УДК 612.94.017.1-053.1.083 РОЛЬ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ-2, -4 И -7 В ФОРМИРОВАНИИ ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АПОПТОЗУ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ И.Е. Лебедева, И.Е. Рубцова, М.Ф. Никонова, Е.А. Грачева, О.Н. Бабайкина, В.Ю Талаев Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной В данной работе исследовались некоторые механизмы усиления апоптоза Т-клеток новорожденных. Показано, что интерлейкины-2, -4 и -7 уменьшают долю вступивших в апоптоз клеток в культурах с активированными Т-лимфоцитами практически всех обследованных, а ингибитор продукции интерлейкинов — дексаметазон усиливает апоптоз только у детей с высокими исходными значениями апоптоза в культурах. Полученные данные свидетельствуют о том, что дефицит ИЛ-2, -4 и -7 может участвовать в усилении апоптоза лимфоцитов новорожденных, но не является единственным фактором, определяющим чувствительность лимфоцитов к апоптозу. Ранее нами было показано, что мононуклеарные клетки пуповинной крови (МНПК) части новорожденных отвечают на активацию входящих в их состав Тлимфоцитов массовой гибелью Т-клеток, сопровождающейся характерными для апоптоза изменениями (Талаев и др., 1997). Одной из возможных причин массовой гибели Т-клеток пуповинной крови при активации может быть дефицит продукции интерлейкинов (ИЛ), обеспечивающих выживание и пролиферацию активированных Т-лимфоцитов (Amos et al., 1998; Mondino, Khoruts, Jenkins, 1996; Soares, 1998). В данной работе исследовалось влияние интерлейкина-2 (ИЛ-2), ИЛ-4 и ИЛ-7, на пролиферацию и апоптоз лимфоцитов новорожденных. Слабый пролиферативный ответ Т-клеток на активацию и повышенная чувствительность лимфоцитов к апоптозу чаще наблюдается у детей, рожденных матерями с патологически развивавшейся беременностью (Талаев, Лебедева, Талаева, 1999). В связи с этим группа обследованных формировалась по наличию у матерей новорожденных следующих патологий и отклонений во время беременности: недоношенность; наличие в анамнезе выкидышей, мертворождений и преждевременных родов и угроза прерывания данной беременности, потребовавшая стационарного лечения; хронический и гестационный пиелонефрит; вирусные инфекции в ходе беременности; анемия 2 и 3 степени; сочетанные гестозы. Объектом исследования являлись МНПК 55 новорожденных. Обследованные дети имели срок внутриутробного развития от 27 до 40 недель. Масса новорожденных была от 980 г до 4350 г. В качестве активатора Т-лимфоцитов использовали очищенные моноклональные антитела (МКА) ИКО-90 к молекуле CD3 (Медбиоспектр, Москва). В работе использовались рекомбинантные человеческие ИЛ-2, -4 и -7 в конечных концен30 трациях 5, 5, и 10 нг/мл, соответственно (Sigma, USA). В качестве агента, подавляющего продукцию цитокинов, использовали натриевую соль фосфата дексаметазона (KRKA, Slovenia) в концентрации 0.4 мкг/мл. Пролиферацию клеток в культурах МНПК оценивали по включению меченного тритием метилтимидина. Результаты выражали в индексах стимуляции пролиферации (ИС — отношение среднего значения пролиферации в импульсах в мин. в опытных и контрольных культурах). Апоптоз оценивали по гиподиплоидной фракции клеток с помощью проточной цитофлюориметрии окрашенных иодидом пропидиума клеток. 18 ИС 16 14 12 10 8 6 4 2 0 контроль МКА к CD 3 IL-2 IL-2 + МКА к CD3 IL-4 IL-4 + МКA к CD3 IL-7 IL-7 + МКA к CD 3 Рис. Влияние дексаметазона на пролиферативный ответ Т-клеток пуповинной крови на активацию антителами к молекуле CD3 (1 мкг/мл), ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-7. По оси ординат – ИС. Серые столбики – пролиферация клеток без дексаметазона, черные столбики – с дексаметазоном (0.4 мкг/мл) Обследованные дети были разделены на две группы по доле клеток в апоптозе при активации Т-лимфоцитов антителами к CD3 в концентрации 1 мкг/мл. В первую