинации обычно могут
быть в виде фармацевтического препарата и, таким образом, следующий аспект изобретения включает в
себя фармацевтические композиции, содержащие описанную выше комбинацию вместе с их фармацевтически приемлемым носителем.
В предпочтительном варианте способа стимулирования кроветворения пациенту, нуждающемуся в
лечении, вводят фармакологически эффективное количество композиции, содержащей одно или более из
следующих соединений или их комбинаций:
в которых R1 означает насыщенную или ненасыщенную группу алкила С7-С11 с прямой или разветвленной цепью;
А и В независимо означают водород или
и
-6-
007322
X означает гидроксильную группу, оксианион с моно- или дикатионным противоионом металла,
или алкоксигруппу с алкильным фрагментом С1-С4 с прямой или разветвленной цепью.
Специалистам в данной области будет понятно, что в формуле III термин "Z=нуль" указывает, что
изменяющийся Z является необязательным и может быть исключен или замещен водородом.
В альтернативном предпочтительном варианте композиция включает смесь, по крайней мере, двух
соединений формулы I, которые являются триглицеридами со средней длиной цепи (МСТ), в которых А,
В и R1 являются одинаковыми и представляют собой насыщенные или ненасыщенные алкильные группы
с прямыми или разветвленными цепями С7 и С9, соответственно. Альтернативно, композиция включает
смесь двух триглицеридов, в которых первый МСТ характеризуется формулой I, в которой А, В и R1 означают СН3(СН2)6, а второй МСТ характеризуется формулой I, в которой А, В и R1 означают СН3(СН2)8.
Альтернативно, композиция дополнительно содержит от 0,1 до 3% каждого соединения из третьего соединения формулы I, в которой А, В и R1 означают СН3(СН2)4 и четвертого соединения формулы I, в которой А, В и R1 означают СН3 (CH2)10. Альтернативно, композиция представляет собой смесь, содержащую четыре геометрических изомера триглицеридов жирных кислот С8 и С10 следующей формулы:
В альтернативном предпочтительном варианте композиция содержит одно или более соединений
формулы II или формулы III, в которых X означает ОН или X означает оксианион с противоионом металла, такого как кальций, магний, калий и натрий.
В более предпочтительном варианте композиция представляет собой каприловую кислоту, каприновую кислоту, каприлат натрия, капрат натрия, каприлат кальция, капрат кальция, триглицерид каприловой кислоты или триглицерид каприновой кислоты.
Представленные в описании композиции и способы включают в себя следующие аналоги и соединения:
аза-аналоги триглицерида каприловой кислоты или триглицерида каприновой кислоты, предпочтительно, когда аза-аналог представляет собой 1,2,3-O,N,O-триоктаноил-серинол или 1,2,3-O,N,Oтридеканоил-серинол; соединение формулы IV
соединение формулы V
соединение формулы VI, которое образует фармацевтический препарат в результате разложения in
vivo с высвобождением активных веществ, описанных выше
Следующие примеры далее иллюстрируют практическое применение данного изобретения, не ограничивая его. Следует отметить, что выбор дозы жирных кислот со средней длиной цепи, или их солей,
или триглицеридов, или их моно- или диглицеридов, или других аналогов, или МСТ и связанных фармацевтических препаратов, которые следует вводить любому индивидуальному пациенту (человеку или
животному), находится на усмотрении наблюдающего врача, доза будет прописана до известной степени
в соответствии с подходящими дозировками и будет зависеть от стадии заболевания и подобных факторов единственно в пределах компетенции наблюдающего врача.
Пример 1. Анализ Кродамола™ (МСТ: триглицерид каприловой/каприновой кислоты).
Кродамол™ GTCC лот#Т1033-1299 фирмы Croda Ltd (Toronto, Canada) анализировали с помощью
газовой хроматографии (GC). GC-FID-анализ, условия градиента: 100°С-250°С в течение 10 мин, затем
-7-
007322
250°С в течение 25 мин; FID 250°C. Обнаруживали четыре пика: через 22,04 мин (26%), 25,07 мин (43%),
29,16 мин (25%) и через 34,75 мин (5%).
Образец каприлового триглицерида (трикаприлин), полученного от фирмы Sigma-Aldrich
лот#79Н1212, исследовали с помощью газовой хроматографии. GC-FID-анализ, условия градиента:
100°С-250°С в течение 10 мин, затем 250°С в течение 25 мин; FID - 250°С. Наблюдали, главным образом,
один пик на 22,31 минуте (98%).
Пример 2. Ацилирование спирта с использованием хлорангидрида и пиридинового основания
Способ А. Пиридин, CH2Cl2.
Способ В. DMAP, СН2Сl2.
Общий способ А. (Пиридин).
Раствор спирта (~0,1М) в сухом CH2Cl2 и пиридина (4:1) охлаждали до 0°С в атмосфере азота и обрабатывали хлорангидридом (1,2 эквивалента). Реакционную смесь оставляли для медленного нагревания до температуры окружающей среды и перемешивали в течение ночи. Анализ методом TLC (TCX)
(SiO2, EtOAc:гексан 1:9) не выявил никакого оставшегося спирта. Реакционную смесь разбавляли CH2Cl2
и промывали насыщенным водным раствором NH4Cl. Водную фазу экстрагировали CH2Cl2 (х 1) и гексаном (х 1) и объединенные органические фазы промывали насыщенным водным раствором NaCl, высушивали над Na2SO4, фильтровали и выпаривали в вакууме, чтобы получить неочищенный продукт.
Общий способ В (DMAP).
Раствор спирта (~0,1М) в сухом CH2Cl2 охлаждали до 0°С в атмосфере азота и обрабатывали DMAP
(1,3 эквивалента) и хлорангидридом (1,2 эквивалента). Реакционную смесь оставляли для медленного
нагревания до температуры окружающей среды и перемешивали в течение ночи. Анализ методом TLC
(ТСХ) (SiO2, EtOAc:гексан 1:9) не выявил никакого оставшегося спирта. Реакционную смесь разбавляли
CH2Cl2 и промывали насыщенным водным раствором NH4Cl. Водную фазу экстрагировали CH2Cl2 (х 1) и
гексаном (х 1) и объединенные органические фазы промывали насыщенным водным раствором NaCl,
высушивали над Na2SO4, фильтровали и выпаривали в вакууме, чтобы получить неочищенный продукт.
Пример 3. Триглицерид нонаноевой кислоты.
