Иммуномодулирующая диета

УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРИКО II, г. НЕАПОЛЬ
ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ДИЕТЫ НА ИММУННЫЙ
СТАТУС СОБАК, ЕСТЕСТВЕННО ИНФИЦИРОВАННЫХ LEISHMANIA
INFANTUM
Laura Cortese a, Mariangela Annunziatella b, Diego Piantedosi a, Anna Teresa Palatucci b, Valentina Rubino b, Valentina Foglia
Manzillo a , Jacopo Guccione a, Giuseppina Ruggiero b, Gaetano Oliva a.
ᵃ Факультет Ветеринарной Медицины и Технологии Животноводства, Кафедра Внутренних Болезней, Университет Неаполя имени Фридриха II, улица Панзини, 5- 80131, Неаполь, Италия;
ᵇ Факультет Клеточной и Молекулярной Биологии и Патологии, Университет Неаполя имени Фридриха II, ул.Панзини, 5- 80131, Неаполь, Италия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ВВЕДЕНИЕ
Лейшманиоз собак — системное паразитарное заболевание,
эндемичное в странах Средиземноморья. Известно, что у собак
иммунная система играет ключевую роль в развитии и исходе
лейшманиозной инфекции. От иммунного статуса зависит также и
терапевтический ответ, который на сегодняшний день остается
недостаточно изученным. В регуляции иммунного ответа
задействовано несколько механизмов. Один из них обуславливает
антигенную активацию и дифференцировку Т-лимфоцитов, другой
- супрессию за счет регуляторных CD4+CD25+FoxP3+
субпопуляциий Т-клеток (Treg). Было показано, что
энергетический/метаболический статус способен значительно
изменять иммунный ответ и контроль иммунной толлерантности
как у человека, так и у животных. Более того, неправильное
питание является фактором риска в развитии висцерального
лейшманиоза. Цель данной работы — дать оценку воздействия
приема иммуномодулирующей диеты на иммунологический статус
собак, естественно инфицированных L.infantum.
Для исследования с согласия владельцев были отобраны сорок собак, естественно инфицированных
L.infantum (20 кобелей и 20 сук, возрастом 5-9 лет). Все животные обитали в регионе Кампания на юге
Италии. Двадцати собакам был назначен меглумин антимониат (50 мг/кг, подкожно, 2 раза в день, курс 1
месяц) в комбинации с иммуномодулирующей диетой, продолжительностью 6 месяцев (Группа I); другим
двадцати животным назначено лечение меглумином антимониатом (50 мг/кг, подкожно, 2 раза в день, курс
1 месяц) в сочетании с аллопуринолом (10 мг/кг, орально, 2 раза в день, курс 6 месяцев) и применением
стандартной диеты, продолжительностью 6 месяцев (Группа II). Клинический диагноз лейшманиоза
подтвердился обнаружением амастигот в лимфатических узлах или в аспирате костного мозга с помощью
непрямого метода флуоресцирующих антител (≥1:160) и ПЦР. Наличие других инфекций (Ehrlichia canis,
Anaplasma phagocytophilum, Babesia сanis, Dirofilaria immitis и др) было исключено у всех животных. В
качестве контрольной группы выступали двадцать клинически здоровых собак (отрицательный
серологический, паразитологический и молекулярный тесты). Анти-CD3, -CD4, -CD8, -CD45
моноклональные антитела и антитела для изотипического контроля были приобретены в Serotec Ltd,
Лондон, Великобритания. Для выявления внутриклеточного маркера FoxP3 применялись кроссреактивные мышиные FoxP3 антитела (клон FJK-16S, eBioscience, Сан Диего, Калифорния, США).
Обнаружение Т-клеточных субпопуляций CD8+ CD4+ проводилось с использованием комбинации собачих
анти-CD3 и анти-CD4 (или анти-CD8) моноклональных антител. Более того, мы оценивали содержание
провоспалительных иммунных Т-клеток: внутриклеточное окрашивание цитокинов с применением собачих
анти-IFN-γ и анти-IL-4 моноклональных антител или антител изотипического контроля (Serotec) с помощью
набора для фиксации/пермеабилизации (Caltag, Бурлингейм, Калифорния, США). Проточную цитометрию
и обработку данных мы производили с помощью аппарата FACScalibur и программы CellQuest analysis
software (Becton Dickinson, Маунтин-Вью, Калифорния, США). Статистический анализ осуществлялся с
помощью теста Манна-Уитни и рангового коэффициента корреляции Спирмена (GraphPad Prism, Сан
Диего, Калифорния, США). Результаты считались достоверными при р<0,05.