группу вошли дети (N=25) с низким уровнем апоптоза в культурах МНПК к 48 часам культивирования. Доля гиподиплоидных клеток в культурах МНПК этих детей была не более 20%, то есть не превышала средней концентрации гиподиплоидных клеток у 10 обследованных нами взрослых здоровых доноров 31 (21.8+3.8%). Во вторую группу вошли дети (N=30) с долей гиподиплоидных клеток в культурах более 20%. Добавление ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-7 в культуры МНПК детей группы 2 вызывало достоверное уменьшение размеров гиподиплоидной фракции клеток в культурах с Т-лимфоцитами, активированными антителами к CD3 (табл. 1). Кроме того, ИЛ-4 уменьшал долю клеток в апоптозе в культурах неактивированных МНПК детей группы 2. У детей группы 1 добавление ИЛ-2, -4 и -7 в культуры МНПК вызывало небольшое, но статистически достоверное уменьшение доли клеток в апоптозе. Следует отметить, что вызванное интерлейкинами уменьшение гиподиплоидной фракции МНПК у обследованных детей носило практически обязательный характер. Уменьшение этого показателя под действием ИЛ-2 наблюдалось у 77.5% детей в культурах с не активированными Т-лимфоцитами и у 95% детей в активированных культурах. Под действием ИЛ-4 доля клеток в апоптозе уменьшалась у 89.7% детей в не активированных культурах, и у 846% детей — в активированных культурах, а под действием ИЛ-7 — у 66.7% и у 83.3% детей, соответственно. Таблица 1 Влияние ИЛ-2, -4 и -7 на размер гиподиплоидной фракции МНПК новорожденных Интерлейкины Без ИЛ ИЛ-2 (5 нг/мл) ИЛ-4 (5 нг/мл) Без ИЛ (для теста с ИЛ-7) ИЛ-7 (10 нг/мл) Доля гиподиплоидных клеток, % Группа 1 Группа 2 МКА к CD3 МКА к CD3 Без МКА к CD3 Без МКА к CD3 (1 мкг/мл) (1 мкг/мл) 11.72+0.87 13.33+0.81 33.59+3.80 37.27+3.76 9.67+0.85 9.46+078 ** 28.07+3.35 27.65+3.34 * 7.78+0.64 ** 10.10+0.74 ** 23.73+3.76 * 26.99+3.63 * 10.11+1.07 12.0+1.0 36.82+6.84 41.87+6.05 8.15+0.93 * 8.47+0.87 ** 30.98+5.77 * 32.98+5.97 * Данные представлены в виде М+m. * Уменьшение гиподиплоидной фракции МНПК под действием ИЛ достоверно при р < 0.05. ** При р < 0.005. У всех детей группы 2 добавление дексаметазона вызывало увеличение гиподиплоидной фракции МНПК, активированных антителами к CD3 в концентрации 1 мкг/мл (табл. 2). Добавление ИЛ-2 или ИЛ-4 в культуры МНПК с антителами к CD3 и дексаметазоном уменьшало долю клеток в апоптозе до уровня, определяемого в культурах без дексаметазона. В активированных и неактивированных культурах МНПК детей группы 1 дексаметазон не вызвал статистически достоверных изменений доли клеток в апоптозе. Влияние дексаметазона на пролиферацию МНПК было оценено у 11 детей группы 1 и 8 детей группы 2, при этом различий в действии дексаметазона на пролиферацию между этими группами обнаружено не было. Средние значения ИС всех 19 обследованных приведены на рис. Дексаметазон полностью отменял пролиферативный ответ Т-клеток на активацию антителами к CD3, подавлял пролиферацию не активированных МНПК в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-4. Введение ИЛ-2 в культуры с активированными Т-клетками и 32 Таблица 2 Влияние дексаметазона на размер гиподиплоидной фракции МНПК новорожденных Группы Группа 1 Группа 2 МКА к CD3, мкг/мл 0 1.0 0 1.0 Дексаметазон, мкг/мл 0 0.4 0 0.4 0 0.4 0 0.4 Доля гиподиплоидных клеток (%) при добавлении: без интерлейкинов 9.0+1.2 10.50+1.2 11.13+1.42 12.42+1.72 25.76+4.45 27.67+6.46 28.61+2.78** 37.95+2.92** ИЛ-2 (5 нг/мл) 7.25+1.51 7.5+1.14 7.67+1.0 8.27+0.95 24.23+3.58 25.44+3.15 25.73+3.32 25.44+3.15 ИЛ-4 (5 нг/мл) 5.31+0.79** 7.82+0.91** 7.14+0.9 8.45+1.54 17.3+1.58** 26.61+3.2** 23.95+2.72 26.61+3.2 ИЛ-7 (10 нг/мл) 7.21+1.58 8.77+1.88 7.82+1.5 9.36+1.93 24.51+3.82 30.36+2.69 22.97+3.85* 33.32+4.91* Данные представлены в виде М+m. * Увеличение гиподиплоидной фракции МНПК под действием дексаметазона достоверно при р < 0.05. ** При р < 