Глицерин (120 мг, 1,30 ммоль) ацилировали нонаноилхлоридом (751 мкл, 4,16 ммоль) в соответствии с общим способом А, пример 2. Очистка методом колоночной хроматографии (Isolute SiO2, элюция
0-5% EtOAc в гексане) давала два продукта, содержащих фракции, которые упаривали в вакууме, чтобы
получить требуемый продукт в виде бесцветной жидкости с чистотой 89% (127 мг, 19%) и 93% (475 мг,
71%), соответственно (GC/FID). Rf (фактор удержания) 0,46 (SiO2, 10% этилацетат в гексане); 1Н ЯМР
(CDCl3, 300 МГц) δН = 5,27 (м, 1Н), 4,29 (дд, 2Н), 4,14 (дд, 2Н), 2,31 (м, 6Н), 1,61 (м, 6Н), 1,27 (м, 30Н),
0,88 (т,9Н); MS (FAB+) m/z = 510 (М-Н+); GC-FID-анализ, условия: градиент 100-250°С в течение 10 мин,
затем 250°С в течение 25 мин; FID 250°C; 27,25 мин.
Пример 4. Диглицерид и моноглицерид нонаноевой кислоты
а) пиридин, CH2Cl2.
Глицерин (100 мг, 1,09 ммоль) ацилировали одним эквивалентом нонаноилхлорида (205 мкл, 1,09
ммоль) в соответствии с общим способом А, пример 2. Очистка с использованием Biotage™ (40S, SiO2,
элюция смесью 10% этилацетат в гексане-100% этилацетат) давала бесцветное масло. Получали два различных компонента.
Диглицерид нонаноевой кислоты получали (73 мг, 18%) в виде белого твердого вещества. Точка
плавления 24-26°С; Rf 0,52 (SiO2, предварительно обработанный Et3N, 30% этилацетат в гексане); 1Н
ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δН = 4,17 (м, 5Н), 2,35 (т, 4Н), 1,63 (м, 4Н), 1,27 (м, 20Н), 0,88 (т, 6Н); MS (FAB+)
m/z = 373 (М+Н+).
Моноглицерид нонаноевой кислоты получали (85 мг, 34%) в виде белого твердого вещества. Точка
плавления 37-38,5°С; Rf 0,08 (SiO2, предварительно обработанный Et3N, 30% этилацетат в гексане); 1Н
-8-
007322
ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δН = 4,18 (м, 2Н), 3,94 (м, 1Н), 3,69 (м, 1Н), 3,62 (м, 1Н), 2,36 (т, 2Н), 1,62 (м, 2Н),
1,28 (м, 10Н), 0,88 (т, 3Н); MS (FAB+) m/z = 233 (М+Н+).
Пример 5. 1,2,3-O,N,О-Тридеканоил-серинол.
Серинол (51 мг, 0,56 ммоль) ацилировали деканоилхлоридом (372 мкл, 1,76 ммоль) в соответствии с
общим способом В, пример 2. Очистка методом MPLC (SiO2, элюция посредством 0%, затем 10% EtOAc
в гексане) давала требуемый продукт в виде белого твердого вещества (301 мг, 97%). Точка плавления
54°С; ТСХ, Rf 0,85 (SiO2, EtOAc:гексан 2:3); 1Н ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δH 0,84 (9Н, т), 1,20-1,27 (36Н, м),
1,52-1,60 (6Н, м), 2,13 (2Н, т), 2,28 (4Н, т), 4,03 (2Н, 2хА - 2хАВХ), 4,19 (2Н, 2хВ - 2хАВХ), 4,41-4,46 (1Н,
м), 5,70 (1Н,д); HRMS m/e рассчитано для C33H63NO5 553,4706, обнаружено 553,4713. GC-FID-анализ,
условия градиента: 100-250°С в течение 10 мин, затем 250°С в течение 25 мин; FID 250°C. Получен главным образом один пик через 14,80 мин (98%).
Пример 6. 1,3-O,O-Дидеканоил-серинол.
Раствор серинола (1,57 г, 17,2 ммоль) в ацетоне (17 мл) и воды (17 мл) обрабатывали триэтиламином (3,60 мл, 25,9 ммоль) и BOC-ON (4,67 г, 19,0 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение ночи. Ацетон упаривали в вакууме, а неочищенную смесь распределяли между EtOAc
и водой. Водную фазу экстрагировали EtOAc (х 3), а объединенные органические экстракты высушивали
над Na2SO4, фильтровали и упаривали в вакууме, чтобы получить желтое твердое вещество. Очистка с
использованием MPLC (SiO2, элюируя 40-80% EtOAc в гексане) давала промежуточный N-BOC-диол в
виде белого кристаллического твердого вещества (2,10 г, 64%). ТХС, Rf 0,15 (SiO2, EtOAc:гексан 4:1); 1Н
ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δН 1,40 (9Н,с), 3,54-3,56 (5Н, м).
Промежуточный N-BOC-диол (50 мг, 0,26 ммоль) ацилировали деканоилхлоридом (173 мкл, 0,83
ммоль) в соответствии с общим способом В. Очистка с использованием MPLC (SiO2, элюируя 0, а затем
10% EtOAc в гексане) давала промежуточный N-BOC-диацил в виде бесцветного масла (115 мг, 88%).
ТХС, Rf 0,80 (Si02, EtOAc:гексан 2:3); 1Н ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δН 0,87 (6Н, т), 1,23-1,30 (24Н, м), 1,44
(9Н, с), 1,56-1,70 (4Н, м), 2,31 (4Н, т), 4,04-4,21 (4Н, м), 4,77-4,80 (1Н, м), 6,73 (1Н, д).
Раствор промежуточного N-BOC-диацила (7 6 мг, 0,15 ммоль) в сухом CH2Cl2 (1/5 мл) охлаждали
до 0°С и обрабатывали раствором 4,0 М безводной HCl в 1,4-диоксане (375 мкл, 1,50 ммоль; конечная
концентрация 0,8 М). Реакционную смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 ч при той же температуре. Добавляли другую порцию 4,0 М безводной НСl в 1,4диоксане (375 мкл, 1,50 ммоль), а реакционную смесь перемешивали в течение следующих 2 ч. Упаривание растворителя давало требуемый продукт в виде белого твердого продукта (69 мг, 100%). Точка плавления 101°С; ТСХ, Rf 0,40 (SiO2, смесь EtOAc:гексан 2:3); 1Н ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δH 0,88 (6Н, т), 1,201,29 (24Н, м), 1,55-1,65 (4Н, м), 2,45-2,52 (4Н, м), 3,72-3,80 (1Н, м), 4,30-4,51 (2Н, м), 8,6-9,0 (3Н, уш.м);
HRMS m/e рассчитано для (М-HCl), C23H45NO4 339,3348, обнаружено 339,3340; GC-FID-анализ, условия
градиента: 100-250°С в течение 10 мин, затем 250°С в течение 25 мин; FID 250°С. Получен, главным образом, один пик через 17,14 мин (94%).