Здоровые
собаки
T0
Первичное
обследование
T3
T6
После 3-х
После 6-ти
месяцев лечения месяцев лечения
Рисунок 1- А и Б. Клинический статус до и после лечения (Группа I)
CD8+CD3+ group I
CD8+CD3+ group II
*
Рисунок 2- А и Б. Клинический статус до и после лечения (Группа II)
Результаты
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
Рисунок 3- А и Б. Оценка содержания CD8 T-лимфоцитов методами иммунофлюоресценции и проточной цитометрии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Наши предварительные наблюдения дают представление о том, как иммуномодулирующая диета
может повлиять на численность cубпопуляций эффекторных CD8+ T-клеток и регуляторных Тлимфоцитов, а также на секрецию провоспалительных цитокинов. В данном случае нашей диетой
удалось потенцировать фармакологическую терапию. Эти наблюдения подтверждают важную
роль CD8+ T-лимфоцитов в контроле внутриклеточных паразитов. В этом отношении, увеличение
содержания CD8+ T-клеток (в сочетании с умеренной поляризацией в сторону Th1-типа) может
быть связано с иммунным ответом на присутствие паразитов у нелеченных инфицированных
собак. Следует подчеркнуть, что существенное увеличение числа CD8+ T-лимфоцитов
отмечалось только после 6-ти месяцев лечения и только в комбинации с иммуномодулирующей
диетой (группа I). Спустя 3 и 6 месяцев после начала терапии (группа I), мы наблюдали
нормализацию количества Treg по отношению к значениям контрольной группы. Данный
результат вместе с уменьшением содержания TH1 клеток может быть связан, главным образом,
со снижением интенсивности провоспалительных эффектов в периферическим тканях. С
помощью нашей диеты удалось потенцировать фармакологический эффект. Следует заметить,
что количество CD8+ T-клеток остается на высоком уровне у животных обеих групп, и это может
свидетельствовать о их роли в контроле диссеминации хронической лейшманиозной инфекции.
Список литературы доступен по запросу от автора,
e-mail: lcortese@unina.it
80
Porto de Galinhas, Pernambuco (Brazil), 13-17 May 2013
T reg group II
T reg group I
10.0
10.0
7.5
7.5
*
*
В нашей работе мы сфокусировали свое внимание на Т-лимфоцитах. Как показано на рисунке 3А
и Б на момент первичного обследования у больных животных регистрировалось несколько
повышенное содержание CD8+CD3+ Т-лимфоцитов по сравнению со здоровыми собаками.
После 3-х и 6-ти месяцев лечения (фармакологическая терапия + иммуномодулирующая диета =
группа I, и исключительно фармакологическая терапия = группа II) содержание CD8+CD3+ Тлимфоцитов у животных обеих групп оставалось по-прежнему на высоком уровне в сравнении с
результатами контрольной группы. В этом отношении, стоит отметить, что у собак группы I
количество CD8+CD3+ Т-лимфоцитов значительно возросло после 6-ти месяцев терапии. Это
наблюдение подтверждается снижением соотношения CD4+CD8+ (данные здесь не показаны).
Линия тренда абсолютных чисел также подтвердила результаты наблюдения (данные здесь не
показаны).
Мы проанализировали уровень регуляторных Т-клеток (Treg) в группах инфицированных
L.infantum собак. Рисунки 4А и Б отображают сравнительный анализ между группами больных
животных (I и II группы) и группой контроля. Значительное сокращение числа Тreg
периферической крови при первичном обследовании регистрировалось у инфицированных собак
обеих групп, при этом существенное увеличение содержания Treg отмечалось у животных I
группы после 3-х и 6-ти месяцев терапии, близкое по значению к результатам от собак
контрольной группы.
Для того, чтобы определить, если изучаемый нами иммунологический профиль связан со
специфичным цитокиновым профилем в Т-лимфоцитах, мы проанализировали продукцию IFN-γ и
IL-4 Т-лимфоцитами у животных обеих групп. Как показано на рисунках 5А и Б, во время
первичного обследования у больных животных установлен слегка повышенный уровень
содержания Th1 T-клеток (ответственных за секрецию IFN-γ, и не за IL-4) по сравнению с
результатами контрольной группы, но после 6-ти месяцев лечения отмечалось значительное
увеличение содержания Th1 T-клеток только у собак I группы (рисунок 5А). Интересно, что
продукция IL-4 CD4+ Т-лимфоцитами сократилась после 6-ти месяцев терапии только в I группе
(рисунок 6А).
80
*
*
5.0
5.0
2.5
2.5
0.0
0.0
Рисунок 4- А и Б. Оценка содержания Treg методами иммунофлюоресценции и проточной цитометрии.
Th1 group II
Th1 group I
*
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Рисунок 5- А и Б. Оценка содержания Th1 клеток методами иммунофлюоресценции и проточной цитометрии.
Th2 group II
Th2 group I
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
Рисунок 6- А и Б. Оценка содержания Th2 клеток методами иммунофлюоресценции и проточной цитометрии.