0.02. дексаметазоном лишь частично восстанавливает пролиферацию. Добавление в культуры активированных и неактивированных МНПК рекомбинантного ИЛ-7 полностью отменяло ингибирующее действие дексаметазона на пролиферацию. Более того, дексаметазон увеличивал пролиферативный ответ МНПК, активированными антителами к CD3 и ИЛ-7. Различия средних значений пролиферации были недостоверны, однако анализ индивидуальных результатов оценки пролиферации показал, что дексаметазон вызывал достоверное усиление пролиферации культур с активированными Т-клетками у 31.6% детей. Такое неожиданное «ростовое» действие дексаметазона, по-видимому, объясняется следующим образом: во-первых, ИЛ-7 является наиболее эффективным фактором роста Т-клеток новорожденных, заменяющим другие факторы роста, продукция которых подавляется дексаметазоном, во-вторых, дексаметазон, наряду с цитокинами, стимулирующими рост Т-клеток, подавляет продукцию супрессорных факторов Т-лимфоцитами или другими входящими в состав МНПК клетками. Это предположение подтверждается литературными данными: дексаметазон, в использованной нами концентрации, подавляет продукцию γ-интерферона и факторов некроза опухоли — цитокинов, способных подавлять пролиферацию Т-клеток, а ИЛ-7, в отличие от ИЛ-2, поддерживает жизнеспособность и пролиферацию неактивированных наивных Т-клеток пуповинной крови и максимально усиливает пролиферацию активированных антигеном наивных Т-лимфоцитов новорожденных (Amos, 1998, Soares et al., 1998, Webb, Foxwell, Feldmann, 1999). Такая потребность Т-клеток в пуповинной крови новорожденных в ИЛ-7 роднит их с тимоцитами, ключевую роль в развитии которых также играет ИЛ-7 (Grabstein, 1993). Таким образом, показано, что добавление ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-7 уменьшало долю вступивших в апоптоз клеток в культурах МНПК с активированными Т-клетками практически всех обследованных новорожденных. Дексаметазон увеличивал долю вступивших в апоптоз клеток в культурах МНПК с активированными Т33 лимфоцитами у детей с высокими значениями апоптоза в культурах и не влиял на апоптоз МНПК с низким исходным уровнем апоптоза в культурах. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что дефицит ИЛ-2, -4 и -7 может участвовать в усилении апоптоза в культурах МНПК новорожденных, однако не является единственным фактором, определяющим чувствительность лимфоцитов новорожденных к программированной гибели. Работа поддержана РФФИ — проект 98-04-48134. ЛИТЕРАТУРА Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Мазепа В.Н., Талаева Е.Б. Индуцированный активацией апоптоз лимфоцитов крови новорожденных. Зависимость характера ответа от клинического состояния новорожденных // Иммунология, 1997. № 1. С. 47–50. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Талаева Е.Б. Связь патологии беременности с характером ответа на активацию Т-лимфоцитов пуповинной крови новорожденных // Педиатрия, 1999. № 5. С. 110–111. Amos C.L., Woetmann A., Nielsen M., et al. The role of caspase 3 еnd Bcl-xL in the action of interleukin 7 (IL-7): a survival factor in activated human T cells // Cytokine. 1998. V. 10(9). P. 662–668. Grabstein K.H., Waldshmidt T.J., Finkelman F.D. et al. Inhibition of murine B and T lymphopoiesis in vivo by an anti-interleukin 7 monoclonal antibody // J. Exp. Med. 1993. V. 178. P. 257–264. Mondino A., Khoruts A., Jenkins M.K. The anatomy of T-cell activation and tolerance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 2245–2252. Soares M.V., Borthwick N.J., Maini M.K., et al. IL-7-dependent extrathymic expansion of CD45RA+ T cells enablеs preservation of a naive repertoire // J. Immunol. 1998. V. 161(11). P. 5909–5917. Webb L.M, Foxwell B.M, Feldmann M. Putative role for interleukin-7 in the maintenance of the recirculating naive CD4+ T-cell pool. // Immunology. 1999. V. 98 (3). P. 400–405. 34