Пример 7. α- и β-1-О-Метил-2,3,4-O,O,O-тридеканоил-L-фукопираноза
1-О-Метил-L-фукопиранозу (593 мг, 3,33 ммоль) синтезировали согласно способу Levene & Muskat
(J. Biol. Chem. 105: 431-441, 1934) и ацилировали деканоилхлоридом (2,90 мл, 14,0 ммоль) согласно об-9-
007322
щему способу В, пример 2. Очистка с применением MPLC (SiO2, элюция 0-5% EtOAc в гексане) давала
α (1,18 г, 55%) и β (0,52 г, 24%) аномеры требуемого продукта в виде бесцветного масла.
Данные для а-аномера: ТСХ, Rf 0,45 (SiO2, смесь EtOAc:гексан 1:9); 1Н ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δН
0,87 (9Н, т), 1,14 (3Н, д), 1,20-1,35 (36Н, м), 1,52-1,68 (4Н, м), 2,18 (2Н, т), 2,29 (1Н, А - АВХ2), 2,32 (1Н,
А - АВХ2), 2,41 (2Н, т), 3,38 (3H, с), 4,13 (1Н, кв.д, J6,5), 4,93 (1Н, д), 5,15 (1Н, дд), 5,30 (1Н, дд), 5,36 (1Н,
дд); HRMS m/e рассчитано для (М-СН3O) C36H65O7 609,4730, обнаружено 609,4720.
Данные для β-аномера: ТСХ, Rf 0,40 (SiO2, смесь EtOAc:гексан 1:9); 1Н ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δН
0,87 (9Н, т, J6, 5Гц), 1,22 (3Н, д), 1,20-1,35 (36Н, м), 1,49-1,67 (4Н, м), 2,18 (2Н, т), 2,25 (1Н,А - АВХ2),
2,29 (1Н,В - АВХ2) , 2,34 (2Н, т), 3,50 (3H, с), 3,81 (1Н, кв.д), 4,35 (1Н, д), 5,03 (1Н, дд), 5,19 (1Н, дд), 5,24
(1Н, дд).
Пример 8. L-глутамат-капрамид
К раствору каприновой кислоты (7,30 ммоль, 1,26 г) в сухом СН2Сl2 (60 мл) в атмосфере азота добавляли сложный ди-трет-бутиловый эфир L-глутаминовой кислоты хлоргидрат (6,09 ммоль, 1,80 г),
DMAP (1,8 ммоль, 0,22 г), диизопропилэтиламин (18 ммоль, 3 мл) и 1-(3-диметиламинопропил)-3этилкарбодиимид хлоргидрат (EDCI) (7,30 ммоль, 1,40 г). Полученный бесцветный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем растворитель удаляли при пониженном давлении,
чтобы получить белый маслянистый остаток. Очистка на Biotage™ (40S SiO2, элюируя смесью 5% этилацетат в гексане-30% этилацетат в гексане) давала бесцветное масло, которое представляло собой капрамид сложного L-глутамат-ди-трет-бутилового эфира (2,47 г, 98%). Rf 0,56 (SiO2, 30% этилацетат в гексане); 1Н ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δН = 6,05 (д, 1Н), 4,45 (м, 1Н), 2,30 (м, 2Н), 2,27 (м, 2Н), 2,16 (т, 2Н), 2,07
(м, 1Н), 1,87 (м, 1Н), 1,58 (м, 2Н), 1,43 (с, 9Н), 1,41 (с, 9Н), 1,23 (м, 12Н, 0,84 (т, 3H).
Удаление защиты ВОС-группой достигали медленным добавлением раствора 4,0 М HCl в 1,4диоксане (23 мл) к раствору производного сложного ди-трет-бутилового эфира (5,75 ммоль, 2,38 г) в
СН2Сl2 (35 мл) при 0°С. Бесцветный раствор оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение дополнительных 20 ч. Затем растворитель удаляли при пониженном давлении, а
полученное белое твердое вещество высушивали, чтобы получить L-глутаматкапрамид (1,71 г, 99%).
Точка плавления 95-96,5°С; 1Н ЯМР (CD3OD, 300 МГц) δH = 4,39 (м, 1Н), 3,27 (д, 1Н), 2,36 (т, 2Н), 2,20
(т, 2Н), 2,13 (м, 1Н), 1,90 (м, 1Н), 1,58 (м, 2Н), 1,27 (м, 12Н), 0,86 (т, 3H); MS (ES+) m/z = 324 (M+Na+),
302 (M+H+); MS (ES-) m/z = 300 (M-H+); ВЭЖХ-анализ, условия: градиент 0,01% TFA в 10-70% ацетонитрила в течение 10 мин; скорость 1,0 мл/мин; 210 нм; 8,93 мин.
Пример 9. Сложный N,N-диметилацетамидный эфир каприновой кислоты.
К раствору каприновой кислоты (8,7 ммоль, 1,5 г) в безводном DMF (80 мл) в атмосфере азота добавляли иодид натрия (0,87 ммоль, 130 мг) с последующим добавлением диметилхлорацетамида (9,6
ммоль, 985 мкл). Затем добавляли карбонат калия (9,6 ммоль, 1,3 г) и полученную суспензию перемешивали при 90°С в течение 5 дней. Реакционную смесь оставляли для охлаждения при комнатной температуре, а потом смешивали с дистиллированной водой. Продукт экстрагировали этилацетатом (х 3). Объединенные органические фазы промывали водным раствором NaHCO3, высушивали Na2SO4, фильтровали
и концентрировали при пониженном давлении. Полученную желтую жидкость очищали на Biotage™ (40
M, SiO2, элюируя смесью 25% этилацетат в гексане-50% этилацетат в гексане). Сложный N,Nдиметилацетамидный эфир каприновой кислоты получали (2,03 г, 92%) в виде белого порошка. Точка
плавления 42-42,5°С; Rf 0,55 (SiO2, этилацетат) ; 1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δН = 4,64 (с, 2Н), 2,92 (с, 3H),
2,91 (с, 3H), 2,38 (т, 2Н), 1,62 (кв.т, 2Н), 1,22 (м, 12Н), 0,83 (т, 3H); MS (ES+) m/z = 537 (2M+Na+), 280
(M+Na+), 258 (M+H+).
Пример 10. Исследование апоптоза и продолжительности существования нейтрофилов in vitro.
Продолжительность существования нейтрофилов определяли, как описано Lagraoui и Gagnon (Cell
Mol. Biol. 43: 313-318, 1997). Нейтрофилы получали из периферической крови здоровых волонтеров.
Кровь подвергали градиентному центрифугированию с Lympholyte-poly (Cedarlane, Hornby, Canada) с
последующим гипотоническим лизисом контаминирующих эритроцитов. Клетки суспендировали в
RPMI (Gibco, Burlington, Canada), дополненной 10% FBS (Hyclone, Logan USA). Конечные клеточные
препараты состояли из >95% нейтрофилов, что было установлено окрашиванием по методу Райта-Гимза.
Жизнеспособность, определенная методом вытеснения трипан голубого, составляла более 97%. Полиморфно-ядерные лейкоциты (PMN) имели короткий полупериод существования и быстро подвергались
характерным изменениям, указывающим на апоптоз. Апоптоз оценивали по способу, описанному
Nicoletti et al., J. Immunol. Meth. 139: 271-279 (1991). Кратко, свежевыделенные нейтрофилы инкубирова- 10 -
007322
ли в течение 24 ч при 37°С с различными концентрациями МСТ. После инкубации клетки окрашивали
иодидом пропидия (PI, Sigma) и анализировали в отношении апоптоза, используя проточный цитометр
XL (Coulter). Затем данные выражали как процент апоптотических клеток.
На фиг. 1 представлена компиляция нескольких экспериментов, в которых определяли апоптоз нейтрофилов в отсутствие (контроль) или в присутствии различных концентраций МСТ. Результаты указывают, что в присутствии МСТ in vitro апоптоз нейтрофилов ингибировался вплоть до 90% и что ингибирование было дозазависимым. Таким образом, МСТ может повышает сохранность нейтрофилов и может
применяться как фактор, способствующий выживанию нейтрофилов.
Пример 11. Исследование фагоцитоза PMN in vitro.
Нейтрофилы (2х106/мл) инкубировали в течение 24 ч при 37°С в среде, содержащей 5% СО2 и 95%
влажности с различными концентрациями МСТ. Через 24 ч определяли жизнеспособность методом вытеснения трипан голубого и клетки промывали три раза PBS, содержащим 2 мМ глюкозы, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ
CaCl2. Затем концентрацию клеток доводили до 1x106 клеток/мл, инкубировали с микросферами флуоресцирующего карбоксилата (1/10 разведение). После 30 мин инкубации нейтрофилы промывали и фиксировали в
2% параформальдегиде. Исследовали поглощение микросфер фиксированными нейтрофилами, используя
проточный цитометр XL (Coulter). Затем данные представляли как процент фагоцитарных клеток.
На фиг. 2 представлены полученные данные нескольких экспериментов, в которых определяли фагоцитарную активность PMN в отсутствие (контроль) или в присутствии различных концентраций МСТ.
Результаты показывают, что МСТ повышает фагоцитарную активность PMN человека. Фагоцитарная
активность увеличивалась вплоть до от двух до трех раз от контрольных величин и степень стимуляции
зависела от иммунного статуса донора.
Пример 12. Влияние доксорубицина на апоптоз нейтрофилов.
PMN выделяли, как описано в примере 10. Клетки (2 х 106/мл) инкубировали в течение 4 ч при 37°С
в 5% СО2 и 95% влажности в присутствии различных концентраций химиотерапевтического агента, доксорубицина. Апоптотические клетки оценивали, как описано в примере 10. Данные выражали как процент апоптотических клеток. Данные представленные на фигуре 3А и 3В показывают, что доксорубицин
индуцирует апоптоз PMN.
Пример 13. МСТ устраняет доксорубицин-индуцированный апоптоз нейтрофилов.
PMN выделяли, как описано в примере 10. Клетки (2 х 106/мл) инкубировали в течение 4 ч при 37°С
в 5% CO2 и 95% влажности в присутствии различных концентраций доксорубицина в присутствии и без
МСТ (2,5% и 5,0%). Апоптотические клетки оценивали, как описано в примере 10. Данные выражали как
процент апоптотических клеток.
В табл. 1 представлены данные двух экспериментов, в которых определяли химиопротективное
действие МСТ на PMN. Результаты представляли как процент апоптотических клеток после 4 ч инкубации в присутствии или в отсутствие доксорубицина в присутствии или без МСТ. Как и в примере 12,
доксорубицин индуцировал апоптоз PMN in vitro. Однако, в присутствии МСТ в концентрации 2,5% и
5% (об./об.) апоптотическое действие доксорубицина ингибировалось. Таким образом, МСТ проявляет
антиапоптотическое действие на PMN. Апоптоз также изучали, используя способ с аннексином VFITC/PI (иодид пропидия) в соответствии с рекомендациями производителя Biosources (набор для определения апоптоза с апомеченным аннексином-VFITC #PHN 1018). Аннексин V связывается с фосфатидил-серином, который перемещается из внутренней на внешнюю мембрану в период от ранней и до
поздней фазы апоптоза. Кратко, нейтрофилы инкубировали в присутствии или в отсутствие различных
концентраций доксорубицина и МСТ. Через 24 ч нейтрофилы промывали PBS и окрашивали 2 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл PI (Sigma, 1 мг/мл) в течение 20 мин. После инкубации окрашенные клетки
фиксировали в параформальдегиде (1%) и исследовали относительно апоптоза, используя проточный
цитометр XL (Coulter). Затем данные представляли как процент апоптотических клеток.
На фиг. 4А представлен времязависимый ответ действия МСТ на обработанные доксорубицином
нейтрофилы. МСТ устраняет индуцированный доксорубицином апоптоз нейтрофилов в зависимости от
времени и дозы.
На фиг. 4В представлен времязависимый ответ действия доксорубицина на обработанные МСТ
нейтрофилы. МСТ защищает дозазависимым способом нейтрофилы от доксорубицининдуцированного
апоптоза, когда применяли за 4 ч перед введением токсического агента (доксорубицина).
Таблица 1. Защитное действие МСТ на доксорубицин-индуцированный апоптоз нейтрофилов
- 11 -
007322
Пример 14. МСТ устраняет индуцированный доксорубицином апоптоз нейтрофилов: сравнение с
GM-CSF.
В табл. 2 продемонстрировано влияние GM-CSF, МСТ и трикаприлина на индуцированный доксорубицином апоптоз нейтрофилов человека. GM-CSF и МСТ способны спасать или защищать нейтрофилы человека от доксорубицининдуцированного апоптоза. Трикаприлин устраняет доксорубицининдуцированный апоптоз и, кроме того, повышает жизнеспособность нейтрофилов человека в более высокой степени, чем жизнеспособность, наблюдаемая в необработанных нейтрофилах (контроль, отсутствие доксорубицина).
Таблица 2. Защитное действие МСТ и GM-CSF на индуцированный доксорубицином апоптоз
нейтрофилов
Пример 15. МСТ и трикаприн увеличивают пролиферацию костного мозга in vitro.
Клетки костного мозга получали из бедра самок мышей C57BL/6 (в возрасте от 6 до 8 недель).
Клетки приливали и промывали PBS. Собранные клетки центрифугировали и повторно суспендировали
при концентрации 2х106 клеток/мл. 100 мкл клеток (2х105 клеток) инкубировали в 96-луночных титрационных микропланшетах в течение 48 ч в присутствии или в отсутствие МСТ или трикаприна. После инкубации клетки подвергали импульсному мечению 1мк Ки [3Н]-тимидина в течение 6 ч. Планшеты собирали на Tomteck и считали на микробета β-счетчике. Включение [3Н]-тимидина в ДНК является прямым
показателем клеточной пролиферации.
На фиг. 5 представлено типичное исследование влияния МСТ и трикаприна на пролиферацию клеток костного мозга. МСТ и трикаприн увеличивают пролиферацию клеток костного мозга в 3-5 раз по
сравнению с контролем.
Пример 16. Исследование химиопротекции: In vivo индукция пролиферации или сохранности иммунных клеток с помощью МСТ.
У самок мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель подавляли иммунную систему воздействием 80 мг 5фторурацила (5-FU), или 100-200 мг циклофосфамида (CY), или 12 мг таксотера (ТХ) , которые вводили
внутривенно в 0 день. Для исследования иммунопротективного влияния МСТ или других соединений
мышам предварительно давали тестируемое соединение перорально на -3, -2 и -1 день или вводили внутривенно в 0 день. Мышей умерщвляли на +5 день проколом сердца и смещением области шеи. Затем
клеточную суспензию получали из тимуса, селезенки и костного мозга следующим образом.
Ткани измельчали в PBS-буфере и контаминирующие эритроциты лизировали в АСК-буфере (155
мМ NH4Cl, 12 мМ NaHCO3, 0,1 мМ EDTA, рН 7,3) в течение 5 мин. Затем клетки собирали центрифугированием и промывали три раза в PBS и повторно суспендировали в тканевой культуральной среде.
Клетки считали на гемоцитометре.
Результаты показали, что МСТ значительно увеличивает количество клеток в иммунной ткани нормальных и иммуносупрессивных животных по сравнению с одним наполнителем, что продемонстрировано в следующих таблицах и фигурах. В зависимости от экспериментов и иммунного статуса мышей
МСТ может увеличивать количество клеток костного мозга и/или клеток селезенки, и/или клеток тимуса.
На фиг. 6 показано влияние МСТ на количество клеток костного мозга у иммуносупрессивных животных. Только CY и 5-FU уменьшали количество клеток костного мозга по сравнению с контролем (нецитотоксическое действие). У мыши введение таксотера не оказывало никакого существенного влияния
на количество клеток костного мозга. В супрессивном костном мозге введение МСТ (6,25 мкМоль на
мышь) на -3, -2 и -1 дни значительно повышало количество клеток костного мозга.
На фиг. 7 продемонстрировано влияние МСТ на количество клеток селезенки у иммуносупрессивных мышей, которые получали МСТ перорально по схеме предварительного введения. Все цитотоксические лекарственные средства (CY, 5-FU и ТХ) значительно снижали количество селезеночных клеток по
сравнению с контролем. Введение МСТ (6,25 мкМоль на мышь) на -3, -2 и -1 дни существенно увеличивало количество селезеночных клеток с «Р» менее 0,0017, 0,009 и 0,0036 для CY, 5-FU и ТХ, соответственно.
Кроме того, МСТ значительно повышало количество клеток костного мозга у нормальных мышей,
когда вводили внутривенно в 0 день (табл. 3). Однако одной внутривенной инъекции МСТ оказалось недостаточно, чтобы повысить количество селезеночных клеток как у нормальных, так и у иммуносупрессивных мышей.
- 12 -
007322
Таблица 3. Влияние циклофосфамида (CY) и CY + МСТ на клетки костного мозга
и селезенки (нормальные мыши)
Пример 17. Исследование химиопротекции: In vivo зависимость доза-ответ индукции пролиферации
иммунных клеток посредством МСТ при введении нормальным мышам в день -3, -2 и -1.
In vivo оценивали зависимость доза-ответ индукции пролиферации иммунных клеток посредством
МСТ по протоколу, описанному в примере 16.
В табл. 4 показана зависимость доза-ответ при лечении МСТ, введенного перорально нормальным
мышам в -3, -2 и -1 день. МСТ значительно увеличивал количество клеток костного мозга и селезенки.
Таблица 4. Влияние МСТ на нормальных мышей
Пример 18. Исследование химиопротекции: In vivo индукция пролиферации или защиты иммунных
клеток: Сравнение действия МСТ с эффектом GM-CSF.
Сравнительное исследование индукции пролиферации/регенерации или защиты иммунных клеток
in vivo проводили, следуя протоколу, описанному в примере 16.
Сравнительное исследование МСТ и GM-CSF проводили на нормальных и иммуносупрессивных
животных. По сравнению с МСТ, GM-CSF не оказывал никакого существенного действия на количество
клеток костного мозга и селезенки у иммуносупрессивных животных. Значительное влияние GM-CSF
наблюдали только на массу тимуса у нормальных мышей (фиг. 8). В этом случае МСТ проявлял эффект,
подобный действию GM-CSF.
Пример 19. Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние каприловой кислоты и каприновой кислоты на индукцию пролиферации или
защиты иммунных клеток in vivo по протоколу, описанному в примере 16.
Как видно из табл. 5, только каприновая кислота значительно повышала количество клеток костного мозга. Не выявлено никакого существенного влияния на количество селезеночных клеток по сравнению с мышами, обработанными (леченными) циклофосфамидом.
Таблица 5. Влияние циклофосфамида (CY), CY + каприловая кислота и CY + каприновая кислота на клетки костного мозга и селезенки
Пример 20. Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние трикаприлина и трикаприна на индукцию пролиферации и защиты иммунных
клеток in vivo по протоколу, описанному в примере 16.
Трикаприлин и трикаприн оба оказывают влияние на пролиферацию или защиту количества клеток
костного мозга у CY-обработанных мышей (табл. 6) . Не наблюдали никакого существенного влияния на
количество селезеночных клеток по сравнению с мышами, обработанными циклофосфамидом.
- 13 -
007322
Таблица 6. Влияние циклофосфамида (CY), CY + трикаприлина и CY +
трикаприна на клетки костного мозга и селезенки
Пример 21. Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние нонаноевой кислоты и лауриновой кислоты на индукцию пролиферации и защиты иммунных клеток in vivo по протоколу, описанному в примере 16.
У мышей, обработанных CY, наблюдали значительное увеличение пролиферации или защиты количества клеток костного мозга и селезенки в результате предварительного введения лауриновой кислоты. Однако нонаноевая кислота продемонстрировала слабое (незначительное) влияние на количество
иммунных клеток (табл. 7) по сравнению с мышами, обработанными циклофосфамидом.
Таблица 7. Влияние циклофосфамида (CY), CY + нонаноевая кислоа и CY +
лауриновая кислота на клетки костного мозга и селезенки
Пример 22. Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние трилаурина и тримиристина на индукцию пролиферации и защиту иммунных
клеток in vivo по протоколу, описанному в примере 16.
Трилаурин и тримиристин оказывали слабое (незначительное) влияние на пролиферацию и защиту
количества клеток костного мозга и селезенки у CY-иммуносупрессивных мышей (табл. 8).
Таблица 8. Влияние циклофосфамида (CY), CY + трилаурин и CY +
тримиристин на клетки костного мозга и селезенки
Пример 23. Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние трикапроина и капроата натрия на индукцию пролиферации или защиту иммунных клеток по протоколу, описанному в примере 16.
Трикапроин и капроат натрия оказывали слабое (незначительное) влияние на пролиферацию и защиту количества клеток костного мозга и селезенки у CY-иммуносупрессивных мышей (табл. 9).
Таблица 9. Влияние циклофосфамида (CY), CY + трикапроин и CY + капроат натрия на клетки костного мозга и селезенки
- 14 -
007322
Пример 24. Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние каприлата натрия и капрата натрия на индукцию пролиферации или защиту
иммунных клеток по протоколу, описанному в примере 16.
Наблюдали значительное увеличение пролиферации защиту клеток костного мозга у CYиммуносупрессивных мышей в результате предварительного введения каприлата натрия и капрата натрия (фиг. 9).
Пример 25. Исследования химиопротекции: схемы предварительного введения.
Исследования химиопротекции проводили, как описано в примере 16, за исключением того, что
мышей подвергали постобработке МСТ, каприлатом натрия, капратом натрия или каприновой кислотой
перорально на 1, 2, 3 и 4 день.
Наблюдали значительное увеличение количества клеток костного мозга при постобработке МСТ
каприлатом натрия и капратом натрия у CY-обработанных мышей (табл. 10). Каприновая кислота, когда
использовали по схеме постобработки, индуцировала значительное увеличение количества клеток селезенки и небольшое увеличение количества клеток костного мозга (табл. 11).
Таблица 10. Влияние пост-обработки циклофосфамидом (CY), CY + МСТ, CY +
каприлат натрия и CY + капрат натрия на клетки костного мозга и селезенки
Таблица 11. Влияние пост-обработки циклофосфамидом (CY), CY + каприновая
кислота на клетки костного мозга и селезенки
Пример 26. Исследования химиопротекции: исследование иммунофенотипирования.
Самкам мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель предварительно вводили в -3, -2 и -1 день перорально или в 0 день внутривенно различные концентрации МСТ. Также иммунофенотипирование проводили
на иммуносупрессивных животных. Иммуносупрессию достигали внутривенным введением 80 мг/кг 5фторурацила (5-FU) или 100-200 мг/кг циклофосфамида (CY), или 12 мг/кг таксотера (ТХ) в 0 день. Мышей умерщвляли на 5 день проколом сердца. Кровь и селезенки собирали и получали клеточные суспензии, а эритроциты лизировали в АСК-буфере (155 мМ NH4Cl, 12 мМ NaHCO3, 0,1 мМ EDTA, рН 7,3) в
течение 5 мин. Клетки промывали три раза в PBS, рН 7,4 и повторно суспендировали в тканевой культуральной среде. Затем клетки инкубировали в течение 45 мин на льду с флуоресцеином изотиоцианатом
(FITC) или фикоэритрином (РЕ) конъюгированным с маркером клеточной поверхности в соответствии с
- 15 -
007322
рекомендацией производителя (Gibco/BRL, Cedarlane, Boehringer Mannheim). Затем клетки промывали в
PBS, фиксировали 1% параформальдегидом и анализировали на проточном цитометре XL Coulter. Анализ клеточных субпопуляций осуществляли посредством определения стандартных маркеров клеточной
поверхности, которыми являются следующие: TCR (рецептор Т-клеток), CD4 (Т-хелпер), CD8 (Тцитотоксичный агент/супрессор), CD11b (макрофаг), NK (NK-клетки) и Ly5 (В-клетки).
Клетки костного мозга получали, как описано в примере 15. Клетки окрашивали в результате 45минутной инкубации с FITC или РЕ, конъюгированными с маркером клеточной поверхности в соответствии с рекомендацией производителя. Затем клетки промывали PBS, фиксировали 1% параформальдегидом и анализировали на проточном цитометре XL Coulter. Анализ клеточных субпопуляций осуществляли, определяя стандартные маркеры клеточной поверхности, которыми были следующие: CD34 (гемотопоэтические клетки-предшественники), CD41 (тромбоциты, мегакариоциты), CD13 (миеломоноцитарные стволовые клетки, миелоциты, промоноциты) и CD38 (лимфоидные стволовые клетки, про-В, преВ).
В табл. 12 продемонстрировано влияние МСТ на результаты иммунофенотипирования клеток крови
и селезенки у нормальных мышей. При иммунофенотипировании клеток крови показано, что МСТ увеличивает клеточные субпопуляции CD8+ и LY5+. В некоторых экспериментах показано, что МСТ незначительно увеличивает субпопуляцию LY5-TCR- (данные не представлены). При иммунофенотипировании клеток селезенки показано, что МСТ значительно повышает относительный процент клеток LY5TCR- и CD4+. LY5-TCR- являются ни В- и ни Т-клетками и могут представлять собой нейтрофилы.
При иммунофенотипировании клеток крови и селезенки показано, что, если вводили иммуносупрессивным животным, то МСТ увеличивал относительный процент клеток LY5-TCR- (вероятно нейтрофилы) и CD11+ (макрофаг) по сравнению с одним циклофосфамидом. Названные клеточные субпопуляции происходили от миелоидной клетки-предшественника (табл. 13).
Таблица 12. Влияние МСТ на иммунофенотипирование клеток крови и селезенки
у нормальных мышей
Таблица 13. Влияние МСТ на иммунофенотипирование клеток крови и
селезенки у циклофосфамид-иммуносупрессивных нормальных мышей
(CY, 200 мг/кг)
Пример 27. Исследования химиопротекции: исследование иммунофенотипирования.
Иммунофенотипирование клеток проводили с применением тримиристина, трилаурина, каприновой
кислоты и капроата натрия, следуя протоколу, описанному в примере 26.
В табл. 14 показано влияние названных аналогов МСТ на данные иммунофенотипирования клеток
крови и селезенки. Тримиристин и трилаурин не оказывали никакого существенного влияния на клетки
крови по сравнению с одним циклофосфамидом. Однако, на клетках селезенки тримиристин и трилаурин
повышали относительный процент CD11+. Кроме того, трилаурин индуцировал значительное увеличение в клеточных субпопуляциях LY5-TCR- и NK+.
- 16 -
007322
Интересно, что каприновая кислота и капроат натрия значительно повышали относительный процент LY5-TCR-клеток в крови. На селезенке каприновая кислота не оказывала никакого существенного
влияния по сравнению с одним циклофосфамидом.
Таблица 14. Влияние тримири стина, трилаурина, каприновой кислоты и
капроата натрия на иммунофенотипирование клеток крови и селезенки у
циклофосфамид-иммуносупрессивных мышей (CY, 200 мг/кг)
Пример 28. Исследования химиопротекции.
Иммунофенотипирование клеток костного мозга. Оценивали влияние МСТ, каприлат натрия, капрата натрия при иммунофенотипировании клеток костного мозга по протоколу, описанному в примере
26. Обработка циклофосфамидом индуцировала значительное увеличение всех исследуемых субпопуляций (CD34+, CD13+, CD14+ и CD38+). Добавление МСТ или каприлата натрия, или капрата натрия увеличивало количество линии клеток CD13+, которые являются миеломоноцитарными стволовыми клетками, миелоцитами и промоноцитами. Отмеченное увеличение относительного процента CD13+ оказалось значительным по сравнению с применением одного циклофосфамида. Результаты четко продемонстрировали, что МСТ и другие родственные соединения индуцируют существенное увеличение количества клеток костного мозга (что приведено в предшествующих примерах) и, кроме того, повышают относительный процент предшественника фагоцитарных клеток (PMN и моноцитов). Это может приводить к
лучшему восстановлению после цитотоксического лечения или защите от инфекционных агентов (табл.
15).
Таблица 15. Влияние МСТ, каприлата натрия и капрата натрия на
иммунофенотипирование клеток костного мозга у циклофосфамидиммуносупрессивных мышей (CY, 200 мг/кг)
Пример 29. Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние тридеканоил-серинола и дидеканоил-серинола на индукцию пролиферации и
сохранность иммунных клеток in vivo по протоколу, описанному в примере 16.
Как видно из табл. 16, тридеканоил-серинол значительно повышает количество клеток селезенки.
Не выявлено никакого существенного влияния на количество клеток костного мозга.
- 17 -
007322
Таблица 16. Влияние циклофосфамида (CY), CY + тридеканоил-серинол
и CY + дидеканоил-серинол на клетки костного мозга и селезенки
Пример 30. Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние α-метилтридеканоил-L-фукопиранозы и β-метилтридеканоил-L-фукопиранозы
на индукцию пролиферации и защиту иммунных клеток in vivo по протоколу, описанному в примере 16.
Как видно из таблицы 17, β-метилтридеканоил-L-фукопираноза оказывала слабое (незначительное)
действие на количество клеток костного мозга по сравнению с циклофосфамидобработанными мышами.
Отсутствие активности α-метиланомера предполагали ввиду известной нестабильности αалкилпиранозидов.
Таблица 17. Влияние циклофосфамида (CY), CY + α-метилтридеканоил-Lфукопираноза и CY + β-метилтридеканоил-L-фукопираноза на костный мозг
Пример 31: Исследования химиопротекции.
Оценивали влияние этилкапрата и сложного N,N-диметилацетамидного эфира каприновой кислоты
на индукцию пролиферации и защиты иммунных клеток in vivo по протоколу, описанному в примере 16.
Как показано в табл. 18, только N,N-диметилацетамид каприновой кислоты значительно увеличивал
количество клеток костного мозга. Не обнаружено никакого существенного влияния на количество клеток селезенки.
Таблица 18. Влияние циклофосфамида (CY), CY + этилкапрат и CY + N,Nдиметилацетамид каприновой кислоты на костный мозг
Пример 32. Противоопухолевая активность.
Самкам мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель внутривенно вводили в 0 день 1 х 105 клеток меланомы B16F10 из АТСС (источник клеточная культура, Dr. I.J. Filder). Затем животным производили
внутривенную инъекцию с или без МСТ (25 мкМоль/мышь) на 7, 9, 14, и 16 день и 10 мг/кг доксорубицина на 10 и 17 день. Мышей умерщвляли на 22 день. Регистрировали массу тела и объем опухоли.
Окончательный объем опухоли получали посредством определения двумерного размера кронциркулем,
используя формулу 0,4 (ахВ2) , где а означает основной размер опухоли и b означает минорный перпендикулярный размер.
Описываемый эксперимент проводили, чтобы проверить, не является ли МСТ стимулирующим или
защищающим раковые клетки агентом скорее, чем иммунные клетки.
На фиг. 10 продемонстрировано химиопротективное действие и противоопухолевая эффективность
МСТ в комбинации с субтерапевтической концентрацией доксорубицина на модели меланомы B16F10.
МСТ индуцирует небольшое уменьшение (Т/С /лечение по сравнению с контролем/ около 20%) объема
опухоли настолько, насколько снижала субтерапевтическая концентрация доксорубицина (Т/С около
25% снижения), когда применяли один доксорубицин. Наблюдали аддитивный эффект, когда МСТ применяли в сочетании с доксорубицином (Т/С около 45-50%). Приведенные данные указывают, что оказы-
- 18 -
007322
вается возможным достижение терапевтического действия, когда МСТ комбинируют с субтерапевтической концентрацией цитотоксических лекарственных средств.
Пример 33: Противоопухолевая активность.
Сингенная опухоль DMBA3 (DA-3, модель карциномы молочной железы) развивалась из предракового поражения, обработанного 7,12-диметилбензантраценом у самок мышей BALB/c. Клетки DA-3 выращивали в виде монослойных культур в пластиковых флаконах в RPMI-1640, содержащей 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1 мкМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 100 мкг/мл гентамицина сульфата.
Кроме того, среда была дополнена 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом и 10% фетальной бычьей сывороткой.
Опухоли DA-3 серийно пассировали in vivo посредством подкожной инокуляции 5x105 жизнеспособных
опухолевых клеток, чтобы продуцировать локализованные опухоли у мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель. Затем животных периодически обследовали посредством ручной пальпации для выявления опухоли. Окончательный объем опухоли получали в результате определения двумерного размера кронциркулем, используя формулу 0,4 (axb2), где а означает основной размер опухоли и b означает минорный перпендикулярный размер. Опухоли становились пальпируемыми обычно на 7-10 день после инокуляции.
Две схемы лечения использовали для оценки противоопухолевой эффективности и предупреждения
опухоли МСТ в комбинации с циклофосфамидом (CY, 100 мг/кг) и таксотером (ТХ, 20 мг/кг) на модели
опухоли DA-3. Мышам BALB/c вводили опухолевые клетки в 0 день. Лечение МСТ производили перорально на 6, 7 и 8 день; 13, 14 и 15 дни; 20, 21 и 23 дни с последующим лечением посредством CY или
ТХ, вводимых внутривенно в виде однократной болюсной инъекции на 9 и 16 дни. Массу тела и объем
опухоли регистировали с 4 дня до 23 дня. На 23 день всех животных умерщвляли. %Т/С (лечение по
сравнению с контролем) рассчитывали как соотношение опухолевых объемов в завершающем периоде у
леченой группы, разделенных на соответствующие объемы у контрольной группы, множимого на 100.
По критериям NCI продукт считают эффективным, если %Т/С составляет ≤40%.
Описанные эксперименты проводили, чтобы установить, не являются ли МСТ усиливающими или
защищающими раковые клетки агентами скорее, чем иммунные клетки. На фиг. 11 показано химиопротективное действие и противоопухолевая эффективность МСТ в комбинации с субтерапевтической концентрацией CY и ТХ на модели карциномы молочной железы DA-3. МСТ индуцировал небольшое снижение (Т/С около 18%) объема опухоли по сравнению с контролем. Когда МСТ применяли в комбинации
с CY или ТХ, не наблюдали никакого увеличения объема опухоли. Однако когда МСТ применяли в комбинации с CY, наблюдали терапевтический ответ (Т/С=39,4%). Полученные результаты показывают, что
терапевтическая активность может быть достигнута, когда МСТ комбинируют с субтерапевтической
концентрацией CY. Описанный эффект является следствием общего увеличения эффективности иммунных клеток у животных, леченых МСТ (фиг. 11 и табл. 19).
Таблица 19. Влияние МСТ на объем опухоли в комбинации с
субтерапевтической концентрации циклофосфамида (CY, 100
мг/кг) и таксотера (ТХ, 20 мг/кг)
Пример 34. Противоопухолевая активность.
Оценивали противоопухолевую и химиопротективную эффективность по протоколу, описанному в
примере 30 за исключением применения терапевтической концентрации цитотоксических лекарственных
средств (циклофосфамид, 200 мг/кг; таксотер, 30 мг/кг).
Описанный эксперимент проводили, чтобы проверить, не является ли МСТ стимулирующим или
защищающим раковые клетки агентом скорее, чем иммунные клетки. На фиг. 12 продемонстрировано
химиопротективное действие и противоопухолевая эффективность МСТ в комбинации с терапевтической концентрацией CY и ТХ на модели карциномы молочной железы DA-3. МСТ индуцирует небольшое уменьшение объема опухоли по сравнению с контролем. Когда МСТ применяли в комбинации с CY
или ТХ, не наблюдали никакого увеличения объема опухоли. Когда лечили CY или CY+MCT, наблюдали значительное уменьшение объема опухоли. Кроме того, при лечении МСТ в сочетании с ТХ
(р<0,0327) достигали многозначительного ответа в виде снижения объема опухоли по сравнению с применением одного ТХ, которое не оказалось значимым по сравнению с контрольными мышами (р=0,1211)
(табл. 20). Полученные результаты указывают, что можно достигнуть терапевтической активности, когда
МСТ комбинируют с незначительной терапевтической концентрацией ТХ. Названный эффект может
быть следствием общего увеличения эффективности иммунных клеток у животных, леченных МСТ.
- 19 -
007322
Таблица 20. Влияние МСТ в комбинации с терапевтической концентрацией циклофосфамида (CY, 200 мг/кг) и таксотера (ТХ, 30
мг/кг) на объем опухоли
Все ссылки, цитируемые в данном документе, включены в описание цитированием в их полном
объеме.
Модификации и изменения композиций и способов, описанных в изобретении, станут очевидными
специалистам в данной области из предшествующего описания. Такие модификации и изменения входят
в объем прилагаемой формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение соединения для производства лекарственного средства для лечения состояний, выбранных из миелосупрессии, ранений, трансплантации костного мозга и нейропении, причем указанное
соединение имеет любую из формул I, II, IIа, III и IIIа
в которых R1 означает С7-11 алкил;
А и В означают независимо водород или
R2 означает Н или C1-4 алкил,
М означает одновалентный катион металла (n=1) или дикатион (n=2);
Y означает О или NH и
Z означает О, NH, СН2О или связь.
2. Применение по п.1, в котором соединение является жирной кислотой со средней длиной цепи
формулы II (R2=H).
3. Применение по п.1, в котором соединение является солью формулы IIа, и М является катионом
Са, Mg, K и Na.
4. Применение по п.1, в котором соединение является каприловой кислотой, каприновой кислотой,
триглицеридом каприловой и триглицеридом каприновой кислот.
5. Применение по п.1, в котором соединение является каприлатом натрия, капратом натрия, каприлатом кальция или капратом кальция.
6. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором состояние представляет собой
вызванную лекарством нейропению или нейропению, появляющуюся в результате гематологического
заболевания, нейропению, развивающуюся в результате инфекции, нейропению, развивающуюся в результате инфекции или в результате лучевой терапии.
7. Фармацевтическая композиция, включающая соединение как определено в любом из пп.1-5 и колониестимулирующего фактора человека, для одновременного или раздельного применения при лечении
состояний как определено в пп.1-6.
8. Фармацевтическая композиция по п.7, в которой колониестимулирующий фактор представляет
собой G-CSF или GM-CSF.
9. Фармацевтическая композиция, включающая соединение как определено в любом из пп.1-5 и человеческий цитокин, для одновременного или раздельного применения при лечении состояний как определено в пп.1-6.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, в которой цитокин представляет собой интерлейкин 2
или интерлейкин 15.
- 20 -
007322
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3А
Фиг. 3В
- 21 -
007322
Фиг. 4А
Фиг. 4В
Фиг. 5
Фиг. 6
- 22 -
007322
Фиг. 7
Фиг. 8
Фиг. 9
- 23 -
007322
Фиг. 10
Фиг. 11
Фиг. 12
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 24 -